KR102164465B1

KR102164465B1 - 강황, 프로폴리스 및 잎새버섯 추출물을 포함하는 항염증성 천연 조성물

Info

Publication number: KR102164465B1
Application number: KR1020200029420A
Authority: KR
Inventors: 공상섭; 이승미; 조유인
Original assignee: 주식회사 셀틱; 공상섭
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-10-14

Abstract

본 발명은 강황, 프로폴리스 및 잎새버섯 추출물을 포함하는 항염증성 천연 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게 설명하자면, 강황 추출물 10~100㎍/㎖와 프로폴리스 추출물 0.5~1㎎/㎖ 및 잎새버섯 추출물 0.5~1㎎/㎖를 포함하여 구성되고, 생체 내에서 일산화질소(NO)의 생성을 효과적으로 억제하여 염증을 예방, 완화 또는 치료하는 효능이 있는 항염증성 천연 조성물에 관한 것이다.

Description

강황, 프로폴리스 및 잎새버섯 추출물을 포함하는 항염증성 천연 조성물{Anti-inflammatory natural composition including extract of Turmeric, Propolis and Grifola frondosa}

생체 내에서 발생하는 염증은 조직의 손상, 외부의 자극 또는 다양한 감염원에 대한 방어기전의 하나로서, 외부에서 들어온 해로운 물질이나 유기체 등과 같은 여러 요인에 의하여 생체 세포나 조직이 손상을 입거나 파괴되었을 때 그 손상을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키기 위하여 국소적으로 일어나는 면역반응이라 할 수 있다.

이러한 염증반응의 과정은 초기에는 대식세포가 상처부위로 모여들어 침입한 세균을 공격한 후, 상처부위에 혈장이 축적되고 혈류가 증가하면서 발열, 홍반, 부종, 통증 현상 등의 외적 증상이 발생하게 된다. 그러나 염증반응이 일정 수준 이상 진행되거나 만성화되면 만성염증과 같은 질병상태로 진행하게 되며, 심각한 이상 장애를 초래할 수 있다. 임상적으로 거의 모든 질환에서 염증반응이 관찰되며, 암 발생 과정(carcinogenesis)에서도 염증 반응과 관련된 효소들이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

최근에 밝혀진 바에 의하면, 체내 염증반응의 진행은 COX(cyclo oxygenase) 효소의 활성과 관련된다. 상기 COX 효소는 생체 내에 존재하는 프로스타그란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련하는 주 효소로서, 두 종류의 이성 효소인 COX-1과 COX-2가 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 COX-1은 위나 신장과 같은 조직에 일정하게 존재하며, 정상적인 항상성을 유지하는데 관여하는 반면, 상기 COX-2는 염증이나 기타 면역 반응 시 세포분열인자(mitogen)나 사이토카인류(cytokines)에 의해 세포 내에서 일시적이고 빠르게 발현되는 효소이다.

또 하나의 강력한 염증 매개물인 일산화질소(Nitric oxide, NO)는 NO 합성효소(NOS)에 의해 L-알지닌으로 부터 생성되며, UV와 같은 외부 스트레스나 엔도톡신 또는 사이토카인과 같은 물질에 의해 많은 종류의 세포에서 생성된다. 이러한 염증 자극인자들은 세포 내의 유도성 NOS(iNOS)의 발현을 증가시키고, 이를 통하여 세포내에서 NO 생성을 유도하여 대식세포를 활성화시킴으로써 염증반응을 일으킬 수 있다. 따라서 효과적인 염증 완화를 위하여 생체 내에서 NO의 생성을 억제할 수 있는 천연 조성물에 대한 연구가 진행되고 있다.

예를 들면, 특허 제10-1999842호(2019년 07월 08일)에는 지방유래 줄기세포 추출물과 사멸화 된 암세포 추출물 및 강황 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물이 제시되어 있고, 특허 제10-1165712호(2012년 07월 09일)에는 프로폴리스와 괴화(槐花) 추출물을 유효성분으로 하는 포함하는 소염 진통제 조성물이 제시되어 있다. 또한 공개특허 제10-2009-0116193호(2009년 11월 11일)에는 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물이 제시되어 있다.

특허 제10-1165712호(2012년 07월 09일) 특허 제10-1999842호(2019년 07월 08일) 공개특허 제10-2009-0116193호(2009년 11월 11일)

종래에 사용되고 있는 항염증성 약물들은 대부분 화학적으로 합성된 물질로서 스테로이드 제제와 비스테로이드 제제로 구분할 수 있다. 이중에서 스테로이드 제제는 잘 알려진 바와 같이, 효능을 우수하지만 부신 억제, 체액의 저류, 백내장 등의 부작용을 수반하게 되는 경우가 많고, 비스테로이드 제제는 상대적으로 부작용이 적지만 여전히 위장관 출혈 등의 부작용이 있어서 장기간 복용시에는 상당한 주의가 필요하다.

이에 본 발명의 목적은, 화학적 합성물질의 사용을 배제하고 천연물질을 사용함으로써 인체에 대한 부작용을 최소화하고, 특히 종래에 항염증 효능이 있는 것으로 알려진 천연물질들 중에서 이들을 각각 따로 사용하는 경우에 비해 함께 사용할 경우에 상승적인 항염증 내지 소염 효과를 나타내며, 나아가 우수한 저장 안정성을 확보할 수 있는 새로운 항염증성 천연 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 강황 추출물 10~100㎍/㎖와, 프로폴리스 추출물 0.5~1㎎/㎖, 및 잎새버섯 추출물 0.5~1㎎/㎖를 포함하여 구성되고, 생체 내에서 일산화질소(NO)의 생성을 억제하는 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항염증성 천연 조성물은, 강황 추출물 100㎍/㎖와, 프로폴리스 추출물 1㎎/㎖, 및 잎새버섯 추출물 1㎎/㎖를 포함하여 구성되고, 생체 내에서 일산화질소(NO)의 생성을 억제하는 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 강황 추출물과 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추출물은 각각 30% 주정 알코올을 추출용매로 사용하여 추출한 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 종래의 화학적 항염증 약물에서 나타나는 세포독성에 대한 위험이 거의 없고, 나아가 생체 내에서 강력한 염증 매개물인 일산화질소(NO)의 생성을 효과적으로 억제하는 효과가 있다.

또한 강황 추출물이나 프로폴리스 추출물 또는 잎새버섯 추출물을 각각 독립적으로 사용하는 경우에 비해 훨씬 우수한 상승적 항염증 효능을 나타내며, 특히 상기 강황 추출물 및 잎새버섯 추출물은 과다한 영양분으로 인해 쉽게 부패되는 문제점이 있는데 비해, 상기 프로폴리스 추출물의 항균력이 이러한 문제점을 보완함으로써 결과적으로 상기 조성물 전체의 저장 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 항염증성 천연 조성물에 대한 생체모델에서의 항염증 시험 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 바람직한 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 강황 추출물과 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추출물을 포함하여 구성된다. 상기 추출물들은 30% 주정 알코올을 추출용매로 사용하여 추출한 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항염증성 조성물을 구성하는 천연재료 3종의 특성에 대하여 살펴보면, 먼저 강황(姜黃)은 생강과에 속하는 다년초 초본으로 열대 및 아열대지방에서 주로 재배되어 왔으며, 해독작용이 있어서 전통적으로 염증 치료용 약용식물로 사용되어 왔다. 강황에 함유되어 있는 파이토 케미컬 중 하나인 커큐민(curcumin)은 폴리페놀 성분의 노란색 향신료로서, 항산화 작용과 더불어 항염증 효과와 치매 예방, 암 예방에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

상기 커큐민은 고체 상태에서는 케토(keto) 형으로, 액체 안에서는 에놀(enol) 형으로 존재한다. 커큐민이 액체 상태에서 에놀 형으로 존재하는 것은 케톤 그룹의 산소와 히드록시 그룹의 수소가 서로 수소결합을 형성해서 보다 안정된 상태로 존재 할 수 있기 때문이다. 커큐민은 IKK-β를 분자학적인 타깃으로 하여 여러 염증 전(pro-inflammatory) 자극제에 의해서 유도된 NF-κB 활성화를 억제 시킨다. 또한 핵심 키나제(kinase)인 IKK-β의 조절을 통하여 MyD88 의존성 신호전달 체계를 조절하여 염증반응을 약화 시킨다.

다음으로 프로폴리스(propolis)는 꿀벌이 생존과 번식을 위해 여러 식물에서 뽑아낸 수지(樹脂)와 같은 물질에다 자신의 침과 효소 등을 섞어서 만들어내는 천연 항생 물질로서, 러시안 페니실린 또는 천연 페니실린이라고도 한다. 꿀벌은 벌집의 틈이 난 곳에 프로폴리스를 발라 벌집의 소독 및 살균 작용을 하여 병균이나 바이러스를 막고, 산란과 성장, 꿀의 숙성과 보관 등에 알맞은 서식처를 유지한다.

이러한 프로폴리스는 구성성분으로서 주로 유기물과 미네랄(무기염류)을 포함하고 있으며, 그 외에도 100 여종이 넘는 다양한 유효성분을 포함하고 있다. 이러한 유호성분들 중에서 특히 미네랄, 비타민, 아미노산, 지방, 유기산, 플라보노이드 등은 세포 대사 및 면역력 증강 등에 중요한 역할을 한다.

수만 마리의 벌들이 살고 있는 벌집은 그 내부 온도가 34℃ 전후로 여러 균이 서식하기에 적합한 조건인데도 불구하고 항상 무균 상태를 유지하고 있는데, 이는 프로폴리스가 세균의 발생 및 증식을 억제하는 효과를 가지고 있기 때문인 것으로 알려져 있다. 여러 연구 결과, 프로폴리스는 고초균, 포도상구균, 백선균, 대장균, 트리코모나스균, 살모네라균 등 다양한 세균에 대한 항균 효과가 입증되어 있다.

또한, 프로폴리스는 염증을 일으키는 성분인 프로스타그란딘을 만들어내는 효소를 절반까지 줄임으로써 탁월한 항염증 효과를 가지기 때문에 방사선 장애, 궤양성 염증, 화상, 알러지, 아토피성 피부염, 피부종양, 사마귀, 교통상해 피부, 여드름, 습진 및 무좀 치료 등에 널리 이용되고 있다.

이 외에도, 프로폴리스는 대식세포(macrophage)를 활성화하는 효과가 있어 체내의 면역기능을 강화시키며, 프로폴리스의 주활성 성분인 플라보노이드는 활성 산소를 억제하는 항산화 작용 및 과산화물 생성 억제작용이 뛰어나 노화 및 암 발생을 억제하는 데 효과적이다.

마지막으로 잎새버섯(Grifola frondosa)은 민주름목 구멍장이 버섯과에 속하는 버섯으로서, 가을에 졸참나무, 물푸레나무의 뿌리 근처에 사물 기생하여 다발로 발생하며, 한국, 동아시아, 유럽, 북미 등에 분포되어 있다. 이러한 잎새버섯은 뭉툭한 대에서 무수한 가지꼴로 갈라지며 그 위에 다소 두껍고 구두칼형의 작은 갓을 형성한다.

잎새버섯은 갓의 크기가 2~5cm이고 두께는 2~4mm이며, 전체의 크기는 15~30cm이다. 표면은 초기에 흑색이나 후에 옅은 흑갈색으로 되고, 그 위에 불완전한 둥근 무늬가 있으며, 조직은 부드럽고 백색을 띤다. 대의 기부(基部)는 굵고 바로 윗부분에서 여러 개의 분지로 갈라져 산호모양을 이루며, 조직은 단단하며 충실하나 잘 부서진다.

잎새버섯은 식용이면서 약리작용이 뛰어난 기능성 버섯으로 인체의 면역력을 증가시키고, 종양 억제율이 우수하다고 알려져 있다. 잎새버섯은 또한 면역에 관여하는 자연 살해세포(natural killer cell) 및 대식세포(macrophage)의 활성을 상승시켜 암을 저해하는데 효과가 있다고 보고되고 있다.

본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 강황 추출물 10~100㎍/㎖와 프로폴리스 추출물 0.5~1㎎/㎖ 및 잎새버섯 추출물 0.5~1㎎/㎖를 포함하여 구성된다. 만일 강황 추출물의 농도가 10㎍/㎖ 미만이거나 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추출물의 농도가 각각 0.5㎎/㎖ 미만이면, 산업적으로 유용한 항염증 효능을 발휘할 수 없다. 반대로, 강황 추출물의 농도가 100㎍/㎖를 초과하거나 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추출물의 농도가 각각 1㎎/㎖를 초과하면, 세포독성이 높아져서 장기 복용시 부작용을 나타낼 우려가 있다.

본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 상기 천연 추출물 3종이 함께 상승적으로 작용하여 생체 내에서 NO의 생성을 억제하거나, 이미 생성된 NO를 분해하며, 나아가 TNF-α, TGF-β, IL-10등과 같은 염증성 단백질의 발현을 억제함으로써 함으로써 이들을 각각 독립적으로 사용하는 경우에 비해 효과적인 항염증 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 상기 항염증성 천연 조성물은, 생체 내 항산화 기능을 활성화하여 염증반응을 매개하는 각종 염증성 단백질과 일산화질소 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 활성을 저해할 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 생체 내 활성산소인 O2-(superoxide) 소거에 관여하는 SOD(superoxide dismutase) 효소의 활성을 촉진시킴으로써 항산화 기능을 나타낼 수 있다.

한편, 상기 천연 추출물 3종 중 강황 추출물과 잎새버섯 추출물은 과다한 영양분을 포함하고 있어서 이들을 독립적으로 사용할 경우에는 쉽게 부패되는 문제점이 있다. 반면, 프로폴리스 추출물은 앞서 설명한 바와 같이 그 자체가 상당한 항균력을 가지고 있기 때문에 상기 강황 추출물과 잎새버섯 추출물의 부패를 방지할 수 있고, 따라서 본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 우수한 저장 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 산업적으로 제약 분야에서 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화 될 수 있고, 이때 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 숙련된 전문가들에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물은, 산업적으로 화장품 등 의약외품의 유효성분으로 사용될 수도 있다. 상기 의약외품은 예컨대 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 손체척제, 가습기 첨가제, 필터 충진제 등을 포함한다. 이들 의약외품은 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있고, 유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

이하, 몇 가지 시험예를 통해서 본 발명에 따른 항염증성 천연 조성물의 효능을 구체적으로 설명한다.

1. 각 추출물에 대한 세포독성 시험(MTT assay)

본 발명의 항염증성 천연 조성물을 구성하는 3종의 천연 추출물, 즉 강황 추출물, 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추출물에 대하여 각각 세포독성을 시험하였다. 시험에 사용한 상기 추출물 3종은 각각 강원도 원주시 소재 ㈜단정바이오의 제품을 구매하여 사용하였다. 상기 ㈜단정바이오의 제품은 모두 30% 주정 알코올을 추출용매로 사용하여 추출한 것이다.

상기 추출물 3종을 각각 멸균된 0.45㎛ 및 0.2㎛ 실린지 필터(syringe filter)로 2회 여과하고, 각 추출물에 대하여 농도가 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 1㎎/㎖인 시료를 준비한 다음, 각 시료에 대하여 MTT assay를 실시하였다. MTT assay에 사용된 Raw 264.7 세포는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양 하였다. MTT assay는 WST-8 Cell Viability Assay Kit(Qunati-MAX™)로 수행하였으며, Microplate reader를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

이와 같이 상기 추출물 3종에 대하여 그 농도를 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 1㎎/㎖ 로 변화시키면서 MTT assay 방법에 따라 세포생존율(%)을 산출하고, 그 결과를 다음 [표 1]에 수록하였다.

구분	시료의 농도
구분	1㎍/㎖	10㎍/㎖	100㎍/㎖	1㎎/㎖
강황 추출물	99.83%	99.85%	99.62%	27.52%
프로폴리스 추출물	99.63%	99.77%	99.66%	98.01%
잎새버섯 추출물	99.34%	98.74%	98.12%	96.23%

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 강황 추출물은 농도가 100㎍/㎖에 이를 때까지 유의할 만한 세포독성을 나타내지 않았으나, 1㎎/㎖ 농도에서는 세포생존율이 27.52%로 급격하게 낮아졌다. 반면, 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추출물은 1㎎/㎖ 농도까지 세포독성이 거의 없거나, 아주 미미한 것으로 확인 되었다.

2. 각 추출물에 대한 항염증 시험(NO assay)

상기 추출물 3종에 대한 농도별 항염증 시험으로서 NO assay를 진행 하였다. NO(Nitric oxide)는 혈관 확장, 평활근 수축, 신경신호 전달, 혈소판 응집억제, 면역조절 등과 같은 다양한 생물학적 기능을 조절하는 생체 내에 널리 분포하는 유리기(free radical) 로서, 항암, 항균작용 및 다양한 염증반응에 관여하며, 체내 항상성을 유지한다. NO가 과도하게 생성되면, 염증반응의 항진, 암화촉진 등의 병태를 유발할 수 있다고 알려져 있으며 염증반응의 지표로 사용된다.

상기 1.항의 세포독성 시험의 결과, 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위 내에서 상기 추출물 3종에 대한 시료를 준비하고, 24시간 동안 배양한 Raw 264.7 세포에다 상기 시료들을 각각 염증 유발물질인 Lipopoly saccharide(LPS) 1㎍/㎖와 함께 처리한 다음, 48시간 동안 배양하였다.

양성대조군에는 LPS만 처리하여 염증을 유도 하였고, 음성대조군에는 같은 양의 증류수만 처리하여 동일한 방법으로 48시간 동안 배양 하였다. 각 배양물에서 상등액을 취하여 Griess reagent system(G2930 promega)으로 NO의 농도를 측정하고, 그 결과를 다음 [ 표 2 ]에 수록하였다.

구 분		음성대조군	양성대조군	시료의 농도
구 분		음성대조군	양성대조군	1㎍/㎖	10㎍/㎖	100㎍/㎖
강황 추출물	NO 농도(μM)	7.28	25.95	23.46	17.53	12.34
강황 추출물	NO 생성율(%)	28.06	100	90.4	67.57	47.56

구 분		음성대조군	양성대조군	시료의 농도
구 분		음성대조군	양성대조군	100㎍/㎖	500㎍/㎖	1㎎/㎖
프로폴리스 추출물	NO 농도(μM)	7.92	25.78	22.22	18.33	13.45
프로폴리스 추출물	NO 생성율(%)	30.73	100	86.22	71.11	52.18
잎새버섯 추출물	NO 농도(μM)	7.77	25.32	20.89	18.41	15.74
잎새버섯 추출물	NO 생성율(%)	30.68	100	82.49	72.7	62.15

상기 [표 2] 및 [표 3]의 결과로부터, 강황 추출물은 10~100㎍/㎖의 농도범위에서, 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추물출은 각각 0.5~1㎎/㎖의 농도범위에서 유의할 만한 항염증 효능을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 다만, 각 음성대조군과 양성대조군의 수치에서 약간의 차이가 있는 것은 실험오차인 것으로 추측된다.

3. 본 발명의 조성물에 대한 항염증 시험(NO assay)

상기 추출물 3종의 농도가 다음과 같은 비율로 포함된 본 발명의 시료 1 내지 시료 3 조성물을 준비하고, 상기 시료 1 내지 시료 3 조성물에 대하여 상기 시험예 2와 같은 방법으로 NO assay를 진행한 다음, 그 결과를 다음 [표 4]에 수록하였다.

① 시료 1 조성물 ; 강황 추출물 100㎍/㎖와 프로폴리스 추출물 1㎎/㎖ 및 잎새버섯 추출물 1㎎/㎖

② 시료 2 조성물 ; 강황 추출물 50㎍/㎖과 프로폴리스 추출물 750㎍/㎖ 및 잎새버섯 추출물 750㎍/㎖

③ 시료 3 조성물 ; 강황 추출물 10㎍/㎖과 프로폴리스 추출물 500㎍/㎖ 및 잎새버섯 추출물 500㎍/㎖

구분	음성대조군	양성대조군	시료 1	시료 2	시료 3
NO 농도(μM)	7.61	25.87	9.87	12.74	15.51
NO 생성율(%)	29.42	100.00	38.75	49.25	59.95

상기 [표 4]의 결과로부터 본 발명의 시료 1 내지 시료 3 조성물은 NO 농도의 감소율이 각각 38.75%, 49.25% 및 59.95% 로서, 상기 천연 추출물 3종을 동일한 농도로 각각 사용한 상기 [표 2] 및 [표 3]의 결과에 비해 NO의 발생을 유의미 하게 억제하는 효과가 있는 것으로 확인 하였다.

4. 본 발명의 조성물에 대한 염증성 단백질 분석 시험(Cytokine q-PCR)

상기 시료 1 내지 시료 3 조성물에 대하여 각각 염증 유발을 억제하는 효능을 시험하기 위하여 염증성 단백질 유전자 발현량을 측정 하였다. 24시간 동안 배양한 RAW264.7 세포에다 상기 시료 1 내지 시료 3 조성물과 1㎍/㎖ Lipo poly saccharide(LPS)를 동시 처리하여 18시간 배양하였다.

배양 후 세포를 회수하여 RNA extraction kit(Ribospin™Ⅱ, Geneall)를 이용해 RNA를 추출한 뒤 Taqman assay(Thermofisher scientific)로 매뉴얼에 따라 qPCR을 진행하여 유전자 발현량을 측정하고, 그 결과를 다음 [표 4]에 수록하였다.

다음 [표 5]에서, TNF-α, IL-1β, IL-6은 염증성 단백질로 알려진 타겟 유전자들이고, C_T는 연쇄중합반응의 cycle값이며, RQ(relative quantification)는 음성대조군의 C_T값에 대한 상대적 비율을 나타낸 것이다. 상기 RQ값은 2^(-ΔΔCt) 공식으로 계산한 것이다.

- ΔC_T = 타겟 유전자의 C_T값 - 하우스키핑 유전자의 C_T값

- ΔΔC_T = 음성대조군의 ΔC_T값 - 타겟 유전자의 ΔC_T값

Cytokine q-PCR		음성대조군	양성대조군	시료 1	시료 2	시료 3
TNF-α	C_T	27.168	25.405	26.934	26.384	26.192
TNF-α	RQ	1	6.939	3.095	3.646	4.618
IL-1β	C_T	25.954	24.136	25.892	24.787	24.455
IL-1β	RQ	1	3.013	1.612	2.046	2.302
IL-6	C_T	27.141	24.983	26.697	25.894	25.496
IL-6	RQ	1	7.411	2.91	3.934	4.112

상기 [표 5]에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 염증성 단백질로 알려진 타겟 유전자들의 발현량을 유의미 하게 감소시킨 것으로 확인되었다.

5. 본 발명의 조성물에 대한 항산화 시험(SOD-like activity assay)

항산화 기능의 활성은 염증반응을 매개하는 각종 염증성 단백질과 NO 및 PGE₂의 활성을 저해한다. 생체 내 활성산소 O2-(superoxide) 소거에 관여하는 SOD(superoxide dismutase) 효소는 생성된 활성산소의 체내 산화현상을 억제한다.

따라서 상기 시료 1 내지 시료 3 조성물에 대한 SOD 유사활성을 통하여 항산화 효능을 측정하였다. 산화적 스트레스와 염증반응과 관련하여 항산화 반응을 확인하는 것은 염증반응의 지표로 적절하게 사용 될 수 있다.

24시간 동안 배양한 RAW264.7 세포에 상기 시료 1 내지 시료 3 조성물과 1㎍/㎖ Lipo poly saccharide(LPS)를 동시 처리하여 48시간 배양하였다. 배양한 세포를 회수하여 용해시킨 뒤 EZ-SOD Assay kit(DG-SOD400, Dogen) 매뉴얼에 따라 시약을 반응 시켰다.

이어서 Microplate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 다음 [표 6]에 수록하였다. [표 6]에서 ‘저해율(%)’은 SOD 효소의 활성도를 수치화 한 것으로, 각 시료에 대한 흡광도(OD값)를 단백질 정량값(standard SOD inhibition enzyme)과 대조하여 %로 환산한 값이다.

SOD-Like assay	음성대조군	양성대조군	시료 1	시료 2	시료 3
저해율(%)	69.84	41.65	79.41	72.64	65.87

상기 [표 6]의 결과에 의해서 본 발명에 따른 조성물은 유의미한 항산화 기능을 갖는 것으로 확인 되었다.

6. 본 발명의 조성물에 대한 생체모델에서의 항염증 효과 시험

상기 시료 1 조성물에 대하여 동물을 대상으로 생체 내에서의 항염증 효과를 시험하였다. 상기 시험은 로컬 동물병원에서 자연 발생적인 염증 질환을 가진 애완견 3개체(개체 A, B, C)를 대상으로 실시하였으며, 각 시험대상 동물의 보호자 동의하에 담당 수의사의 판단에 따라 진행하였다. 개체 A는 2008년생 ‘시츄’ 이고, 개체 B는 2009년생 ‘몰티즈’ 이며, 개체 C는 2011년생 ‘푸들’ 이었다.

시험 방식은 상기 개체 A, B, C에 대하여 상기 시료 1 조성물을 1일 2회(아침, 저녁), 10 방울씩(약 1~2㎖ 내외) 경구투여 하였으며, 경구투여 전 혈액검사를 통해 0day 염증수치를 확보 하였다. 혈액검사 결과, 염증수치에 대한 지표로는CRP(C-reactive protein) 수치를 측정 하였다. 경구투여 개시 이후, 2주, 4주, 6주, 8주가 경과한 시점에서 각각 혈액검사를 통하여 염증수치를 확보하고, 그 결과는 첨부 도 1에 그래프로 도시하였다.

첨부 도 1의 그래프에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 시험대상 개체 A, B, C에서 모두 유의미하게 염증수치가 감소 된 것으로 나타났으며, 특히 초기 염증이 가장 심했던 개체 A에서 가장 드라마틱한 결과를 보여 주었다.

Claims

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강황 추출물 100㎍/㎖와 프로폴리스 추출물 1㎎/㎖ 및 잎새버섯 추출물 1㎎/㎖를 포함하여 구성되는 것으로, 상기 강황 추출물과 프로폴리스 추출물 및 잎새버섯 추출물은 각각 30% 주정 알코올을 추출용매로 사용하여 추출되고, 생체 내에서 일산화질소(NO)의 생성을 억제하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 항염증성 천연 조성물.
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