KR100782500B1

KR100782500B1 - 천연 식물 추출물을 이용한 수생곰팡이 억제제

Info

Publication number: KR100782500B1
Application number: KR1020060045588A
Authority: KR
Inventors: 정창화; 전경동; 양문휴; 김원석; 안경출; 이백천
Original assignee: 주식회사 바이넥스
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2006-05-22
Publication date: 2007-12-05
Also published as: US20070269535A1; US7807201B2; KR20070112553A

Abstract

본 발명은 수산양식 산업현장에서 흔히 발생하여 막대한 피해를 끼치고 있는 어류의 진균성 질병 원인 중 하나인 수생곰팡이(Saprolegnia parasitica.)병의 방제제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 수생곰팡이 병 방제제는 항진균 작용을 갖는 천연물질을 탐색하고 스위트 플랙(Sweet flag) 추출물 또는 정유를 유효성분으로 이용하여, 친환경적이고 대상 어체에 무해한 물질을 수산 양식 산업에 접목하여 곰팡이의 성장억제 및 선택적 방제, 예방에 활용은 물론이고 발암물질로 알려진 말라카이트 그린(Malachite green)를 비롯한 화학요법제 및 항생제를 대체할 환경친화적 천연 치료제로 사용할 수 있다.

Description

천연 식물 추출물을 이용한 수생곰팡이 억제제{Antifungal agent comprising natural plant extracts}

도 1은 천연물질 스위트 플랙 추출물의 항진균 효과를 24 well plate method로 검증한 결과이다.

도 2는 천연물질 스위트 플랙 추출물의 항진균 효과를 24시간 마다 사진촬영하여 검증한 결과이다.

도 3은 말라카이트 그린의 항진균 효과를 24 well plate method로 검증한 결과이다.

도 4는 천연물질 스위트 플랙 추출물과 말라카이트 그린(MG)의 항진균 효과를 Diffusion plate method로 검증한 결과이다.

본 발명은 어류양식 시 발생하는 수생곰팡이 억제 및 치료제로 쓰여 왔던 말라카이트 그린과 같은 화학요법제 및 항생제의 대체제의 개발을 위해 천연물 유래 식물 추출물인 스위트 플랙(Sweet flag)의 정유를 이용한 수생곰팡이 병 억제 및 치료제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 발암성 물질로 알려져 사용이 금지된 말라카이트 그린의 수생곰팡이에 대한 성장억제 및 제거에 대한 효능과 효과를 비교 감안하여 본 발명에서 수생곰팡이 성장억제 및 치료제로 효과가 뛰어난 제품을 개발하는 것이다.

일반적으로 어류 양식에 있어 근간을 마련하는 수정란 생산은 한정된 면적 내에서 고밀도로 수정란을 수용하면서 자어를 생산하기 위한 전 단계를 의미하는 것으로서 인위적 관리 하에서 대량의 수정란을 생산하는 것을 말한다. 좀더 상세하게 설명하자면 세계적으로 가장 오래전부터 알려져 온 수생곰팡이병은 건강한 어체에 감염되는 경우는 드물지만 건강악화로 체표에 염증이 생기거나 타요인(他要因)에 의해 체표에 상처가 생기게 되면 그 부위의 죽은 세포에 수생곰팡이가 기생하게 되어 솜털처럼 번무하게 된다. 이러한 수생곰팡이의 원인은 조균류(藻菌類)인 Saprolegnia parasitica 가 체표 상처부위에 기생함으로써 생기는 질병으로, 수생균은 14℃이상이 되는 봄에 주로 유행하며 고수온기를 제외하고 연중 발생하며 20℃이사이 되면 자연 소멸되는 특성이 있다. 본 균은 활어수송, 선별, 채란(採卵), 채정(採精)등의 작업시에 상처부위와 피부흡충(皮膚吸蟲: Gyrodactylus), 닻벌레 등의 기생부위, 에로모나스(Aeromonas hydrophila)등의 병원성세균(病院性細菌)에 의한 염증부위(炎症部位), 영양성질병(營養性疾病)에 의한 염증부위, 건강악화 등의 1차적 감염요인에 의하여 형성된 체표 이상부위에 2차적으로 수생곰팡이가 착생하여 기생하는 것으로 주로 상피조직(上皮組織)에 침입하여 균사(菌絲)를 전신적(全身的)으로 확대 증식시켜 어류를 죽게 한다. 또한, 어류의 식욕을 감퇴시키고 어군(魚群)을 이탈하게 한다. 어란(魚卵)의 경우는 죽은 난(卵)에서 수생곰팡이가 번무(繁茂)하여 주위의 활란(活卵)을 감싸서 질식시켜 죽게 한다.

최근 이러한 어체 또는 수정란에 기생하여 대량 폐사를 일으키는 수생곰팡이의 제거를 위하여 말라카이트 그린과 같은 여러 가지의 항생제와 화학요법제를 남용하여 왔다. 그 중에서도 말라카이트그린은 (Malachite green: C₂₃H₂₅ClN₂)은 밝은 청록색의 트리페닐메탄계 염기성 염료로서 일반적으로 각종 섬유, 목재, 종이, 볏짚, 잡화 등의 염색에 널리 사용되며, 화학 분석용 시약, 지시약으로도 쓰여 왔다. 또한, 의약품으로는 국소 방부제로도 사용되어 왔다. 특히, 수산 양식용으로 진균(眞菌)과 그람양성균에 효과가 있어서 어류를 양식할 때 수정란의 소독, 양식과 운반과정, 보관 및 저장과정에서 곰팡이나 세균의 감염의 방지제로 사용되어 왔다. 그러나, 동물실험에서 발암물질로 의심되어 현재 여러 나라에서 사용이 규제되고 있다.

곰팡이 방제제로 쓰이는 약제들은 보통 ＜곰팡이방제제(防除劑)＞와 ＜항진균제(抗眞菌劑)＞가 활용되고 있다. 이들 약제는 그 기능상 ① 곰팡이의 세포벽·세포막에 화학적으로 작용함으로써 세포 안에서의 효소계(酵素系)의 기능 등 여러 가지 기능이 정상적으로 유지되는 것을 방해하는 것 ② 세포벽·세포막을 투과하여 세포 안으로 침투해서 핵산과 단백질의 합성에 관여하는 효소계를 비롯하여 다른 중요한 효소계의 작용을 저해하는 것 등의 2가지로 대별된다. 공업용으로는 대부분 ① 의 방법인 세포벽·세포막 교란작용성(攪亂作用性) 곰팡이 방제제가 이용된다. 항진균제는 의약용으로 이용되고 있는 병원성 진균류 방제제인데, 진균감염증의 갑 작스런 증가 추세로 말미암아 이 약제의 사용도 매우 많아졌다. 한편 식물병리학 분야의 연구에 의해 농작물 등에 피해를 주는 병원성 곰팡이를 없애기 위한 여러 가지 살충제가 개발되고 있는데, 현재 세계적으로는 주로 구리화합물·디티오카르바메이트 계통 약제가 이용되고 있다. 이 밖에도 곰팡이를 없애고 이에 의한 피해를 막기 위해 쓰이는 양식 산업의 방제제의 예로는 포르말린, 황산동, 메틸렌 블루,비치오놀,옥소린산(Oxolinic acid),과망간산칼륨, 클로로칼키, 소석회, 항생제(Chloramphenicol, Oxytetracycline, Chlorte-tracycline), 설파제(Sulfamerazine, Sulfamonomethoxine, Sulfadimethoxine sodium)등이 현재 양식산업에서 널리쓰이고 있지만 이러한 물질들의 인체적 위해성과 환경적 위해성은 다양한 연구 결과에서도 알 수 있듯이 피해가 매우 심각하다 할 수 있다. 따라서 이를 대체할 물질 개발이 시급한 상황으로 다양한 천연물질에 함유되어 있는 여러 가지 생리활성물질과 항진균성 물질에 대한 탐색연구가 진행되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 상기 화학제제를 대체할 천연물질을 탐색하던 중, 항진균 활성을 갖는 스위트 플랙(Sweet flag)의 수생곰팡이에 대한 구체적인 효능, 즉 항진균 효과를 처음으로 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였으며, 실제적으로 수생곰팡이에 사용되었던 대표적인 항생제인 말라카이트 그린을 대체할 방제제로 응용 적용하고자 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기에 나타낸 어류 진균성 감염증에 사용되는 화학제제 사용 시 발생하는 한계점과 부작용을 해소하기 위해, 안전성이 입증된 천연물질을 이용한 물질을 탐색하여 특히, 수생곰팡이 억제 및 제거에 효과가 뛰어난 물질을 탐색하여 연구를 통하여 나타낸 결과를 종합하여 스위트 플랙 추출물에 대하여 수생곰팡이 억제 및 제거 효과를 입증하고 산업적 부가 가치의 향상뿐 아니라 화학제 사용에 따른 역기능을 완전 배제할 수 있는 천연물질만으로의 어류 진균성 치료제를 개발하는 데 목적이 있다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 항진균 작용을 갖는 스위트 플랙 의 추출물을 취하여 수생곰팡이 생물학적 활성을 규명하여 수생곰팡이의 성장억제 및 제거 효과를 규명하였으며, 경제성에 맞는 제품을 생산하고자 하였다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 스위트 플랙(Sweet flag) 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 진균성 질병 치료제 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용된 스위트 플랙(Sweet flag, Acorus calamus)는 천남성과(Araceae)에 속하며, 여러해살이 식물로서 근경, 잎 및 뿌리 등 전체에 방향성 물질을 갖고 있다. 보통 스위트 플랙는 뿌리를 사용하는데, 근경에는 정유, 탄닌(tannin), 녹말, 팔미트산(palmitin acid),비타민C 등이 함유되어 있다. 정유에는 아사론(asarone), 유게놀(eugenol), 칼라메온(calameone), 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 등이 포함되어 있다. 이러한 성분을 포함하고 있는 스위트 플랙은 예로부터 민간요법으로 쓰이면서 위에서 위액과 염산을 잘 나오게 하여 소화를 도우며, 설사, 귀의 염증, 피부병, 무좀약, 진통, 항경련, 진해거담, 체온강하작용, 혈액순환에 대한 효능이 있으며, 서양에서는 구충제, 강장제, 향료의 원료로 사용하였다(정보섭, 신민교저, 향약대사전, 영림사, pp278-280, 1998).

본 발명에 있어서, 스위트 플랙(Sweet flag) 추출물은 물, 친수성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로도 추출될 수 있으나, 바람직하게는 친수성 유기용매로 추출된 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 친수성 유기용매는 50%~100%로 물에 희석하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 친수성 유기용매로는, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로필알콜, 이소프로필알콜 등의 탄소수 1~5의 저급알콜; 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 탄소수 2~5의 저급지방족케톤; 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 탄소수 2~5의 저급다가알콜 등을 들 수 있고, 이들은 친수성 알콜기(OH)나 케톤기(COC)을 가지고 있어서 유사한 극성을 나타내므로 용질에 대한 비슷한 추출활성을 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 어류의 진균성 질병 치료제 조성물은 유효성분으로서 항진균 활성을 갖는 스위트 플랙 추출물이외에, 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 부형제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 어류의 진균성 질병의 원인균인 수생곰팡이(Saprolegnia parasitica)에 대한 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 어류의 진균성 질병 치료제 조성물을 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 상기 수생곰팡이에 대한 항진균 활성을 시험하였다.

이하 첨부된 표에 의해 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 천연물질 스위트 플랙의 주요 성분은 표 1에 나타내었다.

[표 1] 천연물질인 스위트 플랙 추출물의 주요 성분

종류	주요성분
Sweet flag	tannin, vitamin C, 아코린(acorin), 팔미틴산(palmitic acid),녹말,eugenol, asarylaldehyde, asarone, shyobunone, epishyobunone, isoshyobunone, calamendiol, isocalamendiol, calacone, acorone, acoronene, acorenone, α-pinene, camphene, camphor, borneol, calamene, caryophyllene, elemene, curcumin, selinene, acolamone, isoacolamone.

이들 성분의 주요 작용에 대하여는 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 것과 같이 천연 물질 추출물의 주요성분들의 작용은 항진균 작용을 나타내는 물질들로 구성되어 있으며, 수생곰팡이에 대한 억제 및 제거 효과도 가지도록 조성되어 있다.

[표 2] 천연물질인 스위트 플랙 추출물의 주요작용

주요성분	주요작용
asarone(C₁₂H₁₆O₃)	강한 항바이러스 및 항균작용, 방부작용, 혈액순환 촉진, 혈압상승 작용, 강장작용
eugenol(C₁₀H₁₂O₂)	항산화작용,항균,살균,항곰팡이,이담작용,항바이러스, 방부작용

이밖에도 shyobunone, calamene, acorone 및 camphene 등의 주요한 성분들을 함유하고 있는데 일반적으로 정유의 항진균과 항균효과는 정유의 구성성분이 크게 페닐프로판, 테르핀(Terpine)으로 구성되는데 테르핀의 옥사이드, 에스테르, 알코올, 페놀, 알데히드, 케톤, 모노테르핀, 세스키트테르핀 등의 활성과 함량에 의해서 결정된다. 이러한 정유의 구성성분들은 단순한 분자구조가 아니라 매우 복잡한 구조를 갖고 있으며 항바이러스 작용과 항균, 항곰팡이 작용을 하는 것으로 밝혀지고 있다. 또한 정유성분들은 소화기관에 작용하여 이담, 강장작용은 물론 혈액의 원활한 작용을 도우며 신경을 안정시키는 효능을 갖는 것으로 알려지고 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 스위트 플랙(Sweet flag) 추출액의 제조

본 발명에 사용된 천연물질인 스위트 플랙의 추출물은 햇볕에 건조한 스위트 플랙 근경 및 뿌리줄기를 물, 에탄올, 이소프로필 알콜, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜로 이루어진 용매 군 중에서 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 얻은 추출물이다. 본 발명의 치료제 추출물은 위에서 얻어진 추출물의 1~50중량% 범위에 함유된다.

실시예 2: 병원성 수생곰팡이( Saprolegnia parasitica. )의 동정 및 계대배양

스위트 플랙 추출물의 항진균 효과 및 효능을 측정하기 위하여 수생곰팡이 병에 감염 의심되는 무지개 송어의 표피에서 수생곰팡이를 분리하였다. 분리한 수생곰팡이는 순수분리 과정을 통하여 Glucose 10g/L, Yeast extract 2.5g/L를 이용한 GY 배양액(broth)과 Glucose 10g/L, Yeast extract 2.5g/L, Agar 7.5g/L GY 배지(agar)를 이용하여 균주를 계대배양 하면서 각각의 실험에 사용하였다. 순수 분리된 병원성 수생곰팡이는 분리, 동정의뢰기관인 한국종균협회 소속 한국미생물보존센터(KCCM)에서 ITS-5.8S rDNA sequencing 분석을 통하여 Saprolegnia parasitica.(Gene Bank Data homology search result : 99%)로 동정, 분석하여 사용하였다.

우선, 천연물질 스위트 플랙 추출물과 말라카이트그린을 비교 실험에 사용하였고 24 well plate method 와 Diffusion method를 사용하여 천연물질의 항진균 효과 시험과 최소억제농도 (minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다.

실험예 1. 24 well plate method를 통한 스위트 플랙 추출물의 농도별 항진균 효과 검증

멸균된 24well plate에 GY agar를 일정량 넣고 마를 때 까지 기다린 후 그림1과 같은 방법으로 GY medium (Control), 천연물질 스위트 플랙 추출물을 10ppm, 1ppm, 0.1ppm 단위로 아래 그림과 같이 각 셀에 100㎕ 넣은 후 미리 GY agar plate에서 배양한 Saprolegnia parasitica.를 50㎖주사기를 이용하여 일정량의 균사를 채취한 후 각 셀에 넣고 antifungal activity test를 72시간 동안 실시하였다. 24시간 마다 사진 촬영을 하였다.(단위:ppm) 도 1에 20℃ 인큐베이터에서 24 well plate를 이용하여 항진균 활성을 나타내었다. 도 2에 천연물질 스위트 플랙 추출물의 24 well plate method을 사용하여 처리하였을 때의 수생곰팡이 성장억제 및 제거 효과에 대하여 나타내었다.

실험예 2. 24 well plate method를 통한 말라카이트 그린(MG)의 농도별 항진균 효과 검증

멸균된 24well plate에 GY agar를 일정량 넣고 마를 때 까지 기다린 후 그림1과 같은 방법으로 GY medium (Control),말라카이트 그린(MG)을 20ppm, 2ppm, 0.2ppm, 단위로 아래 그림과 같이 각 셀에 100㎕ 넣은 후 미리 GY agar plate에서 배양한 Saprolegnia parasitica.를 50㎖주사기를 이용하여 일정량의 균사를 채취한 후 각 셀에 넣고 antifungal activity test를 72시간 동안 실시하였다. 24시간 마다 사진 촬영을 하였다.(단위:ppm) 도 3에 말라카이트 그린(MG)을 24 well plate method을 사용하여 처리하였을 때의 수생곰팡이 성장억제 및 제거 효과에 대하여 나타내었다.

실험예 3. Diffusion plate method를 통한 항진균 효과 검증

GY agar plate를 만든후 가운데 부분을 지름이 5mm크기로 자른후 agar를 제거한다. 이 자른 부분에 20㎕의 천연물질 스위트 플랙 추출물 10ppm, Malachite green 20ppm, GY medium (Control)를 실험조건에 맞게 첨가한 후 평판배지에 미리 배양한 Saprolegnia parasitica.의 균사부분을 50㎖주사기를 이용하여 일정한 크기의 균사를 채취한 후 각 셀에 넣고 antifungal activity test를 48시간 동안 실시하였다. 24시간 마다 사진 촬영을 하였다.(단위:ppm) 도 4에 천연물질 스위트 플랙 추출물과 말라카이트 그린을 Diffusion plate method를 사용하여 처리하였을 때의 수생곰팡이 성장억제 및 제거 효과에 대하여 나타내었다.

표 3은 스위트 플랙 추출물과 말라카이트 그린(MG)의 항진균성 효과를 MIC를 기준으로 각각의 농도별 처리 후 항진균성을 높음, 중간, 낮음 단계로 나누어서 나타낸 것이다.

[표 3] 스위트 플랙 추출물과 말라카이트그린(MG) 항진균 효과

종류

항진균성 효과 (높음:+++ 중간:++ 낮음:+, 비측정:*)비고

Sweet flag 추출물 농도

0.1 ppm

1 ppm

10 ppm

20 ppm

30 ppm

40 ppm

50 ppm

60 ppm

70 ppm

80 ppm

90 ppm

100 ppm

200 ppm

효과

+

++

+++

MG 농도

0.2 ppm

2 ppm

20 ppm

*

효과

+

+++

상기 도 2, 도 3, 도 4 및 표 3의 결과들을 종합하여 볼 때, 천연물질 스위트 플랙 추출물과 말라카이트 그린의 수생곰팡이(Saprolegnia parasitica.)에 대한 항진균 효과 실험을 해 본 결과 well plate method와 Diffusion plate method에서 천연물질 스위트 플랙 추출물 10ppm에서 항진균성 효과가 가장 높았고 M.G과 비교해본 결과 M.G 20ppm와 거의 비슷한 효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 천연물질 스위트 플랙 추출물의 예상 MIC 농도는 10ppm, MG의 예상 MIC는 2ppm으로 사료된다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은, 어류의 진균성 질병 치료제로 천연물질 유래 스위트 플랙 추출물이 뛰어난 효과를 보임이 판명되었다. 이러한 발명은 천연물질을 이용한 추출물이 어류 양식 산업에서 진균성 질병 억제제로 사용되고 있는 화학제제들을 대체할 수 있을 것으로 사료되며, 경제적 부가가치도 높은 것으로 나타났다. 또한, 친환경적 어병 치료제로서 양식 어류 자체는 물론 양식어류를 환경적인 측면과 부존 자원량에 관한 면을 대비하여 보았을 때 차세대 생존 식량으로 대체할 먹거리로 대두되는 이 시점에 이러한 어류를 소비하는 대중들에게도 유해한 화학제제의 사용에 의한 어체 내 축적에 따른 문제점들을 일소할 수 있는 방법을 제시한 것이라 할 수 있다.

Claims

스위트 플랙(Sweet flag, Acorus calamus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 진균성 질병 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 어류의 진균성 질병의 원인균인 수생곰팡이(Saprolegnia parasitica)에 대한 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.