KR101532008B1

KR101532008B1 - 백선피 추출물을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물

Info

Publication number: KR101532008B1
Application number: KR1020130102812A
Authority: KR
Inventors: 김옥진; 홍선화
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2015-06-26
Also published as: KR20150025322A

Abstract

본 발명은 톡소플라스마증의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 백선피 추출물을 유효 성분으로 함유하는 톡소플라스마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 백선피를 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 세포 독성에 문제가 없는 효능과, 항톡소포자충제보다 높은 선택성을 갖는 효능, 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 효능 및 톡소포자충에 감염된 세포의 생존을 억제하는 효능을 보유하고 있다.

Description

백선피 추출물을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물{A COMPOSITION FOR TREATMENT OF TOXOPLASMOSIS COMPRISING THE EXTRACT OF DICTAMNUS DASYCARPUS}

본 발명은 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis) 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 백선피(Dictamnus dasycarpus) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 백선피 추출물을 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은, 항톡소포자충 활성을 보유하고 있다.

본 발명에 따른 백선피 추출물을 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은, 백선피 추출물의 농도를 4×10⁴cells/well의 헬라 세포에 톡소포자충 배양시 4×10⁵cells/well 기준으로 100~200 ㎍/㎖ 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

원충(pretozoa)의 한 속인 콕시디움(coccidium)에 의해 일어나는 콕시디움증(coccidiosis)은 현재 소, 양, 토끼 및 가금에 문제를 일으키는 원충성 질병 중 대표적인 질병으로 특히 가금에 치명적인 손상을 유발한다. 콕시디움증은 치료 및 예방제로 항생제를 주로 사용하여 왔으나 그 치료 효율이 비교적 낮은데도 불구하고 항생제 내성균이 출현하였으며, 잔류 독성 문제도 발생하였다.

또한 최근 산업동물의 집단 및 밀집 사육으로 인하여 전 세계적으로 콕시디움의 폭발적인 발생을 초래하게 되었으며, 이에 따라 설파제, 암푸로륨과 같은 화학요법제의 치료가 널리 이용되었고, 기타 항콕시디움 치료제들을 사료에 첨가하여 지속적으로 투약함으로써 콕시디움 발생억제가 다소 가능하였다.

그러나 이들 항생제를 수십 년에 걸쳐 지속적, 장기적으로 투여함으로써 항생제 내성을 가진 원충이 출현하게 되었고, 결과적으로 이미 개발된 항생제들의 사용 수명이 단축되었다. 이에 따라 새로운 약제들의 계속적인 개발이 필요하게 되었다.

톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 콕시디아아강(coccidia亞綱, subclass of coccidia)에 속하는 첨복포자충이다. 세포 내 기생충(obligare intercellular parasite)인 톡소포자충은 여러 종류의 세포 안에서 증식하며, 전 세계적으로 분포하는 인체 및 동물의 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis)의 원인 원충이다.

톡소포자충은 1909년 니콜(Nicolle) 및 만시앙(Manceanx)에 의하여 발견되었고, 허치슨(Hutchison(1969)), 프랭클(Frenkel(1970))에 의하여 생활사가 밝혀졌으며, 우리나라에서는 1965년 돼지에서 분리되었다. 톡소포자충에 의한 인체 감염은 1923년 장쿠(Janku, J)에 의해 처음 발견되었다.

톡소포자충의 생활사는 난포낭(oocyst, 오시스트), 영양형(tachyzoit, 타키조이트), 감염형(bradyzoit, 브래디조이트), 분열체(schizont, 시존트) 및 생식모체(gametocyte, 거미토사이트) 단계의 크게 5가지 발육 단계를 가진다.

이 중 종숙주인 고양이, 자칼, 여우 등에서는 5단계가 모두 나타나며, 중간 숙주인 쥐, 돼지, 소, 양, 개, 사람 등에서는 영양형 및 감영형의 2단계만 나타난다.

난포낭은 포자충류의 생활사 가운데 유성생식을 해서 생긴 융합체에 피막이 형성된 것으로 일반적으로 소독약에 대해 극히 강한 저항성을 갖는다. 난포낭 내에는 2개의 포자낭(sporocyst)이 있고, 각 포자낭 내에는 4개의 포자소체(sporozoit)가 있어 이것이 감염원이 된다.

영양형 또는 증식형이라고도 하는 단계의 원충은 급성 감염시 빠르게 분열, 증식하는 형태이다. 톡소포자충의 병원성의 강약은 영양형 원충이 형성되는 속도에 관계한다.

감염형 원충은 감염 2-3주 후 만성기에 만들어지는 낭포(cyst)에 의해 둘러싸인 충체(蟲體)로 낭포 1개에 수천 개의 감염형 원충이 들어있다. 분열증식 속도가 완만하나, 다른 동물에 대한 감염원으로 중요한 역할을 한다. 영양형과 감염형 원충은 충체 내에서 완전한 새로운 2개의 개체가 형성되어 모충체를 깨고 나오는 내부출아법(endodyogeny)으로 분열, 증식한다.

숙주내로 유입된 충체는 분열체(schizont)로 성장하여 여러 개의 분열소체(merozoite)를 생성한다. 분열소체는 또 다른 세포를 감염시키고 일부는 생식세포를 만드는 생식모체(gemetocyte)가 되어 암수 생식세포(macrogamete, microgamete)를 생성한다. 이들은 접합(fertilization)한 후, 접합자(zygote)가 되어 난포낭(oocyst)로 성장한다.

톡소포자충의 전염경로에는 후천성 감염과 선천성 감염이 있다. 후천성 감염은 식육(食肉)시 원충이 기생하는 조직 내 난포, 영양형 또는 감염형 원충을 먹거나, 외계에 분산하여 흙이나 식품 중에 섞여 있는 난포낭을 경구 섭취하였을 때 이루어진다. 숙주가 난포낭을 섭취하면 난포낭과 그 속에 있는 포자낭의 외벽이 파괴되고, 포자소체가 튀어나와 림프구, 대식세포 등 망상내피계세포(reticuloendothelial cell)로 들어간 후 분열 증식한다.

특히 종숙주인 고양이 분변 내의 난포낭은 산이나 알칼리에도 저항성이 강하고 물속이나 습기 있는 흙에서 수개월 동안 감염성을 유지하므로 주의를 요한다.

선천성 감염은 모체로부터 태반을 통해 태아에게 감염되는 것으로 영양형 충체가 중요한 역할을 한다.

톡소포자충에 감염되면 조직을 침범하여 괴사를 일으키고 뇌에서는 석회화, 체강 내에 삼출성 염증 등을 일으킨다. 톡소포자충은 적혈구를 제외한 거의 모든 세포에 감염될 수 있으며 림프구, 대식세포 등의 망상내피계세포에 특히 잘 감염된다. 주요 침범 조직은 림프선, 망막, 뇌 등이며 임파선염(lymphadenopathy), 망막맥락막염(retinochoroiditis), 뇌염 등을 일으킨다.

후천성 감염의 증상으로는 발열몸살형(acute febrile illness with cervical lymphadenopathy), 피부뇌염형(typhus-like, exanthematous type with encephalitis), 수막뇌염형(CNS type with meningoencephalitis), 망막맥락막형(retinochoroiditis type) 등이 있다. 호지킨스병, 백혈병, 암, 장기이식자 및 에이즈 환자와 같은 면역결핍환자의 경우 뇌염, 폐염 등을 일으켜 사망할 수 있기 때문에 더욱 주목받고 있다.

선천성 감염의 경우 유산의 위험이 있다. 모체의 태반을 통해 감염된 태아는 망막맥락염, 뇌수종, 뇌내 석회화, 경련을 일으킬 수 있으며 중추신경계 감염으로 인한 수두증, 소두증, 지능장애 등이 발생하기도 한다. 전신증상으로는 발열, 발진, 황달, 빈혈, 간장과 비장의 종대 등이 있으며, 감염아의 약 12%가 4년 내에 사망한다.

톡소플라즈마증에 대하여 치료 효과가 뛰어난 치료제는 아직까지 개발되지 않았으며, 어느 정도 효과가 있는 것으로 알려진 약제들을 대증 치료제로써 사용하고 있는 실정이다.

현재 톡소플라즈마증에 가장 많이 사용되는 약은 말라리아 치료제이기도 한 피리메타민(pyrimethamine)이나, 임신 중에는 효과가 상대적으로 약하다는 단점이 있으며 기타 사용되는 약물 중 하나인 스피라마이신(spiramycin)은 약효가 크지 않아 예방용으로 쓰인다.

피리메타민과 병용되어 쓰이는 설파제(sulfa drug)인 설파메톡사졸(sulfamethoxazole)은 골수억제가 일어나 혈소판 수가 감소할 수 있으므로 엽산을 병용 투약해야 하며 부작용으로 알러지반응, 신장장애, 혈액장애, 오심(惡心), 구토 등이 일어날 수 있다.

또한 현재까지 항톡소포자충제로 사용되는 설파제나 피리메타민 등에 대한 내성은 계속 증가하고 있으므로 톡소포자충에 대하여 완벽한 효과를 보유한 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

신약은 유효성이 높고 사람과 동물의 세포에 독성 및 내성 등의 부작용이 없는 약물이어야 한다. 항생제는 효능이 우수하다 하여도 시간이 지날수록 내성이 생기는데, 천연물을 이용하면 충분히 이런 문제를 해결할 수 있으리라 예상된다. 그 이유는 천연물은 현재까지 알려지지 않은 새로운 성분이며, 개개의 작용이 다양한 단일성분의 혼합물이므로 복합물 상호간의 약리 작용으로 내성 등의 부작용이 적을 것이라고 사료된다.

한편, 톡소플라즈마증 치료용 조성물에 관련되어 공개된 특허문헌을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0017971호에 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라증의 예방 및 치료용 조성물에 관하여 기재되어 있으며 대한민국 등록특허공보 제10-0830202호에는 물푸레나무로부터 분리된 프락시딘을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 조성물에 관하여 기재되어 있다.

천연물을 이용하여 연구된 항톡소플라즈마에 관련한 또 다른 문헌으로 한약제 진피의 항톡소포자충 효과가 확인되었고(비특허 문헌1), 개똥쑥에서 분리 확인된 화합물로부터 항톡소포자충 효과가 확인되었다(비특허 문헌2).

한편, 백선(Dictamnus dasycarpus Turcz.)은 운향과(Rutaceae)에 속하는 여러해살이풀로 높이는 90 cm 가량이고 줄기는 튼튼하고 크며 뿌리는 굵다. 잎은 어긋나고 줄기의 중앙부에 모여나며 2~4쌍의 작은 잎으로 구성된 홀수 깃꼴겹잎이다. 작은 잎은 타원형으로 길이 3~5 cm, 너비 1~2 cm 이며, 양끝이 좁고 가장자리에 잔톱니가 있다. 꽃은 엷은 홍색, 지름 2.5 cm 가량으로 5~6월에 원줄기 끝에 총상 꽃차례로 달린다. 꽃잎은 5개, 수술을 10개이며, 암술대와 더불어 처지지만 끝이 위로 향한다. 자방은 5실로 열매가 삭과로 익으면 5개로 갈라지며 털이 있다.

백선피는 백선의 뿌리껍질로 늦은 봄부터 여름 사이에 뿌리를 채취하여 목질부를 제거하고 햇볕에 건조한 것이다. 맛은 쓰고 짜며, 성질은 차다. 폐경, 대장경, 비경에 작용한다.

백선피는 한국 및 중국을 포함한 아시아 지역에서 오래전부터 민간에서 피부 가려움증이나 두드러기, 황달, 기침을 동반한 감기 등에 널리 이용되어 왔으며, 백선피 달임액은 이담작용, 해열작용 및 억균작용을 나타낸다는 것이 실험적으로 밝혀졌다.

백선피는 flavonoid, limonoid, furoquinoline alkaloid, sesquiterpene, sesquiterpene glycoside, coumarin 계열의 화합물을 많이 함유하고 있으며, 그 가운데 alkaloid 와 limonoid 계열이 주요한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 특히 limonoid 화합물은 항균작용과 뇌세포 보호 작용 등이 보고되었고, limonoid에 속한 fraxinellone은 항염증 효과, 항알러지 효과가 있는 것으로 보고되었다.

이에 본 발명자는 부작용 및 세포 독성이 없으며, 기존의 약물보다 톡소포자충 억제 효과가 뛰어난 백선피 조성물을 제공할 수 있다고 판단하여 본 발명을 안출하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2012-0017971호 (2012.02.29) 대한민국 등록특허공보 제10-0830202호 (2008.05.09)

비특허 문헌 1: 김혜경, 강경화, 이동환, 김혜숙, 박현. 한약제 진피의 항 톡소포자충 효과 확인. 동의생리병리학회지. 2008. 22(1): 96~99. 비특허 문헌 2: 강경화, 김화경, 김혜숙, 카마타, 와타야, 박현. 개똥쑥에서 분리 확인된 endoperoxie ring 구조를 갖는 1,5-bis(4-methoxyphenyl)-6,7-dioxa-bicyclo[3,2,2]nonane의 항톡소포자충 효과. 동의생리병리학회지. 2007. 21(1): 82~85.

본 발명의 목적은, 세포 독성이 적고 부작용이 없는 천연물 유래 소재를 이용하여 톡소플라즈마증의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은, 기존의 항톡소포자충제보다 높은 선택성을 갖는 백선피를 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은, 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 백선피를 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은, 톡소포자충에 감염된 세포의 생존을 억제하는 효과가 있는 백선피를 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 세포 독성이 적고 부작용이 없는 천연물 유래 소재를 이용한 톡소플라즈마증의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은 기존의 항톡소포자충제보다 높은 선택성을 갖는 백선피를 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 백선피를 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방 개선 또는 치료를 위한 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은 톡소포자충에 감염된 세포의 생존을 억제하는 효과가 있는 백선피를 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방 개선 또는 치료를 위한 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 조성물은, 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료 조성물로 제공될 수 있으며, 각각의 조성물은 약학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명이 약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형체, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 처리제가 추가될 수 있음은 물론이다.

본 발명인 백선피를 유효 성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 세포 독성이 없는 효능과, 기존의 항톡소포자충제보다 높은 선택성을 갖는 효능, 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 효능 및 톡소포자충에 감염된 세포의 생존을 억제하는 효능을 보유하고 있다.

도 1은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 백선피 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 생존도를 MTT분석으로 측정한 그래프이다.
도 2는 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 백선피 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 형태학적 변화를 나타낸 사진이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신이 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 백선 추출물의 제조

1) 백선을 추출한다.

백선은 어떠한 전처리도 가하지 않은 것을 사용할 수 있으며, 건조, 절단 또는 분쇄 등의 전처리를 가한 것을 사용할 수도 있다. 건조, 절단 등의 전처리 방법 또한 여러 가지 방법 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 백선을 자연 건조한 후 세절한 것을 사용할 수 있다.

백선의 추출 부위는 설계 조건에 따라 백선의 전초, 꽃, 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 가지 등에서 다양하게 이용될 수 있으며, 각 부위의 세부 부위까지도 추출 부위의 범주에 포함될 수 있다. 바람직하게는 백선의 뿌리 껍질을 추출 부위로 이용할 수 있다.

추출 방법에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 환류추출법을 이용할 수 있다. 추출 진행시의 시간 및 온도는 설계 조건에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 100℃에서 2시간 추출할 수 있다.

용매 추출시, 추출 용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및 잔류 성분 처리 방식 등을 달리하여 처리한다. 추출 용매도 다양하게 선택될 수 있다. 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 플로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올 및 이소프로판올 등이 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 추출 용매의 농도도 다양하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 70% 농도의 용매를 사용할 수 있다.

또한 설계 조건에 따라 백선과 용매의 중량비가 다르게 설정될 수 있으며, 바람직하게는 백선 1 : 용매 6의 중량비로 설정될 수 있다.

2) 백선 추출물을 여과한다.

1)의 과정에서 추출된 백선 추출물을 여과한다.

여과 방법에는 침강법, 막 분리법, 원심분리법, 분별증류법, 분배법 등이 있으며, 이외에도 다양한 방법이 사용될 수 있다. 여과 진행시의 시간 및 온도는 설계 조건에 따라 달라질 수 있다.

3) 여과된 백선 추출물을 농축한다.

2)의 과정에서 여과된 백선 추출물을 농축한다.

농축 방법에는 증발농축법, 냉동농축법, 막농축법, 건조농축법 등이 있으며, 다양한 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는 감압농축법을 사용할 수 있다. 농축 진행시의 시간 및 온도는 설계 조건에 따라 달라질 수 있다.

설계 조건에 따라 상기 기재된 공정 외에도 여과, 농축, 추출 등의 공정이 반복 실행될 수 있으며, 각 공정 전후에 발효, 냉동 등의 기타 공정이 추가로 실행될 수도 있다.

실험예 1. 톡소포자충 선택성( selectivity ) 측정

여기에서, 실험예 1을 비록한 이하 모든 실험예는 실시예 1에 기재된 사항과 동일하게 제조된 조성물을 이용하여 수행되었음을 밝혀둔다.

1-1. 실험 준비

본 실험에 사용된 톡소포자충(RH strain of Toxoplasma gondii, ATCC, No.50174)의 영양형(tachyzoite)은 ICR mouse 암컷 마우스에서 얻었다.

1) 1×10⁵cells/well개의 톡소포자충 영양형을 4주령 ICR mouse 암컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 5일 후 마우스를 경추탈골 사망시켰다.

2) 2% FBS(GIBCO, Lot No.1312606, USA)를 함유한 DMEM 배지(GIBCO, Lot No.1300045, USA) 10 ㎖을 복강에 주입하고 1분간 가볍게 마사지해주었다.

3) 다시 복수액을 10 ㎖짜리 주사기로 전부 뽑아내고 500RPM에서 5분 동안 원심분리 후, 침전물은 버리고 상층액은 새로운 50 ㎖ 튜브에 옮겨서 500RPM에서 5분간 원심분리하였다.

4) 상층액은 새로운 50 ㎖ 튜브에 옮겨서 2400RPM에서 10분간 원심분리하여 톡소포자충의 영양형을 얻었다.

5) 4)를 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 재부유시키고, 4℃에서 3 내지 4일간 보관하였다.

6) 이 중 일부는 또다시 새로운 ICR mouse 암컷 마우스에 주입하여 유지하였다.

본 실험에 사용된 헬라 세포(Hela cell; 한국세포주은행, 1002)는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

이하 모든 실험예의 실험 준비 과정은 상기 과정과 동일한 과정으로 실행되었음을 밝혀둔다.

1-2. 실험과정

EZ-Cytox(Daeil Lab. Co., Korea)는 WST를 이용하여 살아있는 세포의 양을 측정하는 방법으로 세포 생존능(cell viability), 세포 증식(proliferation)과 세포독성검사(cytotoxicity assay)등에 사용할 수 있다. WST는 물에 잘 녹는 high sensitive water soluble tetrazolium salt로써 살아있는 세포의 탈수소효소(dehydrogenase)와 반응하여 오렌지 색의 수용성 formazan을 생성한다. WST와 반응하는 탈수소효소는 대사적으로 왕성한 활동을 하는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 효소로써 살아있는 세포에만 유의하기 때문에, formazan이 검출되는 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포 수를 알 수 있다.

대조군으로는 대표적인 설파제인 설파다이아진(sulfadiazine sodium salt, SIGMA, S6387, Germany)를 사용하였다. 설파다이아진은 설폰아미드 항생물질로 세균 세포 안에서 폴산의 생산을 중지시킴으로써 감염을 일으키는 세균을 제거하고 요로감염증을 다루는 데 흔히 사용된다.

1) 헬라 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 96 웰 플레이트에 9×10³/㎖ 되게 접종하고, 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양한다.

2) 18시간 후, 2%의 FBS가 함유된 배지로 교환 및 톡소포자충 영양형을 헬라 세포주의 5배 되게 처리하였다.

3) 그 후, 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 천연물을 농도별로 처리하였다. 이때 대조군으로 설파다이아진을 사용하였다.

4) 24시간 뒤 EZ-Cytox Kit를 실시하고 흡광광도계로 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 톡소소포충의 증식을 억제하는 농도(EC₅₀: 50% 세포증식억제농도)를 산출하였고, 하기 [수학식 1]을 이용하여 선택성(selectivity)을 구하였다.

1-3. 실험 결과

[표 1]은 백선피 추출물과 설파다이아진을 헬라 세포에 농도별로 처리했을 때 헬라 세포에서와 톡소포자충에서의 EC₅₀을 나타낸 표이다.

	헬라 세포에서의 EC₅₀(㎍/㎖)	톡소포자충에서의 EC₅₀(㎍/㎖)	선택성
백선피 추출물	10619.6	1412.5	7.52
설파다이아진	351.327	168.842	2.08

측정 결과, 백선피 추출물을 처리했을 때 헬라 세포에서의 EC₅₀은 10619.6 ㎍/㎖, 톡소포자충에서의 EC₅₀은 1412.5 ㎍/㎖으로 수학식 1에 의해 선택성이 7.52가 계산되었으며, 설파다이아진 처리시 헬라 세포에서의 EC₅₀은 351.327 ㎍/㎖, 톡소포자충에서의 EC₅₀은 168.842 ㎍/㎖으로 수학식 1에 의해 선택성이 2.08이 계산되었다.

이로써 본 발명의 백선피 추출물은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에서 항톡소포자충 약물인 설파다이아진보다 3.61배 높은 선택성을 보여 톡소포자충의 증식을 효과적으로 억제하는 효과가 있다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 2. 톡소포자충 감염 세포의 생존 억제능 측정

2-1. 실험 과정

MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT formazan의 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 상기 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 즉 살아있는 세포의 수가 많을수록 상기 MTT formazan의 생성도 많아지므로 이러한 방법을 통해 세포의 성장을 쉽게 측정할 수 있다.

따라서 본 발명에서는 백선피 추출물이 톡소포자충 감염 세포의 생장을 억제하는지 여부를 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였다. 그 방법은 다음과 같다.

1) 96 웰 플레이트에 헬라 세포를 4×10⁴ cells/well농도로 접종하고, 24시간 후 각각의 웰에 4×10⁵ cells/well의 비율로 톡소포자충을 감염시켰다.

2) 24시간 후, 어떤 처리도 하지 않은 웰을 대조군으로 설정하고 나머지 웰에는 각각 백선피 추출물을 1, 10, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.

3) 24시간 후, MTT assay를 실시하고 ELISA 플레이트 리더기를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

4) 헬라 세포의 증식률(proliferation rate: PR)은 하기 [수학식 2]를 이용하여 구하였다.

2-2. 실험 결과

도 1은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 백선피 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 생존도를 MTT분석으로 측정한 그래프이다.

세포의 증식 및 성장에 미치는 백선피 추출물의 효과를 확인하기 위하여 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 백선피 추출물을 1~200 ㎍/㎖의 다양한 농도범위로 처리하고 24시간 동안 배양한 결과, 세포의 생존도는 용량과 시간에 의존적으로 현저하게 감소하였다.

백선피 추출물의 농도를 1 ㎍/㎖ 처리한 군과 10 ㎍/㎖ 처리한 군의 경우 대조군보다 세포의 생존도가 높았으나, 백선피 추출물을 100 ㎍/㎖ 처리한 군과 200 ㎍/㎖ 처리한 군에서는 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 생존도가 유의하게 감소함을 볼 수 있다.

이로써, 백선피 추출물이 농도 의존적으로 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 생존과 증식에 억제효과가 있다는 결론을 도출할 수 있다.

실험예 3. 톡소포자충 감염 헬라 세포의 형태학적 변화

3-1. 실험 과정

백선피 추출물이 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 형태학적으로 어떤 효과가 있는지 관찰해 보기 위해, 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 백선피 추출물을 처리하고 광학 현미경으로 관찰하였다.

1) 96 웰 플레이트에 헬라 세포를 4×10⁴ cells/well 농도로 접종하고, 24시간 후 각각의 웰에 4×10⁵ cells/well의 비율로 톡소포자충을 감염시켰다.

2) 24시간 후, 각각의 웰에 백선피 추출물을 1, 10, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.

3) 24시간 후, 광학 현미경을 이용하여 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다.

3-2. 실험 결과

도 2는 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 백선피 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 형태학적 변화를 나타낸 사진이다.

백선피 추출물이 세포의 형태학적 변화에도 효과가 있는지 관찰하기 위해, 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 백선피 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 뒤, 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.

편의상 각 실험군들을 A, B, C, D의 4개 군으로 임의분류하였다. (백선피 추출물 1 ㎍/㎖ 처리군: A, 백선피 추출물 10 ㎍/㎖ 처리군: B, 백선피 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군: C, 백선피 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군: D)

관찰 결과, A군에서 D군으로 갈수록, 즉 백선피 추출물의 처리 농도가 높아질수록 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 세포 수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 특히 D군의 경우, 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 수가 현저하게 감소하였으며 세포의 모양이 정상 헬라 세포에 비해 일정하지 않고 불규칙해 형태학적 변화가 생긴 것을 관찰할 수 있다.

이로써, 백선피 추출물은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 농도 의존적으로 항증식효과가 있으며, 세포의 형태학적 변화를 일으키는 효과가 있다는 결론을 도출할 수 있다.

Claims

백선피 추출물을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에서 톡소플라즈마증 치료제인 설파다이아진보다 3.61배 높은 선택성(selectivity)을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 백선피 추출물의 농도는 4×10⁴cells/well의 헬라 세포에 톡소포자충 배양시 4×10⁵cells/well 기준으로, 100~200 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물에 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가한 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물.