KR20090116193A

KR20090116193A - 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환치료 및 예방용 약학조성물

Info

Publication number: KR20090116193A
Application number: KR1020080041985A
Authority: KR
Inventors: 김정애; 이종숙; 박수영; 이재성
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2008-05-06
Publication date: 2009-11-11

Abstract

본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 잎새버섯 추출물은 부작용이 적으면서도 HT-29 장상피유래세포에 대한 백혈구의 유착을 방지하고, TNF-α유도 MCP-1 및 IL-8 mRNA 발현을 억제하며, TNF-α유도 MCP-1 단백질 분비를 감소시킴으로써 신뢰할 수 있는 염증성 장질환의 치료제로 사용가능하다.

잎새버섯, 염증성 장질환

Description

잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating and preventing inflammatory bowel disease comprising Grifola frondosa extract}

본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 임상적으로 유사하면서도 조직학적 소견과 내시경 및 면역학적 측면에서 서로 다른 염증성 대장염 및 크론병의 두 가지 질환으로 분류된다.

크론병 환자의 약 70%는 수술적 치료를 받고 그 중 40-50%는 재수술을 받고 있는 반면, 염증성 대장염 환자의 경우는 20-25% 정도의 환자가 수술요법을 받는 것으로　알려져 있다. 그러나, 이 두 가지 질환 모두 그 병인에 대해서는 아직도 잘 알려져 있지 않기 때문에 약물요법은 매우 제한적이며, 염증의 일반 과정에 대한 억제 정도로 이루어지고 있다.

최근 들어 만성 장염에서 면역세포와 사이토카인 및 키모카인들의 역할에 대한 연구가 활성화되고 있어, 이들 인자의 제어를 통한 치료에 초점이 맞추어 지고 있다. 최근 염증 매개인자에 대한 항체를 이용한 치료가 시도되고 있으나, 아직 효과적인 치료제는 개발되지 못한 실정이다.

염증 매개인자들은 장관 조직의 파괴를 촉진하는데, 특히, 화학주성인자(chemoattractant) 역할을 하는 키모카인들은 호중성 백혈구(neutrophil) 등의 다핵성 백혈구를 활성화시키고 염증 병소로 백혈구 이주에 필요한 유착분자(adhesion molecule)의 발현을 증가시킨다.

IBD에 관련된 키모카인으로는 단핵구 화학주성 단백질-1(monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1), 대식세포 염증성 단백질-1α(macrophage inflammatory protein-1α; MIP-1α), 인터페론-유도성 단백질 10(interferon-inducible protein 10; IP 10), 에오탁신(eotaxin) 및 인터루킨-8(interleukin-8; IL-8) 등이 있다.

특히, IL-8은 염증성 대장염 및 크론병 환자 모두 염증 병소의 유무와 관계없이 장 점막에 그 발현이 매우 증가되어 있으며, IL-8을 생성하는 세포의 수가 많을수록 IBD에서 염증의 정도가 심하게 나타나는 것으로 보고되었다.

한편, 현재 염증성 장질환 치료제로는 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid; 5-ASA) 계통 약물 예를들어, 설파살라진 등을 이용하거나 스테로이드류의 면역억제제를 사용하고 있다.

설파살라진은 복부허실(fullness), 두통, 발진, 간질환, 백혈구 감소증, 무과립구증, 남성 불임 등과 같은 부작용 또는 역효과를 일으키기 쉽다. 또한, 설파살라진이 장의 환부를 절개한 환자 또는 차도가 있는 환자에게 충분한 재발 억제 효과가 있는지는 불분명하다.

스테로이드류의 면역억제제는 부신피질 스테로이드로서, 단기적인 효과는 인정받고 있지만, 장기적인 예후를 향상시킬 수는 없으며, 유도된 감염성 질환, 2차 부신피질 부전증, 소화성 궤양, 당뇨병, 정신장애, 스테로이드성 신장병 등과 같은 부작용의 측면에서 단지 급성인 경우에만 사용되어야 하는 한계가 있다.

따라서, 염증성 장질환에 대해 아직까지 신뢰할 만한 치료요법은 없으며 이러한 질환에 대해 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있다.

한편, 버섯은 담자균과 자낭균 중 자실체를 형성하는 고등 균류로서 풍부한 영양소를 골고루 함유하고 있고 독특한 향기와 맛을 가지는 동시에 식용 및 약용으로 널리 이용되어 최근 각광받고 있는 기능성 식품 중의 하나이다.

이러한 버섯은 당질, 단백질, 비타민 및 무기질 등의 영양소가 풍부할 뿐만 아니라, 자실체 및 균사체의 추출물이 체질개선이나 각종 병의 예방과 치료에 효과가 있는 것으로 밝혀져 건강식품이나 의약품으로서의 용도가 크게 증가하고 있다.

이 중 잎새버섯(Grifola frondosa(Dicks. ex Fr.) S.F.Gray)은 민주름목 구멍장이버섯과(Polyporaceae)에 속하는 버섯으로서 가을에 졸참나무, 물푸레나무의 뿌리 근처에 사물 기생하여 다발로 발생하는 백색 목재부후균으로, 한국, 동아시아, 유럽, 북미 등에 분포되어 있다.

이러한 잎새버섯은 뭉툭한 대에서 무수한 가지꼴로 갈라지며 그 위에 다소 두껍고 구두칼형의 작은 갓을 형성한다. 갓의 크기는 2-5cm이고 두께는 2-4mm이며, 전체의 크기는 15-30cm이다. 표면은 초기에 흑색이나 후에 옅은 흑갈색으로 되고 그 위에 불완전한 둥근 무늬가 있으며, 조직은 부드럽고 백색을 띤다.

대의 기부(基部)는 굵고 바로 윗부분에서 여러 개의 분지로 갈라져 산호모양을 이루며 조직은 단단하며 충실하나 잘 부서진다. 이러한 잎새버섯은 식용 담자균류의 일종으로 향과 맛이 좋아서 일본에서는 송이버섯과 더불어 고급버섯으로 취급되고 있다.

이러한 잎새버섯에 대한 연구는 현재 균사체를 위주로 한 연구가 일부 진행되고 있을 뿐이다. 더구나 잎새버섯의 염증성 장질환 예방 또는 치료 효과에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 부작용이 적으면서도 신뢰할 수 있는 염증성 장질환 치료제를 개발하고자 하는 데에 그 목적이 있다.

이에, 본 발명자들은 잎새버섯 추출물이 HT-29 장상피유래세포에 대한 백혈구의 유착을 방지하고, TNF-α유도 MCP-1 및 IL-8 mRNA 발현을 억제하며, TNF-α유도 MCP-1 단백질 분비를 감소시키는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 잎새버섯 추출물은 염증성 장질환의 인비트로 모델인 장상피유래세포 HT-29에 대한 백혈구의 부착을 현저히 억제할 뿐 아니라, 장상피유래세포 HT-29에서 TNF-α에 의한 MCP-1 및 IL-8 mRNA의 발현을 억제하며, TNF-α에 의한 MCP-1 단백질의 분비를 현저히 감소시킴으로써 염증성 장질환의 치료 및 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다는 새로운 용도를 발견하여 이루어졌다.

본 발명의 약학조성물은 잎새버섯 추출물, 보다 바람직하게는 잎새버섯 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하고, 상기 잎새버섯 추출물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 20 내지 50 중량부로 함유되는 것이 바람직하다.

만약, 잎새버섯 추출물이 상기 범위를 벗어나 소량으로 포함되면 염증성 장질환의 치료 및 예방 효과가 떨어지며, 상기 범위를 벗어나 과량으로 포함되면 용 량에 비해 염증성 장질환의 치료 및 예방 효과가 둔화될 것이며, 잎새버섯 추출물의 부작용도 야기될 수 있다.

또한, 잎새버섯 추출물은 잎새버섯을 C1 내지 C4의 알코올. C1 내지 C4의 알코올 수용액 또는 물을 이용하여 추출할 수 있다.

또한, 본 발명의 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 잎새버섯 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 잎새버섯 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 잎새버섯 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 없으며, 본 발명의 잎새버섯 추출물을 랫트에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)이 적어도 잎새버섯 추출물 10g/㎏이상인 안전한 물질로 판명되어 그 안정성이 확보되어 있다.

또한, 본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 건강식품은 잎새버섯 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 잎새버섯 추출물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 부작용이 적으면서도 HT-29 장상피유래세포에 대한 백혈구의 유착을 방지하고, TNF-α유도 MCP-1 및 IL-8 mRNA 발현을 억제하며, TNF-α유도 MCP-1 단백질 분비를 감소시키는 등 염증성 장질환 모델에서 높은 치료효과를 나타냄으로써 신뢰할 수 있는 염증성 장질환의 치료제로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 잎새버섯 추출물 제조

잎새버섯 추출물을 얻기 위하여, 일본 동경의 지바현 시장에서 구입한 건조된 잎새버섯 자실체를 잘게 분쇄한 다음, 각각 물을 용매로 이용하여 추출하였다.

먼저, 분쇄된 잎새버섯 시료에 20중량배량의 물을 가한 다음, 40℃로 조절된 항온 수조에서 12시간 동안 3회에 걸쳐 반복하여 추출하였다. 이 추출액을 여과한 다음, 회전식 농축기(rotary evaporator, EYELA Co., Japan)를 이용하여 용매를 제거하였다. 다음으로, 용매가 제거된 시료를 증류수로 용해하고 동결건조하여 잎새버섯 추출물을 얻었다.

< 실시예 2> 세포 배양

이후 실험에서 사용될 세포들의 배양을 하기와 같이 수행하였다.

장상피유래세포 HT-29는 37℃, 5% CO₂/95% 공기 중에서 10% FBS 및 200IU/ml 페니실린을 함유한 RPMI1640 배지에서 배양되었다. 배양 배지는 하루 걸러 교체되었다. 컨플루언트하게 배양된 후, 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 트립신 처리한 후 서브컬처하였다.

U937 인간 백혈병 세포는 10% FBS, 1mM 소듐 피루베이트, 200IU/ml 페니실린 및 200㎍/ml 스트렙토마이신을 함유한 RPMI1640 배지에서 배양되었다. 배양 배지는 하루 걸러 교체되었다. 컨플루언트하게 배양된 후, 1:5 비율로 스플리팅하여 서브컬처하였다.

< 실시예 3> 세포 생존율 검토( MTT 분석)

MTT 염색법(Loosdrecht et al., J Immunol Methods, 174(1-2): 311-320, 1994)을 이용하여 HT-29 세포 생존율을 검토하였다. 4 내지 5일 배양된 세포를 96웰 플레이트에 1X10⁵ cells/cm²의 농도로 분주하였다. 각 웰의 배지 부피는 200㎕로 하였다.

대조군 실험에 사용된 세포에는 동일 배지에서 약물이 처리되지 않은 용매를 첨가하면서 배양하였다. 세포들은 실시예 1에서 준비된 잎새버섯 추출물 및 10ng/ml의 TNF-α로 24시간 동안 전처리된 후, 10㎕의 MTT(5g MTT/ℓ in PBS)를 가하고 4시간 동안 배양하였다.

200㎕의 DMSO를 각 배양물에 가하고 피펫팅하여 환원 MTT 결정을 용해하였다. 상대적인 세포 생존율은 540 nm 필터를 이용하여 마이크로플레이트리 더(Molecular Devices, Menlo Park, CA)로 스캔하여 결정하였다.

그 결과, 도 1과 같이 잎새버섯 추출물의 농도가 100㎍/ml로 증가될 때까지 세포생존율에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

< 실시예 4> TNF -α ELISA

24웰 플레이트에서 배양된 U937 세포를 48시간 동안 TPA 20 ng/ml로 처리하였다. 세포는 실시예 1에서 준비된 잎새버섯 추출물 및 20mM 5-ASA로 24시간 동안 전처리된 후, 100ng/ml LPS로 18시간 동안 더 배양되었다.

세포 상등액으로 분비된 TNF-α 단백질 양은 TNF-α ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 희석된 RD1F(50 ㎕) 및 배양 상등액(200 ㎕)을 실온에서 2시간 동안 항마우스 TNF-α 단일클론 항체로 코팅된 96웰 ELISA 플레이트에 첨가한 후, 세정 완충액으로 4번 세정하였다.

그후, 각 웰에 TNF-α 컨쥬게이트를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 4번 세정하고 기질 용액(혼합된 컬러시료 A 및 B)로 실온에서 20분 동안 배양하였다. 450nm로 고정된 마이크로플레이트 리더를 이용하여 30분 이내 흡광도를 측정하여 정량하였다.

그 결과, 도 2와 같이 U937 세포에서 LPS 자극에 의해 TNF-α가 분비되지만, 잎새버섯 추출물은 이렇게 분비되는 TNF-α 단백질 양을 감소시켰다.

< 실시예 5> 시토크롬 환원 에세이

시토크롬 c 환원 양은 세포 내에서 생성된 수퍼옥사이드의 세포내 방출을 측정하기 위하여 검토하였다. 이전에 알려진 방법(Infect . Immun ., 75, 4030-4039, 2007)을 사용하여, HT-29 세포(1X10⁵ 세포/웰)를 96웰 배양 플레이트에서 하루종일 배양시켜 컨플루언트하게 자라게 하고 24시간 후, 배지를 신선한 혈청 프리 배지로 교체하고 10ng/ml의 TNF-α를 3시간 동안 처리하였다. 이때, TNF-α 처리 1시간 전에 실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물을 전처리하였다.

일정시간의 자극 후, 세포를 PBS로 세정하고, 80μM 시토크롬 c(Sigma)를 함유하는 PBS를 각 웰에 가하고 37℃에서 15분 동안 배양한 후, 0℃에 보관하였다. 동일한 혼합물의 다른 세트를 블랭크로 이용하기 위해 0℃에서 보존되었다. SOD는 40㎍/ml의 농도로 참고웰에 가해졌다.

HT-29 세포에서 TNF-α(10ng/ml)의 최대 ROS 생성시기가 6시간이므로, TNF-α 자극 6시간 후 시토크롬 c 환원 능력에 대한 잎새버섯 추출물의 효과를 검토하였다. 그후, 블랭크를 기준으로 이용하여 분광광도계(UV-1601; Shimadzu, Japan)로 550nm에서 흡광도를 관찰하였다.

유리된 수퍼옥사이드 음이온의 양은 시토크롬 c 환원 능력에 대한 억제 정도에 의해 측정되었고, 시간에 대한 nmol/ 1X10⁵ 세포/unit로서 표현되었다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 TNF-α에 의해 증가되는 활성산소종이 잎새버섯 추출물에 의해 유의성 있게 억제되는 것을 확인하였다.

< 실시예 6> 유착증 에세이

37℃에서 30분 동안 2',7'-비스(2-카르복시에틸)-5(6)-카르복시플루오레세인 아세톡시메틸 에스테르(BCECF/AM, 10㎍/ml)로 표식된 인간 백혈병 세포 U937 세포 를 이용하여 단핵백혈구(monocyte) 유착을 검토하였다.

컨플루언트하게 48웰 플레이트에서 배양된 HT-29 세포는 1시간 동안 실시예 1에서 제조된 잎새버섯 추출물 및 20mM 5-ASA로 전처리된 후, TNF-α(10ng/ml)를 첨가하여 3시간 더 배양하였다.

그후, HT-29 세포는 37℃에서 1시간 동안 BCECF/AM-전표식된 U937 세포(1X10⁶ cells/well)로 공배양되었다. 유착되지 않은 U937 세포는 제거되고 PBS로 1회 세정되었다.

얻어진 일정 세포는 디지털 카메라(TMS; Nikon, Japan)에 연결된 역광형광현미경(TE2000-U; Nikon, Japan)에 의해 이미지화 되었다. 다른 세포는 0.1 mol/ℓ 트리스에 용해된 0.1% 트립톤 X-100에서 용해되었다.

485 nm에서 여기 및 520 nm에서 발광을 이용하여 플루오스타 옵티마 마이크로플레이트 리더(BMG LABTECH GmbH, Germany)로 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 3시간 동안의 TNF-α의 자극에 의해 장 상피유래세포 HT-29에 대한 U937 유착이 유의적으로 증가되었고, 잎새버섯 추출물 처리에 의해 TNF-α 유도성 유착이 억제되었다.

< 실시예 7> 이중 발광효소 분석( dual - luciferase assay )

T-75 플라스크에서 HT-29 세포를 배양하고 24시간 후, GeneJammer 트랜스펙션 시약(Staratagene, CA, USA)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 형질감염 대조군으로 0.2㎍/ml의 pRL-TK(renilla luciferase)와 결합된 1㎍/ml의 NF-kB 발광효소 구조(firefly luciferase)로 형질감염되었다.

세포들은 37℃에서 3시간 동안 형질감염 혼합물로 배양되었고, 이때 동부피의 RPMI1640 배양 배지를 첨가하였다. 세포를 37℃에서 밤새토록 배양한 후, 24웰 플레이트로 옮겼다. 24시간 후, 세포는 실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 및 20mM 5-ASA로 1시간 동안 전처리되었고, 그후 10ng/ml TNF-α로 3시간 더 배양되었다.

정해진 시간 후, 세포를 PBS로 세정한 후, 동결 및 해동 주기에 의해 수동 라이시스 완충액(passive lysis buffer; Promega Corporation, Madison, WI, USA)로 용해되었다.

그후, 세포를 부드럽게 긁어 라이세이트를 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 파이어플라이 발광효소(firefly luciferase) 및 레닐라 발광효소(renilla luciferase) 활성을 Turner TD20/20 루미노미터(Turner Biosystmes, CA, USA)에서 이중 발광효소 리포터 분석 키트(Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다. 파이어플라이 발광효소 활성의 레닐라 발광효소 활성에 대한 비율로 측정하였다.

그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 HT-29 세포에서 잎새버섯 추출물이 NF-kB 전사활성을 억제조절하였고, 100㎍/ml 잎새버섯 추출물은 20mM 5-ASA보다 강한 억제활성을 나타내었다.

< 실시예 8> 역전사효소 - 폴리머라아제 사슬 반응( RT - PCR )

serum-starved HT-29 세포를 실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 및 20mM 5-ASA로 1시간 동안 전처리한 후, 10ng/ml TNF-α로 3시간 더 배양하였다. 트리졸 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 전령 세포성 RNA를 추출하였다.

cDNA는 Ready-To-Go T-Primed First Strand Kit(Amersham Biosciences, USA)를 이용하여 합성되었다.

RT-PCR은 0.5U Taq DNA 폴리머라아제(TaKaRa, Japan)의 존재 하에 인간 MCP-1에 특이적인 프라이머 세트(서열목록 1 및 2; 300bp fragment), IL-8에 특이적인 프라이머 세트(서열목록 3 및 4; 289 fragment) 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제(GAPDH; 서열목록 5 및 6; 496 fragment)를 이용하여 수행하였다.

증폭은 94℃에서 4분동안 변성으로 시작하여 MCP-1에서는 35주기, GAPDH에서는 30주기를 반복하였다. 각 주기는 94℃에서 1분동안 변성, 59℃에서 1분동안 어닐링, 72℃에서 1분동안 연장 및 72℃에서 10분동안 최종 연장으로 구성되었다.

IL-8에서는 94℃에서 4분동안 변성을 포함하며, 94℃에서 45초동안 변성, 65℃에서 45초동안 어닐링, 72℃에서 90초동안 연장 및 72℃에서 10분동안 최종 연장으로 구성된 주기를 19주기 반복하였다.

얻어진 PCR 산물은 2% 아가로오즈겔 전기영동에서 분리되고, 0.5㎍/ml의 에티듐 브로마이드로 염색되어 시각화되며, 겔분석기(gel documentation system; UVP, Cambridge, UK)를 이용하여 UV 광선 하에서 촬영되었다.

그 결과, 도 5a 및 도 6에 도시된 바와 같이 HT-29 세포에서 MCP-1 및 IL-8 mRNA의 TNF-α 유도성 발현이 억제되었다.

< 실시예 9> ELISA 분석

세포외 TNF-α 및 MCP-1을 ELISA 키트(R&D Systems, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 24웰 플레이트에 배양된 세포를 실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 및 20mM 5-ASA로 1시간 동안 전처리한 후, 100ng/ml TNF-α로 24시간 동안 더 배양하였다.

세포 상등액(200㎕)를 TNF-α 또는 MCP-1 항체에 특이적인 단일클론 항체로 코팅된 96웰 ELISA 플레이트에 가하여 실온에서 4시간 동안 배양한 후, 세정 완충액으로 3회 세정하였다.

그후, TNF-α 및 MCP-1 컨쥬게이트를 각 웰에 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 3회 세정하고 기질용액(혼합된 컬러 시약 A 및 B)로 실온에서 20분 동안 배양하였다.

각 웰의 흡광도를 450 nm의 필터로 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 이용하여 30분 동안 측정하였다.

그 결과, 도 5b에 도시된 바와 같이, HT-29 세포에서 TNF-α 유도성 MCP-1의 분비를 농도의존적으로 억제하였다.

< 실시예 10> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 실시예 1에 따라 조제된 잎새버섯 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/㎏, 5g/㎏ 및 10g/㎏의 용량으로 1회 단회 경구투여하였다.

상기 추출물의 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈 액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 잎새버섯 추출물을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과, 본 발명의 잎새버섯 추출물은 랫트에서 10g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며, 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD50)은 본 발명의 잎새버섯 추출물 10g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이하, 본 발명의 잎새버섯 추출물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 산제의 제조

실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 300 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 50 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 함유하여 제조하였다.

< 제제예 5> 액제의 제조

통상의 액제의 제조방법에 따라 적량의 정제수에 실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 100 mg, 이성화당 10 g 및 만니톨 5 g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

< 제제예 6> 음료의 제조

실시예 1에서 제조한 잎새버섯 추출물 0.5mg, 꿀 522㎎, 치옥토산아미드 5㎎, 니코틴산아미드 10㎎, 염산리보플라빈나트륨 3㎎, 염산피리독신 2㎎, 이노시톨 30㎎, 오르트산 50㎎ 및 물 200㎖의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

도 1은 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물이 세포생존율에 미치는 영향을 MTT 분석 결과로 나타낸 것이고,

도 2는 U937 세포에서 LPS-유도성 TNF-α 분비에 대한 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 억제효과를 나타낸 것이고,

도 3은 HT-29 세포에서 TNF-α 유도성 ROS 생성에 대한 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 억제효과를 나타낸 것이고,

도 4는 HT-29 세포에 대한 TNF-α 유도성 단핵백혈구 부착에 관한 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 억제효과를 나타낸 것이고,

도 5a 및 도 5b는 HT-29 세포에서 TNF-α 유도성 MCP-1 mRNA 발현 및 분비된 MCP-1 단백질의 양에 대한 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 억제효과를 나타낸 것이고,

도 6은 HT-29 세포에서 TNF-α 유도성 IL-8 mRNA 발현에 대한 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 억제효과를 나타낸 것이고,

도 7은 HT-29 세포에서 TNF-α 유도성 NF-kB 발광효소 활성에 대한 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물의 억제효과를 나타낸 것이다.

<110> Yeungnam University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for treating and preventing inflammatory bowel disease comprising Grifola frondosa extract <130> dp-2008-0049 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MCP-1 <400> 1 atgaaagtct ctgccgcccc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MCP-1 <400> 2 tcaagtcttc ggagtttggg g 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for IL-8 <400> 3 atgtacttcc aagctggccg tggct 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for IL-8 <400> 4 tctcagccct cttcaaaaac ttctc 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 5 ggtgaaggtc ggagtcaact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 6 caaagttgtc atggatgacc 20

Claims

잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 잎새버섯 추출물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 20-50 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 잎새버섯 추출물은 C1 내지 C4의 알코올. C1 내지 C4의 알코올 수용액 또는 물을 추출용매로 이용하여 잎새버섯을 추출한 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
잎새버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 개선용 건강식품.