KR20150023899A - 항콕시듐 활성을 갖는 식물 부분 및 추출물 - Google Patents
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Abstract
갈산, 갈산의 유도체, 갈로타닌 및 가수분해성 타닌과 같은 화합물을 함유하는 큐어커스 인펙토리아, 루스 키넨시스 및 터미날리아 케불라로 구성된 군으로부터 선택된 천연 식물 부분 및 식물의 추출물은 가금류에서 콕시듐증 및 더욱 특히, 아이메리아 spp.에 의해 초래된 콕시듐증을 제어하는 것으로 밝혀졌다. 식물 부분 및 식물 추출물은 병변 스코어, 배설물 그램 당 오시스트 및 폐사의 감소를 유도한다.
Description
본 출원은 2012년 6월 27일 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 61/664,795 및 2013년 1월 23일 출원된 인도 출원 번호 177/DEL/2013의 우선권을 주장하며, 이 둘 모두는 본원에 참조로서 통합된다.
본 발명은 일반적으로 콕시듐증의 제어, 및 더욱 구체적으로, 가금류 및 기타 동물에서 콕시듐증 제어를 위한 식물 부분, 식물 추출물 및 화합물의 적용에 관한 것이다.
콕시듐증은 가금류 산업에서 주요 질환이며, 최근 조사에 따르면, 매년 $ 30억 USD 넘게 세계적으로 영향을 끼치는 것으로 추정된다 worldpoultry.net/Broilers/Health/2009/9/In-ovo-vaccination-against-coccidiosis-WP006949W/ - accessed June 18, 2013). 콕시듐증은 첨복포자충문 (phylum Apicomplexa)에 속하는 원생동물 기생충 즉, 아이메리아 (Eimeria) 및 아이메리아과에 의해 초래된다 (Clare, R. A and Danforth, H. D (1989). Major histocompatibility complex control of immunity elicited by genetically engineered Eimeria tenella (Apicomplexa) antigen in chickens. Infection and immunity, 57 (3): 701 - 705). 기생충은 소화관 세포에 침입하여 창자 괴사를 초래하며 이는 흡수장애, 설사, 이환상태, 체중 증가의 감소, 불량한 사료 전환, 및 심각한 경우, 폐사로 이어진다 (Williams, R.B (2005). Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens: Rational, integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian Pathology, 34(3), 159-180). 아이메리아중 7개의 상이한 종 즉, E. 아세르불리나 (E. acervulina ), E. 브루네티 (E. brunetti), E. 막시마 (E. maxima), E. 미티스 (E. mitis), E. 네카트릭스 (E. necatrix), E. 프래콕스 (E. praecox), 및 E. 테넬라 (E. tenella)는 가금류에서 콕시듐증을 초래하는 것으로 공지되어 있으며 (Williams, 2005), 이들 종은 고도로 숙주 및 부위 특이적이다. E. 테넬라는 가금류에서 콕시듐증을 초래하는 주요 종중 하나이며, 이들의 감염 부위는 맹장이다 (Khazandi, M and Tivey , D (2010). Developing an in vitro method for Eimeria tenella attachment to its preferred and non-preferred intestinal sites. Experimental Parasitology, 125 (2), 137-140). 콕시듐증은 현재 약물처치에 의해 제어되지만, 아이메리아의 약물-내성 균주의 출현 증가로 인해 대안적인 제어 전략의 개발이 필요하다. 식물은 페놀 화합물의 존재로 인해 항기생충 및 항콕시듐 활성을 갖는 것으로 공지되어 있기 때문에 (Tipu, M.A., Akhtar, M.S., Anjum, M.I and Raja, M. L (2006). New dimension of medicinal plants as animal feed. Pakistan vet. J., 26(3): 144-148), 이들은 가금류에서 콕시듐증에 대한 생활성 분자의 잠재적인 공급원이 될 수 있다.
다른 연구자들은 콕시듐증 치료에서 식물 부분 또는 식물 추출물의 사용을 시도하였다. 예를 들어, 맥캔 (McCann) 등은 생 콕시듐 백신으로 접종한 육계의 수행능에 대한 밤나무 타닌의 효과를 시험하였다 (M.E.E. McCann, E. Newell, C. Preston and K. Forbes. The Use of Mannan-Oligosaccharides and/or Tannin in Broiler Diets. Intl. J. of Poultry Sci. 5 (9): 873-879, 2006). 이들은, 만난-올리고사카라이드 또는 타닌의 개별적 또는 조합적인 보충이 콕시듐증의 영향을 감소시키지 못하였음을 보고하였다.
왕 (Wang) 등은 콕시듐증에 대한 포도씨 프로안토시아니딘 추출물의 용도에 대해 교시한다 (Wang, et al. Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract in Broiler Chickens: Effect on Chicken Coccidiosis and Antioxidant Status. Poultry Science. 87:2273-2280, 2008). 이들은 활성이 가수분해성 타닌보다는 프로안토시아니딘 즉, 응축된 타닌의 항-염증 및 항산화제 특성에 따른 결과로 보고있다.
나이두 (Naidoo) 등은 항산화제 활성을 기반으로 하여 선택된 4개 식물을 이용한 생체내 연구를 교시한다 (Naidoo et al. The value of plant extracts with antioxidant activity in attenuating coccidiosis in broiler chickens. Veterinary Parasitology. 153:214-219; 2008). 이들은 식물중 하나 (툴바기아 비오올라세아 (Tulbaghia violacea))가 닭 배설물에서 아이메리아 오시스트 계수 (Eimeria oocyst count)를 감소시켰음을 관찰하였으며, 이들은 이러한 효과가 항산화제 화합물 S (메틸티오메틸) 시스테인 설폭시드로 인한 것일 수 있음을 추측한다.
맥도글라드 (McDougald) 등은 육계에서 콕시듐증에 대한 내성을 향상시키는 무스카딘 포메이스 (muscadine pomace)의 용도를 기술한다 (McDougald et al. Enhancement of Resistance to Coccidiosis and Necrotic Enteritis in Broiler Chickens by Dietary Muscadine Pomace. Avian Diseases. 52: 646-651; 2008). 무스카딘 포메이스는 와인 생성에 사용된 포도의 부산물이다. 이들은 포메이스중 임의의 특정 화합물의 효능에 대해서는 언급하지 않았다. 제안된 항-콕시듐 활성은 왕 등 및 나이두 등에 의해 제안된 활성과 현저하게 상이하다.
본 발명의 요약
본 발명은 동물 특히, 가금류에서 콕시듐증 제어에 효과적인 식물 부분 및 식물 추출물의 식별 및 용도로 이루어진다. 특히, 큐어커스 인펙토리아 (Quercus infectoria), 루스 키넨시스 (Rhus chinensis) 몰식자, 터미날리아 케불라 (Terminalia chebula) 열매의 식물 부분 및 천연 추출물은 가금류에서 콕시듐증, 및 특히, 아이메리아 spp.에 의해 초래된 콕시듐증을 제어하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 특히, 식물 부분 또는 추출물은 유효량의 갈산, 갈로타닌 및 가수분해성 타닌으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 함유한다.
루스 키넨시스, 큐어커스 인펙토리아의 몰식자 및 터미날리아 케불라의 열매의 식물 부분 및 천연 추출물은 병변 스코어 (lesion score), 배설물 그램 당 오시스트 및 폐사율의 감소를 유도한다. 이러한 식물 부분/추출물은 또한, 시험관내 MTT 검정에서 관찰된 바와 같이, 아이메리아의 포자소체에 대한 직접적인 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 갈산, 갈로타닌 및 가수분해성 타닌으로부터 선택된 화합물이 또한, 병변 스코어, 배설물 그램 당 오시스트 및 폐사의 감소를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 화합물은 또한, 시험관내 MTT 검정에서 관찰된 바와 같이, 아이메리아의 포자소체에 대한 직접적인 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 또한, 유효량의, 루스 키넨시스, 큐어커스 인펙토리아의 몰식자, 터미날리아 케불라 열매 및/또는 화합물 예컨대, 갈산, 갈로타닌 및 가수분해성 타닌을 함유하는 식물 부분 또는 식물의 추출물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 가금류 및 기타 동물에서 콕시듐증을 제어하는 방법으로 구성된다.
도 1은 큐어커스 인펙토리아로 처리된 조류의 맹장 병변의 이미지이다.
도 2는 감염 후 7일째에 큐어커스 인펙토리아로 처리된 조류의 배설물 그램 당 오시스트 (OPG)의 차트이며; 다양한 첨자를 갖는 컬럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 3은 큐어커스 인펙토리아로 처리된 조류의 맹장의 H 및 E 염색된 절편의 현미경사진 이미지이다.
도 4는 감염 후 5일째에 Q. 인펙토리아 수추출물로 처리된 조류에서 E. 아세르불리나, E. 막시마 및 E. 테넬라에 대한 병변 스코어의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 5는 감염 후 7일째에 Q. 인펙토리아 수추출물로 처리된 조류의 배설물 그램 당 오시스트 (OPG)의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 6은 양성 대조군으로서 항콕시듐제 (coccidiostat)와 함께 다양한 투여 수준의 Q. 인펙토리아의 평가를 수행한 MTT 검정의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 7은 포자소체 및 다양한 농도의 Q. 인펙토리아로의 MDBK 숙주 세포 침습 후 PCR 결과의 차트이다.
도 8은 1회 처리내에서 T4 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 9는 다양한 농도의 Q. 인펙토리아로 사전 처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습 후 PCR 결과의 차트이다.
도 10은 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 11은 Q. 인펙토리아의 다양한 분획의 항-포자소체 활성의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 12는 Q. 인펙토리아의 물 분획의 고성능 액체 크로마토그램 (HPLC) 크로마토그램이다.
도 13은 Q. 인펙토리아의 4개 주요 피크의 항-포자소체 활성의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 14는 Q. 인펙토리아의 피크 1의 LC/MS/MS 크로마토그램이다.
도 15는 Q. 인펙토리아의 항-포자소체 활성과 갈산의 농도 사이의 상관관계를 나타낸 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 16은 10 ppm 갈산으로 사전-처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습의 PCR 결과 차트이다.
도 17은 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 18은 다양한 농도의 갈산으로 사전-처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습후 PCR 결과 차트이다.
도 19는 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 20은 다양한 농도의 갈산으로 처리된 조류의 감염 후 5일째의 병변 스코어 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 21은 다양한 농도의 갈산으로 처리된 조류의 감염 후 7일째의 OPG 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 22는 루스 키넨시스 및 터미날리아 케불라의 항-포자소체 활성의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 23은 다양한 농도의 T. 케불라로 사전-처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습후 PCR 결과 차트이다.
도 24는 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 25는 R. 키넨시스 및 T. 케불라로 처리된 조류의 감염 후 5일째의 병변 스코어 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 26은 R. 키넨시스 및 T. 케불라로 처리된 조류의 감염 후 7일째의 OPG 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 2는 감염 후 7일째에 큐어커스 인펙토리아로 처리된 조류의 배설물 그램 당 오시스트 (OPG)의 차트이며; 다양한 첨자를 갖는 컬럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 3은 큐어커스 인펙토리아로 처리된 조류의 맹장의 H 및 E 염색된 절편의 현미경사진 이미지이다.
도 4는 감염 후 5일째에 Q. 인펙토리아 수추출물로 처리된 조류에서 E. 아세르불리나, E. 막시마 및 E. 테넬라에 대한 병변 스코어의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 5는 감염 후 7일째에 Q. 인펙토리아 수추출물로 처리된 조류의 배설물 그램 당 오시스트 (OPG)의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 6은 양성 대조군으로서 항콕시듐제 (coccidiostat)와 함께 다양한 투여 수준의 Q. 인펙토리아의 평가를 수행한 MTT 검정의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 7은 포자소체 및 다양한 농도의 Q. 인펙토리아로의 MDBK 숙주 세포 침습 후 PCR 결과의 차트이다.
도 8은 1회 처리내에서 T4 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 9는 다양한 농도의 Q. 인펙토리아로 사전 처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습 후 PCR 결과의 차트이다.
도 10은 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 11은 Q. 인펙토리아의 다양한 분획의 항-포자소체 활성의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 12는 Q. 인펙토리아의 물 분획의 고성능 액체 크로마토그램 (HPLC) 크로마토그램이다.
도 13은 Q. 인펙토리아의 4개 주요 피크의 항-포자소체 활성의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 14는 Q. 인펙토리아의 피크 1의 LC/MS/MS 크로마토그램이다.
도 15는 Q. 인펙토리아의 항-포자소체 활성과 갈산의 농도 사이의 상관관계를 나타낸 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 16은 10 ppm 갈산으로 사전-처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습의 PCR 결과 차트이다.
도 17은 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 18은 다양한 농도의 갈산으로 사전-처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습후 PCR 결과 차트이다.
도 19는 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 20은 다양한 농도의 갈산으로 처리된 조류의 감염 후 5일째의 병변 스코어 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 21은 다양한 농도의 갈산으로 처리된 조류의 감염 후 7일째의 OPG 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 22는 루스 키넨시스 및 터미날리아 케불라의 항-포자소체 활성의 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 23은 다양한 농도의 T. 케불라로 사전-처리된 MDBK 숙주 세포의 포자소체로의 침습후 PCR 결과 차트이다.
도 24는 1회 처리내에서 T20 대비 다양한 시점에 대한 아이메리아 DNA의 배수 변화 차트이다.
도 25는 R. 키넨시스 및 T. 케불라로 처리된 조류의 감염 후 5일째의 병변 스코어 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
도 26은 R. 키넨시스 및 T. 케불라로 처리된 조류의 감염 후 7일째의 OPG 차트이다; 다양한 첨자를 갖는 칼럼은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
콕시듐증 제어에서 100g/ton 사료 용량의 Q. 인펙토리아 몰식자 미정제 분말 (100-800 마이크론 입자 크기, Pooja Herbs(Mumbai, India)로부터 입수)의 예비 생체내 평가는 유망한 결과를 일부 나타냈으며, 이는 더 높은 용량으로의 추가 평가를 촉구한다. 아이메리아 테넬라의 오시스트로 자극한 육계에서 수행된 35일 생체내 실험은, Q. 인펙토리아 몰식자가 양성 대조군 (0%)에 필적한 것으로서 병변 스코어를 0으로 그리고, 폐사율을 0%로 감소시켰음을 보여준 반면, 음성 대조군은 스코어 4 및 폐사율 17%를 보여주었다. 맹장 샘플의 조직병리학적 분석은 Q. 인펙토리아로 처리된 조류가 기생충 감염된 더 작은 영역, 더 낮은 단핵 침윤 및 맹장 출혈을 나타냄을 보여주었다.
일반적으로 이러한 설명에서, 식물 부분, 추출물 또는 화합물은, 비처리된 감염 대조군 대비 조류의 병변 스코어, 배설물에서 오시스트 쉐드 (oocyst shed) (그램 당 오시스트 (OPG)) 또는 폐사율에서의 통계학적으로 현저한 감소를 유도할 수 있는 경우 효과적인 것으로 칭해진다. 일반적으로, 갈산 및 갈산 함유 포뮬레이션의 투여는 사료 또는 물을 통해 0.1 내지 50ppm, 바람직하게는, 2 내지 20ppm, 및 가장 바람직하게는, 3 내지 10ppm의 투여량을 제공하는 포뮬레이션 또는 다른 경로를 통한 등가의 보충물로 기술된다. 기술된 식물, 식물 부분 및/또는 추출물은 약 최소 0.1% 갈산을 함유한다.
육계에서 아이메리아의 혼합 감염 제어에서 Q. 인펙토리아 미정제 분말의 효능을 평가하였다. 결과는 감염된 대조군 및 심지어 양성 대조군 살리노마이신 (Salinomycin) 대비 E. 테넬라 및 E. 아세르불리나에 대한 병변 스코어가 현저하게 감소되었음을 보여주었다. 한편 E. 막시마의 경우, 감염 대조군 및 살리노마이신 대비 병변 스코어에서 수치적 감소가 관찰되었다. 처리된 군의 그램 당 오시스트는 감염 대조군 및 살리노마이신 군보다 현저하게 더 낮았으며, 감염 군을 포함하여 처리군 어디에서도 폐사는 관찰되지 않았다. 이는 또한, 그 밖의 아이메리아 종에 의해 초래된 콕시듐증 제어에서 Q. 인펙토리아의 효능을 입증한다. 추가로, Q. 인펙토리다의 작용 모드를 측정하기 위해, 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 환원 검정을 기반으로 하는 시험관내 방법이 포자소체의 생존력의 측정치로서 식물 추출물의 항-포자소체 활성을 평가하도록 개발되었다. 아이메리아 테넬라의 포자소체에 대한 Q. 인펙토리아 몰식자의 연구는 포자소체 대조군 대비 포자소체 생존력의 현저한 감소를 보여주었다. 용량 의존적 효능이 Q. 인펙토리아의 다양한 투여량으로 수행된 연구에서 관찰되었으며, 결과는 독립적으로 수차례 실험을 수행함으로써 입증되었다. 따라서, Q. 인펙토리아의 직접적인 항-포자소체 활성은 생체내 콕시듐증 제어에서 추출물 효능에 기여하는 작용 모드중 하나일 수 있다.
유사하게는, 숙주 세포 및 아이메리아 기생충의 공동-배양을 기반으로 하는 시험관내 검정을 개발하여, 아이메리아 제어에서 Q. 인펙토리아 작용 모드를 숙주 세포주에서 측정하였다. 세포와 기생충을 검정시 양성 대조군 및 다양한 시험 생성물과 함께 조합한다. 아이메리아 기생충의 침습 및 증식은 실시간 PCR를 이용하여 아이메리아 DNA를 검출함으로써 측정된다. 이를 위해, 특정 프라이머를 선택하였으며, PCR 조건을 최적화시켰다. 양성 대조군 및 잠재적 항콕시듐 화합물을 세가지 상이한 방식의 시험관내 검정에 첨가한다:
생성물을 아이메리아 포자소체와 조합하고 숙주 세포에 첨가한다.
생성물을 특정 시간 동안 포자소체에 첨가하고, 이어서 제거하고, 후에 포자소체를 숙주 세포에 첨가한다.
생성물을 특정 시간 동안 숙주 세포에 첨가하고, 이어서 제거하고, 후에 포자소체를 숙주 세포에 첨가한다.
큐어커스 인펙토리아의 효과를 시험관내 검정에서 평가하였다.
실시예
1 -
맹장
콕시듐증
제어에서
큐어커스
인펙토리아의
효능
실험 시설 및 연구 설계. 인도의 굼미디푼디 (Gummidipundi)에 위치한 가금류 농장 시설에서 스크리닝 실험을 수행하였다. 성별 감별전 (straigt run)의 상용의 하이브리드 육계 즉, 갈루스 도메스티커스 (Gallus domesticus) (Var. Vencobb 400)를 본 연구에 사용하였다. 하루된 수컷 병아리를 입수하고, 개별적으로 체중을 측정하고, 식별표를 달고, 무작위로 군으로 나누었다. 실험 설계는 표 1에 상세히 기재되어 있다.
표 1. 연구 설계
| 카테고리 | 실험 변수 |
| 사육 타입 | 우리 |
| 실험 시작시 조류 일령 | 1일 |
| 조류의 총 수 | 56 |
| 군 수 | 8 |
| 조류 수/군 | 7 |
| 실험 기간 | 35일 |
농장 관리. 실험 동안 우수한 농장 관리 관례에 따랐다. 전체 농장 및 연구에 사용된 장치는 깨끗하며, 병아리 도착 전에 소독하였다. 조류를 콘크리트 바닥 위에 정리된 케이지에 수용하고, 배설물 샘플 수집을 용이하게 하기 위해 트레이를 케이지 바닥에 제공하였다. 농장의 온도 및 습도를 연속하여 모니터링하였다.
백신접종 스케줄. 조류를 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 및 전염성에프낭병 (IBD)에 대해 백신접종하였다.
사료 포뮬레이션. 곡식 콩 기재 매쉬 식이물을 포뮬레이션하였다. 사료 성분들을 Ponni feeds (Tamil Nadu, India)로부터 입수하였다. 연구 기간에 걸쳐 조류가 매쉬 사료를 자유식으로 섭취하게 하였다. 조류의 수명 단계에 따라 세 가지의 사료 포뮬레이션을 제조하였다; 초기 (1-10일), 전기 (11-20일) 및 후기 사료 (21-42일). 사료 포뮬레이션에 항생제 및 보충제를 사용하지 않았다.
처리군의 상세 내용. 군 및 처리는 표 2에 제시되어 있다. 처리된 조류가 1일부터 사료에 혼입된 식물 추출물을 섭취하게 하였다 (표 2). Q. 인펙토리아 몰식자의 미정제 분말을 Pooja herbs (Mumbai, India)로부터 입수하였다.
표 2. 처리 군 및 사료의 상세 내용
| 군 | 처리 |
| 대조군 1 (비감염된 대조군) | 일반 사료 |
| 대조군 2 (감염된 음성 대조군) | 콕시듐증 유도 + 일반 사료 |
| 대조군 3 (양성 대조군) | 콕시듐증 유도 + 1000 g/ton의 Coxistac*를 갖는 사료 |
| 처리 | 콕시듐증 유도 + 100g/ton의 Q. 인펙토리아를 갖는 사료 |
* Coxistac은 Pfizer의 제품으로서 12% 농도의 살리노마이신을 함유한다. 따라서, 언급된 용량 500 g/사료 1ton의 Coxistac 첨가는 육계에서 예방적 권장량인 사료중 60 ppm 수준의 살리노마이신의 전달을 가능하게 할 것이다. 본 실험에서의 용량은 권장량의 두배이다.
콕시듐증의 유도. E. 테넬라의 포자형성된 오시스트 (Houghton 균주 [Chapman, H.D. and Shirley, M.W. 2003. The Houghton strain of Eimeria tennella: A review of the type strain selected from genome sequencing. Avian Pathol., 32: 115-127] - 증식됨)를 1 x 105 오시스트/조류/일의 용량으로 경구 튜브식을 통해 14, 15 및 16일령의 각 조류에 경구 투여하였다. 접종일에 접종 전 2 h 부터 접종 후 2 h 까지 섭식을 중단하였다.
변수 분석. 분석을 위해 선택된 변수는 발병 지수 즉, 배설물 모양, 폐사률, 콕시듐증에 있어서 맹장의 병변 스코어링 (lesion scoring), 및 배설물 그램 당 오시스트 (OPG)이다. 방법은 하기 상세히 설명되어 있다.
배설물 조사. 조류의 배설물을 접종후 1일부터 10일까지 이의 일관성 (consistency), 혈흔, 점액, 분해되지 않은 사료, 및 주황 색상에 대해 매일 모니터링하였다. 배설물의 스코어링을 출혈 중증도를 기반으로 하여 수행하였다.
폐사율. 조류의 폐사율을 매일 기록하고, 폐사의 원인을 확인하기 위해 사후 분석을 수행하였다.
맹장의 병변 스코어링. 감염 후 5일 및 7일째에, 각 군으로부터의 2마리 조류를 경추파열법으로 희생시키고, 장을 절개 개방하였다. 조류의 맹장을 콕시듐증 병변에 대해 스코어링하였다. 스코어링을 맹장에서 병변의 중증도 및 혈흔을 기반으로 하여 수행하였다 (Johnson, J. K., and W. M. Reid. (1970). Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Experimental Parasitology 28:30-36). 맹장 콕시듐증의 스코어는 0-4 등급이었다.
배설물의 OPG. 조류 배설물의 삼중 샘플을 케이지 아래에 유지된 트레이로부터 무작위로 수집하고, 그램 당 오시스트를 평가하였다.
결과
발병 지수. 조류 배설물 관찰은, 감염 군의 출혈이 접종 후 4일째에 시작되었으며, 중증도는 5일째에 피크임을 보여주었다. 배설물 스코어링 결과는 표 3에 제공되어 있다. 감염 후 7일째에 배설물은 혈액 없이 정상으로 밝혀졌다. 5일째에 양성 대조군 (C3, 표 3)의 스코어는 음성 대조군 (C2, 표 3)의 4 대비 3이었다. Q. 인펙토리아로 처리된 조류는 더 낮은 스코어 2를 가졌으며, 이는 양성 대조군 보다 우수하였다.
표 3. 감염 후 5일째에서 배설물 스코어링
| 처리 | 스코어 | 설명 |
| C1-비처리된 대조군 | 0 | 배설물 정상적 일관성 |
| C2-음성 감염된 대조군 | 4 | 많이 보이는 혈액의 존재 |
| C3-양성 대조군 | 3 | 혈액 +++을 지닌 배설물 |
| T-Q.인펙토리아 100g/ton | 2 | 혈액 ++을 지닌 배설물 |
+ - 실혈 중증도 및 배설물중의 혈액의 양을 나타냄.
맹장의 병변 스코어링. 감염 후 5일 및 7일째에 맹장의 병변 스코어링은 병변이 5일째에 중증이며, 감염 후 7일째에는 조류가 회복되기 시작하였음 (이는 맹장 플러그의 형성을 나타냄)을 나타냈다. 이는 맹장으로부터 오시스트의 제거를 가능하게 하는 감염의 정상적 패턴을 뒤따른다. 병변 스코어의 결과는 양성 대조군 (살리노마이신 대조군)이 설명불가능한 이유로 인해 음성 대조군 대비 스코어에서 어떠한 차이도 나타내지 않았음을 보여주었다. Q. 인펙토리아로의 처리는 음성 대조군 대비 병변 스코어를 감소시켰다 (표 4). 감소된 병변 스코어는 감소된 배설물 스코어 및 폐사율의 부재와 관련되었다.
표 4. 감염 후 5일째에 맹장에서의 병변 스코어
| 처리 | 병변 스코어 |
| C1-비감염된 대조군 | 0 |
| C2-감염된 음성 대조군 | 3 |
| C3-양성 대조군 | 3 |
| T - Q. 인펙토리아 100g/ton | 2.5 |
감염 후 7일째에서 조류 배설물의 OPG. 감염 후 7일째에서 조류 배설물의 OPG 계수를 표 5에 나타냈다. 예상외로, 항콕시듐 살리노마이신 처리된 조류 (C3,표 5)는 C2 대비 오시스티 감소의 어떠한 표시도 나타내지 않았다 (표 5). 나타낸 값은 3회 반복된 것의 평균이다.
표 5. 감염 후 7일째에 배설물의 그램 당 오시스트
| 처리 | 배설물 그램 당 평균 오시스트 | CV |
| C2-감염된 음성 대조군 | 2.5E + 05 | 1.23 |
| C3-양성 대조군 | 4.0E + 05 | 0.68 |
| T-Q. 인펙토리아 100g/ton | 3.5E + 05 | 1.36 |
폐사. 폐사율은 대조군 2에서 17%였다 (감염된 음성 대조군). 다른 군에서는 폐사가 없었다. 양성 대조군의 병변 스코어 및 OPG 데이타는 음성 대조군의 것과 어떠한 차이도 나타내지 않았다.
양성 대조군이 본 실험에서 잘 수행되지 않았으나, Q. 인펙토리아의 식물 추출물로 처리된 조류의 병변 스코어는 감염된 음성 대조군보다 더 낮았으며, 이는 이들이 추가의 연구를 위한 후보물일 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이들은 OPG에서 감소를 보이지 않았다.
실시예
2 -
맹장
콕시듐증
제어에서
큐어커스
인펙토리아의
효능
아이메리아 테넬라로 자극된 육계에서 35일의 생체내 자극 실험을 수행하였다. 처리군은 1) 대조군 - 비감염된 정상 조류; 2) 음성 대조군 - E. 테넬라로 감염되고, 어떠한 항콕시듐증 화합물도 없는 일반 식이물이 섭십된 조류; 3) 양성 대조군 - 감염되고, 500g/ton의 권장 용량으로 Coxistac (항콕시듐제, 살리노마이신)을 함유하는 식이물 섭식된 조류 및 4) 500g/ton 용량의 Q. 인펙토리아 몰식자를 함유하는 식이물 투여된 감염 조류를 포함하는 처리군을 포함한다. 큐어커스 인펙토리아 몰식자의 미정제 분말이 보충된 처리군 및 양성 대조군에서 폐사는 관찰되지 않았다. 맹장 병변은 음성 대조군 조류가 평균 스코어 4로 고도로 감염된 반면, 양성 대조군은 스코어 0을 가짐을 나타냈다. 큐어커스 인펙토리아로 처리된 조류는 양성 대조군 (0)과 유사한 결과를 보여주었다. Q. 인펙토리아는 양성 대조군에 필적하는 OPG 계수 감소를 보여주었다. 맹장 샘플의 조직병리학적 분석은, Q. 인펙토리아로 처리된 조류가 아이메리아에 의해 침범된 더 작은 영역을 지니며, 출혈이 없으며, 점막으로의 최소 단핵 침윤을 나타냄을 보여주었다.
두 번째 생체내 실험은 하기 처리 군을 포함하였다.
표 6. 처리 군의 설명
| 군 | 처리 |
| 대조군 1 (C1) | 비감염된 대조군 - 항콕시듐제 없는 일반 사료 |
| 대조군 2 (C2) | 음성 대조군 - 콕시듐증 유도 + 항콕시듐제 없는 일반 사료 |
| 대조군 3 (C3) | 양성 대조군 - 콕시듐증 유도 + Coxistac 12% @ 500g/ton*을 지닌 일반 사료 |
| 처리 (T) | 콕시듐증 유도 + Q. 인펙토리아를 지닌 일반 사료 |
* Coxistac는 Pfizer의 제품으로서 12% 농도의 살리노마이신을 함유한다. 따라서, 언급된 용량 500 g/사료 1ton의 Coxistac 첨가는 육계에서 예방적 권장량인 사료중 60 ppm 수준의 살리노마이신의 전달을 가능하게 할 것이다.
결과
감염 후 5일째의 맹장 병변. 맹장 콕시듐증에 대한 병변 스코어링을 상기와 같이 스코어링 임계를 기준으로 하여 감염 후 5일째에 수행하였다. 스코어링 결과는, 양성 대조군이 감염된 음성 대조군 대비 맹장 콕시듐증 효과를 완전하게 완화시킴을 보여주었다. Q. 인펙토리아 처리된 조류는 맹장에서 병변이 나타나지 않았으며, 양성 대조군 및 비감염된 대조군 C1에 필적하였다 (표 7, 도 1).
표 7. 감염 후 5일째에서 병변 스코어링
| 처리 | 병변 스코어 |
| C1 - 비감염된 대조군 | 0e |
| C2 - 감염된 음성 대조군 | 4a |
| C3 - 양성 대조군 | 0e |
| T - Q. 인펙토리아 | 0e |
다양한 첨자를 갖는 열은 통계학적으로 유의하다 (p<0.05).
배설물 중 오시스트 계수. 배설물의 OPG는 감염 후 7일째에 추정하여 오시스트의 쉐딩 (shedding)을 평가하였다. 연구 결과, 양성 대조군, Q. 인펙토리아는 감염된 음성 대조군 대비 배설물 중 오시스트의 계수가 현저하게 낮았음을 보여주었다 (p<0.05). Q. 인펙토리아 처리는 양성 대조군과 동일하게 효과적이었다 (도 2). 이는 병변 스코어의 결과와 관련이 있다.
폐사. 폐사율을 실험 동안 기록하였으며, 데이타는 표 8에 제시하였다. 예측되는 바와 같이, 비감염된 대조군 (C1) 및 양성 대조군 (C3)에서는 폐사가 발생하지 않았다. Q. 인펙토리아 보충된 군은 폐사를 나타내지 않았다.
표 8. 실험 기간 동안의 폐사율
| 처리군 | 폐사율 ( % ) |
| C1 - 비감염된 대조군 | 0 |
| C2 - 감염된 음성 대조군 | 33.33 |
| C3 - 양성 대조군 | 0 |
| T - Q. 인펙토리아 | 0 |
맹장 샘플의 조직병리학적 분석 . Q. 인펙토리아는 모든 평가된 변수 예컨대, 병변 스코어, OPG 및 폐사율에서 양성 감소를 보여주었으며, 데이타는 양성 대조군 살리노마이신에 필적하였다. 따라서, 이러한 군으로부터의 조류 맹장 샘플의 조직병리학적 분석을 비감염된 대조군 (C1), 음성 대조군 (C2) 및 양성 대조군 (C3)과 비교하여 수행하였다. 맹장 병변의 중증도 및 분포는 표 9에 제공된 등급을 기반으로 하였다.
표 9. 다양한 군의 맹장 병변의 중증도 및 분포
| 조직병리학 | 비감염된 대조군 | 음성 대조군 | 양성 대조군 | 큐어커스 인펙토리아 |
| 단핵 세포 침윤 - 점막 | 0 | 3 | 2 | 1 |
| 단핵 세포 침윤 - 점막하 | 0 | 2 | 3 | 0 |
| 단핵 세포 침윤 - 근육층 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| 출혈 | 0 | 2 | 1 | 0 |
| 괴사 - 융모 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| 아이메리아의 스테이지 분포 | 0 | 3 | 1 | 1 |
표 10. 조류 맹장 조직의 조직병리학적 발견
| 군 | 조직병리학적 발견 |
| 비감염된 대조군 C1 | 일반적인 조직학적 제한내의 맹장 |
| 음성 대조군 C2 | 맹장은 점막, 점막하 및 근육 층에서 경증 내지 중등증의 단핵 세포 침윤 및 경증의 점막 출혈과 함께 중간 로드 (moderate load)의 다양한 아이메리아 스테이지 (오시스트, 쉬존트 (schizont) 및 메로조이트 (merozoite))를 나타내었다. |
| 양성 대조군 C3 | 맹장은 주요 로드 (major load)에 기여하는 쉬존트 및 메로조이트를 갖는 최소 로드 (minimal load)의 다양한 아이메리아 스테이지를 나타내었다. 최소 점막 출혈 및 괴사는 현미경으로 입증되었다. 점막 및 점막하 층에서 경증 내지 중등증 단핵 세포 침윤은 관찰되지 않았다. |
| Q. 인펙토리아 T | 맹장은 주요 로드에 기여하는 오시스트를 갖는 최소 로드의 다양한 아이메리아 스테이지를 나타내었다. 최소 점막 괴사 및 점막 층에서의 단핵 세포 침윤이 입증되었다. |
조직병리학적 결과는 Q. 인펙토리아로 처리된 조류가 E. 테넬라로 감염된 더 작은 맹장 부위를 가지며, 단핵 침윤은 단지 경증 침윤을 나타내는 스코어 1의 점막으로 제한되었음을 보여주었다 (도 3). 점막하 및 근육 층은 침윤이 발생하지 않았다 (표 10). 음성 대조군에서, 단핵 침윤은 점막, 점막하 및 심지어 근육 층에서도 관찰되었다. 음성 대조군 (2)의 것과 비교할 경우 Q. 인펙토리아로 처리된 조류의 맹장에는 출혈이 발생하지 않았다. 이는 Q. 인펙토리아로 처리된 조류의 맹장이 양성 대조군보다 덜 감염되었음을 나타낸다.
식물 추출물의 생체내 스크리닝은 큐어커스 인펙토리아가 E. 테넬라에 의해 초래된 유계에서의 맹장 콕시듐증을 제어하는 강력한 후보물질임을 드러냈다. 추출물의 효능은 병변 스코어, OPT 및 폐사율 감소에 있어서 양성 대조군의 것과 동등한 것으로 밝혀졌다.
실시예
3 -
콕시듐
증의
혼합 감염 제어에서
큐어커스
인펙토리아의
수추출
물의 효능
콕시듐증의 혼합 감염 제어에서 Q. 인펙토리아 미정제 분말의 효능을 육계에서 평가하였다. 35일 생체내 실험을 수행하였으며, 여기에서 조류는 E. 테넬라, E. 아세르불리나 및 E. 막시마 종의 오시스트 혼합 배양물의 야외주로 자극하였다. 오시스트의 혼합 배양물은 Tamil Nadu Veterinary Research Institute (Namakkal, India)의 기생충학 부서로부터 제공받았다. 오시스트 배양물은 임상 콕시듐증 감염에 걸린 조류의 배설물로부터 분리된 E. 테넬라, E. 아세르불리나 및 E. 막시마의 혼합물이다. 수득된 오시스트의 발병력을 육계에서 평가하였으며, 오시스트의 투여량은 E. 테넬라, E. 막시마 및 E. 아세르불리나의 모든 평가한 오시스트에 대해 3 초과의 스코어 병변을 유도하는 농도를 기초로 하여 최종적으로 5 X 105으로 하였다.
인도의 굼미디푼디에 위치한 Kemin's in-house R&D 가금류 농장 시설에서 스크리닝 실험을 수행하였다. 성별 감별전 상용의 하이브리드 육계 즉, 갈루스 도메스티커스 (Var. Vencobb 400)를 본 연구에 사용하였다. 하루된 수컷 병아리를 입수하고, 개별적으로 체중을 측정하고, 식별표를 달고, 무작위로 군으로 나누었다. 실험 설계는 표 11에 상세히 기재되어 있다. 3차 생체내 실험 동안 실시예 1에서 언급된 바와 같이 우수한 농장 관리 관례 및 백신접종 스케줄에 따랐다.
표 11. 연구 설계
| 카테고리 | 실험 변수 |
| 실험 기간 | 35일 |
| 품종 | Cobb 400 |
| 사육 타입 | 우리 |
| 실험 시작시 조류 일령 | 1일 |
| 총 조류 수 | 315 |
| 군 수 | 21 |
| 조류 수/군 | 15 (수컷) |
조류를 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 및 전염성에프낭병 (IBD)에 대해 백신접종하였다. 곡식 콩 기재 매쉬 식이물을 연구에 사용하였다. 조류가 1일부터 사료에 혼입된 Q. 인펙토리아 몰식자의 추출물을 섭취하게 하였다. 처리 군은 표 12에 제시되어 있다.
표 12. 실험을 위한 처리 군의 상세 내용
| 군 | 식이물 |
| 대조군 1 | 비감염 + 일반 사료 |
| 대조군 2 | 콕시듐증 유도 + 항콕시듐제를 갖지 않는 일반 사료 |
| 대조군 3 | 콕시듐증 유도 + Coxistac 12% 사전혼합물 (500g/ton)을 갖는 일반 사료 |
| 처리 | 콕시듐증 유도 + 100g/ton의 Q. 인펙토리아 수추출물을 갖는 일반 사료 |
Q. 인펙토리아의 몰식자 추출물을, 1:2 비로 미정제 분말 (100-800 마이크론 입자 크기)을 증류수에서 혼합한 후, 진탕시키면서 1시간 30분 동안 80 내지 90℃에서 추출함으로써 제조하였다. 추출물을 여과하고, 다시 잔류물을 유사한 방식으로 물에서 추출하였다. 이를 약 2회 더 반복하였으며, 전체 액체 추출물을 냉동 건조시켰다.
결과는, 감염된 대조군 및 심지어 양성 대조군 살리노마이신 대비 E. 테넬라 및 E. 아세르불리나의 병변 스코어의 현저한 감소가 있음을 보여주었다. 반면, E. 막시마의 경우, 병변 스코어에서의 수치적 감소가 감염된 대조군 및 살리노마이신 대비 관찰되었다 (도 4). 처리군의 그램 당 오시스트는 감염된 대조군 및 살리노마이신 군보다 현저하게 낮았으며 (도 5), 폐사율은 감염된 대조군을 포함하여 처리군 어느 것에서도 관찰되지 않았다. 이는 또한, 다른 종의 아이메리아에 의해 초래된 콕시듐증 제어에서의 Q. 인펙토리아의 효능을 입증한다.
실시예
4 -
MTT
검정에 의한 Q.
인펙토리아의
시험관내
항-
포자소체
활성
또한, 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 환원 검정을 기반으로 하는 시험관내 방법을 포자소체의 생존력의 척도로서 식물 추출물의 항-포자소체 활성을 평가하기 위해 개발하였다. 최적화된 방법은 포자소체의 준비, 멸균 및 정제에 이어서, 포자세포 현탁액 (최소 105 세포/ml)의 필요한 농도의 식물 추출물과의 인큐베이션을 포함하였다. 식물 샘플을, 미정제 분말을 공지된 용적의 증류수와 혼합하여 특정 ppm을 달성함으로써 준비하고, 2 min 동안 볼텍싱하고 0.2μ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 식물 추출물과의 24 h 인큐베이션 후, 포자소체를 완전하게 세척하고, 이어서 MTT 검정을 수행하였다. MTT-PMS 용액 (각각 0.2 밀리몰)을 2 h 동안 41℃에서 포자소체 현탁액과 인큐베이션하였다 (1:10 비). 인큐베이션 후, 내용물을 5 min 동안 800 g에서 원심분리하고, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 보라색 염료 포마진을 200 ul DMSO에 용해시키고, 흡광도를 630 nm 기준 파장에 대하여 530 nm에서 측정하였다.
양성 대조군으로서의 Coccidiostac (살리노마이신)과 함께 다양한 투여량 수준의 Q. 인펙토리아를 평가하기 위해 MTT 검정은 수행하였다 (도 6). 대조군과 비교할 경우 Q. 인펙토리아 처리된 샘플에서 포자소체 생존율이 용량 의존적으로 감소하였다.
실시예
5 -
숙주 세포에서
아이메리아
테넬라
포자소체
침습 및 증식에 대한 Q. 인펙토리아의 시험관내 효과
숙주 세포에서 아이메리아 테넬라 포자소체 침습 및 증식에 대한 Q. 인펙토리아의 시험관내 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
포자소체는 유리 비드 분쇄 및 효소 탈낭 후 포자형성 오시스트로부터 획득하였다. 숙주 세포로서, Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) 세포를 선택하였다. 50 및 100 ppm의 포자소체 및 큐어커스 인펙토리아를 네 시간 동안 MDBK 숙주 세포에 첨가하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포를 세척하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 4 (T4), 24 (T24), 48 (T48) 및 72 (T72) 시간 후, 배지 및 MDBK 세포를 수집하고, -20℃에서 저장하였다.
음성 대조군 (neg ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염된 MDBK 세포로서 세포 배양 배지에서 인큐베이션한 것이다. 양성 대조군 (pos ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염된 MDBK 세포로서, 5 μg/ml의 살리노마이신 용액과 인큐베이션한 것이다.
다양한 수집 시점에서, DNA를 감염된 MDBK 세포로부터 추출하였다. 아이메리아 DNA를 검출하기 위한 실시간 PCR을 다양한 시점 및 다양한 처리로 샘플에 대해 수행하였다. PCR 결과는 도 7에 제시하였다.
실시간
PCR
분석
1회 처리내에서 T4 대비 각 시점에 대한 Ct 값의 차이를 계산하였다 (ΔCt). 하기 식을 이용하여 T4에 대비 각 시점에 대한 배수 변화를 계산하였다:
배수 변화 = 2- ΔCt
이들 결과는 도 8에 제시하였다.
음성 대조군은 명백한 아이메리아 증식을 나타냈는데, 그 이유는 시작 4 시간째 대비 72 시간째에 아이메리아 DNA가 15배 증가했기 때문이다. 양성 대조군은 증식을 완전하게 억제시킬 수 있었다. 또한, Q. 인펙토리아 처리에 있어서, 증식의 명백한 억제가 용량 의존적 방식으로 시작 4 시간째 대비 관찰되었다.
실시예
6 -
숙주 세포에서
아이메리아
테넬라
포자소체
침습 및 증식에 대한 Q. 인펙토리아의 시험관내 효과
숙주 세포에서 아이메리아 테넬라 포자소체 침습 및 증식에 대한 Q. 인펙토리아의 시험관내 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
포자소체는 유리 비드 분쇄 및 효소 탈낭 후 포자형성 오시스트로부터 획득하였다. 숙주 세포로서, Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) 세포를 선택하였다. 포자소체를 50, 100 및 250 ppm의 큐어커스 인펙토리아로 세 시간 동안 전-처리하였다. 그 후, 포자소체 현탁액을 세척하고, 20 시간 동안 MDBK 세포의 배양물에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 세척하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 20, 72 및 96 시간 후, 배지 및 MDBK 세포를 수집하고, -20℃에서 저장하였다.
음성 대조군 (neg ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염된 MDBK 세포로서, 세포 배양 배지에서 인큐베이션한 것이다. 양성 대조군 (pos ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염시킨 MDBK 세포로서, 5 μg/ml의 살리노마이신 용액과 인큐베이션한 것이다.
다양한 수집 시점에서, DNA를 MDBK 세포로부터 추출하였다. 아이메리아 테넬라 DNA를 검출하기 위한 실시간 PCR을 다양한 시점 및 다양한 처리로 샘플에 대해 수행하였다. PCR 결과는 도 9에 제시하였다.
실시간 PCR 분석
1회 처리내에서 T20 대비 각 시점에 대한 Ct 값의 차이를 계산하였다 (ΔCt). 하기 식을 이용하여 T20 대비 각 시점에 대한 배수 변화를 계산하였다:
배수 변화 = 2-ΔCt
Q. 인펙토리아에 대한 이들 결과는 도 10에 제시하였다.
음성 대조군은 명백한 아이메리아 증식을 나타냈는데, 그 이유는 시작 20 시간째 대비 96 시간째에 아이메리아 DNA가 20배 증가했기 때문이다. 양성 대조군은 또한, 증식을 완전하게 억제시킬 수 있었다. 또한, 다양한 투여량의 Q. 인펙토리아는 아이메리아 증식을 모두 억제하였다. 50 ppm Q. 인펙토리아에 있어서 약간 더 낮은 효과가 관찰되었다. 그러나, 이는 음성 대조군에서의 증가와 비교하여 무시할만하다.
실시예
7 -
Q.
인펙토리아의
활성 성분/들의 확인
이에 더하여, 본 발명자들이 미정제 추출물이 항-포자소체 활성을 지니며, 이는 콕시듐증을 제어할 수 있는 작용 모드중 하나일 수 있음을 확인했기 때문에, Q. 인펙테리아 몰식자의 생물활성 추적 분획 검정 (Bioassay Guided Fractionation assay (BGFA))을, 생물학적 검정으로서 개질된 MTT 환원 검정을 이용하여 수행하였다. 인펙토리아 몰식자 미정제 분말을 칼럼 크로마토그래피에 의해 다양한 용매를 사용하여 분별화시켰다. 각 분획으로부터의 샘플을 이들의 항-포자소체 활성에 대해 평가하였다. Q. 인펙토리아의 메탄올 및 물 분획은 다른 분획 대비 포자소체 생존력의 더욱 우수한 감소를 나타냈으며, 살리노마이신 대조군에 필적하였다 (도 11).
활성 분획의 피토케미컬 분석 (phytochemical analyses)을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 수행하여 항-포자소체 활성을 유도하는 활성 성분/들을 확인하였다. 메탄올 및 물 분획 둘 모두에 대한 HPLC 크로마토그램에서 4개의 주요 피크가 관찰되었는데, 하나의 피크는 갈산 표준의 보유 시간에 상응하였다 (도 12). Q. 인펙토리아 몰식자는 60 내지 70% 가수분해성 타닌을 지니는 것으로 공지되어 있으며, 이는 가수분해되어 갈살 및 갈산 중에 존재하는 약 7% 자유 갈산을 방출할 수 있다.
이들 네 화합물을 반-분취용 HPLC에 의해 분리하고, 항-포자소체 활성을 동일 농도에서 미정제 분말과 비교하여 평가하였다. 화합물의 항-포자소체 활성은 피크 1의 화합물이 가장 우수한 항-포자소체 활성을 가짐을 보여주었다. 다른 화합물은 포자소체에 대한 최소 활성을 나타냈다. 그러나, 미정제 분말은 피크 1보다 우수한 활성을 보여주었으며, 이는 추출물로부터의 화합물의 상승작용적 활성을 나타낸다 (도 13).
HPLC 크로마토그램의 다양한 피크의 LC/MS/MS 분석에 의해 피크 1이 갈산이며 (도 14), 다른 피크들은 가수분해성 타닌의 분해된 생성물일 수 있는 고분자량 화합물임이 확인되었다. 이들 화합물이 추가로 분해되어 갈산을 방출할 수 있다는 가설을 세웠다.
추가로, 갈산 %와 항-포자소체 활성 간의 상관관계에 도달하기 위해, Q. 인펙토리아를 5 분, 2 및 12 시간 동안 물에서 추출하고, 이들의 항-포자소체 활성을 평가하였다. 본 연구는, 갈산 농도와 항-포자소체 활성 간의 명백한 상관관계 (상관계수 = -0.982226)가 있음을 보여주었다 (도 15). 이들 결과는, 갈산이 Q. 인펙토리아의 항-포자소체 활성의 원인이 되는 활성 성분임을 나타낸다.
실시예
8 -
갈산의
시험관내
보호 효과
아이메리아 테넬라 포자소체로 자극한 숙주 세포에 대한 갈산 일수화물의 시험과내 보호 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
포자소체는 유리 비드 분쇄 및 효소 탈낭 후 포자형성 오시스트로부터 획득하였다. 숙주 세포로서, Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) 세포를 선택하였다. MDBK 세포를 7 시간 동안 10 ppm 갈산과 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 포자소체 현탁액을 20 시간 동안 MDBK 세포에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 세척하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 20, 72 및 96 시간 후, 배지 및 MDBK 세포를 수집하고, -20℃에서 저장하였다.
음성 대조군 (neg ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염된 MDBK 세포로서, 세포 배양 배지에서 인큐베이션한 것이다. 양성 대조군 (pos ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염시킨 MDBK 세포로서, 5 μg/ml의 살리노마이신 용액과 인큐베이션한 것이다.
다양한 수집 시점에서, DNA를 MDBK 세포로부터 추출하였다. 아이메리아 DNA를 검출하기 위한 실시간 PCR을 다양한 시점 및 다양한 처리로 샘플에 대해 수행하였다. PCR 결과는 도 16에 제시하였다.
실시간 PCR 분석
1회 처리내에서 T20 대비 각 시점에 대한 Ct 값의 차이를 계산하였다 (ΔCt). 하기 식을 이용하여 T20 대비 각 시점에 대한 배수 변화를 계산하였다:
배수 변화 = 2-ΔCt
이들 결과는 도 17에 제시하였다.
음성 대조군은 명백한 아이메리아 증식을 나타냈는데, 그 이유는 시작 20 시간째 대비 96 시간째에 아이메리아 DNA가 60배 증가했기 때문이다. 양성 대조군은 증식을 거의 완전하게 억제시킬 수 있었다. 또한, 10 ppm 갈산 처리에 있어서, 증식의 명백한 억제가 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. 이는 10 ppm의 저용량의 갈산이 아이메리아 증식에 대해 일부 연장되게 숙주 세포를 보호할 수 있음을 나타낸다.
실시예
9 -
숙주 세포에서
아이메리아
테넬라
포자소체
침습 및 증식에 대한 갈산의 시험관내 효과
숙주 세포에서 아이메리아 테넬라 포자소체 침습 및 증식에 대한 갈산 일수화물의 시험관내 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
포자소체는 유리 비드 분쇄 및 효소 탈낭 후 포자형성 오시스트로부터 획득하였다. 숙주 세포로서, Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) 세포를 선택하였다. 포자소체를 10, 25 및 50 ppm의 갈산 일수화물로 세 시간 동안 전-처리하였다. 그 후, 포자소체 현탁액을 세척하고, 20 시간 동안 MDBK 세포의 배양물에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 세척하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 20, 72 및 96 시간 후, 배지 및 MDBK 세포를 수집하고, -20℃에서 저장하였다.
음성 대조군 (neg ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염된 MDBK 세포로서, 세포 배양 배지에서 인큐베이션한 것이다. 양성 대조군 (pos ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염시킨 MDBK 세포로서, 5 μg/ml의 살리노마이신 용액과 인큐베이션한 것이다.
다양한 수집 시점에서, DNA를 MDBK 세포로부터 추출하였다. 아이메리아 DNA를 검출하기 위한 실시간 PCR을 다양한 시점 및 다양한 처리로 샘플에 대해 수행하였다. PCR 결과는 도 18에 제시하였다.
실시간 PCR 분석
1회 처리내에서 T20 대비 각 시점에 대한 Ct 값의 차이를 계산하였다 (ΔCt). 하기 식을 이용하여 T20 대비 각 시점에 대한 배수 변화를 계산하였다:
배수 변화 = 2-ΔCt
이들 결과는 도 19에 제시하였다.
음성 대조군은 명백한 아이메리아 증식을 나타냈는데, 그 이유는 시작 20 시간째 대비 96 시간째에 아이메리아 DNA가 20배 증가했기 때문이다. 양성 대조군 및 다양한 투여량의 갈산은 아이메리아 증식을 억제하였다. 10 ppm 갈산에 대해 약간 더 낮은 효과가 관찰되었다. 그러나, 이는 음성 대조군에서의 증가와 비교할 경우 무시할만하다.
실시예
10 -
콕시듐증
제어에서
갈산의
효능
육계의 콕시듐증 제어에서 11, 22 및 33 ppm의 세가지 상이한 투여량의 갈산의 효능을 생체내 자극 실험으로 평가하였다. 조류에 E. 테넬라, E. 막시마 및 E. 아세르불리나의 오시스트를 사용하여 아이메리아의 혼합 감염을 유도하였다. 이들 오시스트는 임상 콕시듐증으로 확인된 조류로부터 분리하였다. 실험 설계, 오시스트 투여량, 백신접종 스케줄, 농장 관리는 실시예 3의 것과 유사하였다. 병변 스코어링은, 비감염된 대조군 및 심지어 양성 대조군 살리노마이신 대비 3개의 평가된 아이메리아 종 모두에 있어서 스코어의 현저한 감소가 있음을 보여주었다 (도 20). 그램 당 오시스트는 유사한 경향을 보여주었으나 (도 21), 폐사는 감염된 대조군을 포함하여 처리군 어디에서도 관찰되지 않았다. 용량 의존적 반응이 관찰되었으나, 22 내지 55 ppm의 갈산에서는 현저한 차이가 존재하지 않았다. 이는 갈산이 육계에서 콕시듐증의 혼합 감염을 제어할 수 있음을 보여준다. 이는 또한, 갈산이 Q. 인펙토리아의 항콕시듐 활성의 원인이 되는 활성 성분임을 입증한다.
실시예
11 -
갈산
함유 식물의 항-
포자소체
활성
추가로, 갈산을 함유하는 그 밖의 식물을 또한, 육계에서 이들의 항-포자소체 활성 및 항콕시듐 활성에 대해 평가하였다. 선택된 식물은 루스 키넨시스 (차이니즈 몰식자 (Chinese gall nut)) 및 터미날리아 케불라 (인도 몰식자 (Indian gall nut))였다. 루스 키넨시스는 약 70 % 가수분해성 타닌을 함유하며, 터미날리아 케불라는 약 0.28% 자유 갈산을 함유한다. 그러나, T. 케불라는 25 내지 40% 가수분해성 타닌을 함유하며, 이는 분해되어 갈산을 방출할 수 있다. 이들 식물은 이들의 항산화제, 항-염증, 항박테리아, 항진균류, 항돌연변이 및 항암 활성에 대해 보고되었다.
터미날리아 케불라의 열매 및 루스 키넨시스의 몰식자의 미정제 분말을 각각 Natural Remedies (Bangalore, India) 및 Xinjiang (China)로부터 획득하였다. MTT 검정에 의한 항-포자소체 검정은, 평가한 식물 둘 모두가 대조군 대비 포자소체의 생존력을 감소시킬 수 있으며, 양성 대조군 살리노마이신보다 더욱 우수하였음을 보여주었다 (도 22).
실시예
12 -
숙주 세포에서
아이메리아
테넬라
포자소체
침습 및 증식에 대한 갈산 함유 식물의 시험관내 효과
숙주 세포에서 아이메리아 테넬라 포자소체 침습 및 증식에 대한 갈산의 기타 공급원의 시험관내 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
포자소체는 유리 비드 분쇄 및 효소 탈낭 후 포자형성 오시스트로부터 획득하였다. 숙주 세포로서, Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) 세포를 선택하였다. 포자소체를 50, 100 및 250 ppm의 터미날리아 케불라로 세 시간 동안 전-처리하였다. 그 후, 포자소체 현탁액을 세척하고, 20 시간 동안 MDBK 세포의 배양물에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 세척하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 20, 72 및 96 시간 후, 배지 및 MDBK 세포를 수집하고, -20℃에서 저장하였다.
음성 대조군 (neg ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염된 MDBK 세포로서, 세포 배양 배지에서 인큐베이션한 것이다. 양성 대조군 (pos ctrl)은 아이메리아 포자소체로 감염시킨 MDBK 세포로서, 5 μg/ml의 살리노마이신 용액과 인큐베이션한 것이다.
다양한 수집 시점에서, DNA를 MDBK 세포로부터 추출하였다. 아이메리아 테넬라 DNA를 검출하기 위한 실시간 PCR을 다양한 시점 및 다양한 처리로 샘플에 대해 수행하였다. PCR 결과는 도 23에 제시하였다.
실시간 PCR 분석
1회 처리내에서 T20 대비 각 시점에 대한 Ct 값의 차이를 계산하였다 (ΔCt). 하기 식을 이용하여 T20 대비 각 시점에 대한 배수 변화를 계산하였다:
배수 변화 = 2-ΔCt
T. 케불라에 대한 이들 결과는 도 24에 제시하였다.
음성 대조군은 명백한 아이메리아 증식을 나타냈는데, 그 이유는 시작 20 시간째 대비 96 시간째에 아이메리아 DNA가 20배 증가했기 때문이다. 양성 대조군 및 250 ppm T. 케불라는 아이메리아 증식을 완전히 억제하였다. 용량-반응 효과가 관찰되었으나, 100 ppm T. 케불라에 대해 약간 더 낮은 효과가 나타났으나, 이는 음성 대조군에서의 증가와 비교할 경우 무시할만하다.
실시예
13 -
콕시듐증
제어에서
갈산
함유 식물의 효능
육계의 콕시듐증 제어에서 갈산 함유 식물 즉, 터미날리아 케불라 및 루스 키넨시스의 효능을 생체내 자극 실험으로 평가하였다. 임상 콕시듐증을 갖는 것으로 확인된 조류로부터 분리된 E. 테넬라, E. 막시마 및 E. 아세르불리나의 오시스트를 사용하여 조류에서 아이메리아의 혼합 감염을 유도하였다. 실험 설계, 오시스트 투여량, 백신접종 스케줄, 농장 관리는 실시예 3의 것과 유사하였다. 병변 스코어링은, 200 및 500 ppm의 루스 키넨시스 및 1000 ppm의 터미날리아 케불라가 비감염된 대조군 및 심지어 양성 대조군 살리노마이신 대비 3개의 평가된 모든 종에 있어서 스코어를 현저하게 감소시킬 수 있음을 보여주었다 (도 25). 그램 당 오시스트는 유사한 성향을 보여주었으나 (도 26), 폐사는 감염된 대조군을 포함하여 처리군 어디에서도 관찰되지 않았다. 루스 키넨시스와 관련하여 용량 의존적 반응이 관찰되었다.
상기 설명 및 도면은 본 발명의 예시적 구체예를 포함한다. 본원에 기술된 상기 구체예 및 방법은 당업자의 능력, 경험 및 선호를 기초로 하여 변화될 수 있다. 방법의 단계의 특정 순서로의 단순한 기록은 방법의 단계 순서에 어떠한 제한을 두는 것이 아니다. 상기 설명 및 도면은 단지 본 발명을 설명하고 예시하는 것이며, 본 발명은 여기에 제한되지 않으며, 단지 청구범위로 제한된다. 본 발명을 숙지한 당업자는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 변형 및 변화를 가능하게 할 수 있을 것이다.
Claims (16)
- 동물에서 콕시듐증을 제어하는 조성물로서, 유효량의 갈산, 갈산의 유도체, 갈로타닌 및 가수분해성 타닌으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 함유하는 식물의 추출물 또는 식물 부분을 포함하는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 식물이 큐어커스 인펙토리아 (Quercus infectoria), 루스 키넨시스 (Rhus chinensis) 및 터미날리아 케불라 (Terminalia chebula)로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 추출물이 천연 추출물인 조성물.
- 제 1항에 있어서, 콕시듐증이 아이메리아 종 (Eimeria spp.)에 의해 초래되는 조성물.
- 제 4항에 있어서, 아이메리아 종이 E. 테넬라 (E. tenella), E. 막시마 (E. maxima) 및 E. 아세르불리나 (E. acervulina)로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제 1항에 있어서, 콕시듐증 제어가 가금류에서 맹장 병변 스코어 (caecal lesion score), 배설물 그램 당 오시스트 (oocyst) 및 폐사율의 감소를 포함하는 조성물.
- 큐어커스 인펙토리아, 루스 키넨시스 및 터미날리아 케불라로 구성된 군으로부터 선택되는 식물의 추출물 또는 식물 부분을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하여, 동물에서 콕시듐증을 제어하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 식물의 추출물 또는 식물 부분이 유효량의 갈산, 갈산의 유도체, 갈로타닌 및 가수분해성 타닌으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 함유하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 추출물이 천연 추출물인 방법.
- 제 7항에 있어서, 콕시듐증이 아이메리아 종에 의해 초래되는 방법.
- 제 10항에 있어서, 아이메리아 종이 E. 테넬라, E. 막시마 및 E. 아세르불리나로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 7항에 있어서, 콕시듐증 제어가 병변 스코어, 배설물 그램 당 오시스트 및 폐사율의 감소를 포함하는 방법.
- 아이메리아 종으로 감염된 동물에서 포자소체의 활성을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 갈산, 갈산의 유도체, 갈로타닌 및 가수분해성 타닌으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 함유하는 식물의 추출물 또는 식물 부분을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 추출물이 천연 추출물인 방법.
- 제 13항에 있어서, 아이메리아 종이 E. 테넬라, E. 막시마 및 E. 아세르불리나로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 13항에 있어서, 포자소체 활성의 감소가 가금류에서 맹장 병변 스코어, 배설물 그램 당 오시스트 및 폐사율의 감소를 유도하는 방법.
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