KR100881754B1

KR100881754B1 - 굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환치료 및 예방용 약학조성물

Info

Publication number: KR100881754B1
Application number: KR1020070089395A
Authority: KR
Inventors: 김정애; 최한곤; 용철순; 곽미경; 이종숙
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2007-09-04
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2009-02-06

Abstract

본 발명은 굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 굴피나무 추출물은 천연물질로서 부작용이 적으면서도 대장세포에서 단핵구 부착 등을 억제시키고, 염증성 사이토카인 예를들어 MCP-1, IL-8의 발현을 감소시킴으로써 염증성 장질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

굴피나무, 에탄올 추출물, 염증성 장질환, MCP-1, 폴리페놀

Description

굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating and preventing inflammatory bowel disease comprising extract of Platycarya strobilacea}

본 발명은 굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 임상적으로 유사하면서도 조직학적 소견과 내시경 및 면역학적 측면에서 서로 다른 궤양성 대장염 및 크론병의 두 가지 질환으로 분류되며, 이러한 IBD는 염증세포의 활성화가 중요한 병인인 것으로 알려져 있다.

장면역계의 지속적이거나 부적절한 활성화는 만성 점막성 염증의 병리생리에서 중요한 역할을 하며, 특히 호중구, 대식세포, 림프구 및 비만세포의 침윤에 의해 결국 점막 파괴 및 궤양을 초래한다.

침윤되고 활성화된 호중구는 활성산소질소종의 중요한 원인이 되며, 이러한 활성종는 세포독성 물질로서 가교 단백질, 지질 및 핵산에 의해 세포성 산화 스트레스를 유도하고 상피성 기능장애 및 손상을 초래한다.

염증성 질환이 있으면 장관의 점막에서 다양한 염증성 사이토카인들이 분비된다. TNF-α는 궤양성 대장염 환자의 대장 루멘과 대장 상피세포에서 높게 나타나며, 최근 연구에 의하면, TNF-α는 궤양성 대장염의 병인으로 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 항-TNF-α 항체인 인플릭시맵(infliximab)은 종기의 치료 뿐 아니라, 기존에 치료되지 않던 크론병의 치료에 효과적이라고 알려졌다.

그러나, 이러한 치료법은 비용이 많이 들고, 일부 환자에게서는 수액 반응 또는 전염성 합병증과 같은 부작용이 야기된다.

단핵구 화학주성 단백질-1(monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1)은 C-C 케모카인 패밀리 중 14kDa으로서, 염증부위에서 주로 단핵구/대식세포를 동원하고 활성화시킨다.

MCP-1는 대장의 상피세포에 국재되며 이의 발현이 염증성 장질환의 점막에서 단핵구 침윤과 관련된다는 보고가 있고, 다른 케모카인과는 달리 MCP-1은 단지 CCR2에만 결합하므로, MCP-1/CCR2 결합이 단핵구 동원의 주요한 조절자이며 IBD에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

또한, IBD를 지닌 환자의 점막에서는 유의성 있게 인터루킨-8(IL-8)이 상승하고, 모세혈관 신생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 대장에서의 염증이 심할수록 인터루킨-8의 발현이 증가하며, 설치류를 이용한 동물실험 모델에서 인터루킨-8 특이적 항체가 장염증을 감소시킨다는 것이 알려졌다. 이때, 세포내 Ca² ⁺의 변화가 IL-8 유도의 중요한 요소로 작용한다.

현재 염증성 장질환 치료제로는 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid; 5-ASA) 계통 약물 예를들어, 설파살라진 등을 이용하거나 스테로이드류의 면역억제제를 사용하고 있다.

설파살라진은 복부허실(fullness), 두통, 발진, 간질환, 백혈구 감소증, 무과립구증, 남성 불임 등과 같은 부작용 또는 역효과를 일으키기 쉽다. 또한, 설파살라진이 장의 환부를 절개한 환자 또는 차도가 있는 환자에게 충분한 재발 억제 효과가 있는지는 불분명하다.

스테로이드류의 면역억제제는 부신피질 스테로이드로서, 단기적인 효과는 인정받고 있지만, 장기적인 예후를 향상시킬 수는 없으며, 유도된 감염성 질환, 2차 부신피질 부전증, 소화성 궤양, 당뇨병, 정신장애, 스테로이드성 신장병 등과 같은 부작용의 측면에서 단지 급성인 경우에만 사용되어야 하는 한계가 있다.

한편, 천연 추출물 및 이를 이용한 제형들이 기침, 감기에서부터 기생충 감염 및 염증에 이르는 다양한 질환을 완화하고 치료하는데 사용되어 왔다. 오늘날 시장에서 이용되는 항암제의 60% 이상 그리고 감염성 질환의 75% 이상이 천연물에서 기원하고 있다. 이는 천연물이 매우 다양하며 높은 특이적인 생리적 활성을 제공하기 때문이다.

따라서, 염증성 장질환에 대해 아직까지 신뢰할 만한 치료요법은 없으며 이러한 질환에 대해 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있고, 이를 위하여 염증성 장질환에 유용한 천연 추출물을 스크링할 필요가 있다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 부작용이 적으면서도 신뢰할 수 있는 염증성 장질환 치료제를 개발하고자 하는 데에 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 굴피나무(Cornus kousa)는 가래나무과의 낙엽 소교목으로서, 주로 한국(충남 이남), 일본, 타이완, 중국의 산기슭의 양지나 바닷가 수성암 지대에서 자란다.

잎은 홀수깃꼴겹잎이며, 잎자루가 없는 7∼19개의 작은잎으로 이루어진다. 작은잎은 타원형 바소꼴 또는 달걀 모양 바소꼴로 끝이 뾰족하고 가장자리에 골이 깊은 톱니가 있다. 잎의 양면에 흰 털이 있으나 점차 없어진다. 꽃자루에도 털이 있으나 점차 없어진다.

꽃은 노란빛을 띤 녹색 꽃이 피는데 수꽃이삭은 5∼8cm, 암꽃이삭은 2∼4cm이며, 성숙한 암꽃이삭은 솔방울 모양이다. 열매이삭은 긴 타원형이고 검은빛을 띤 갈색이며 털이 없다. 포조각은 떨어지지 않으며 바소꼴이며, 열매는 날개를 가진 견과이고 9~10월에 익는다.

굴피나무의 열매껍질(과피)에는 유글론 성분이 있고 열매에는 탄닌질이 있어 민간에서는 가래약, 살충약, 임신구토약으로 사용되고 있다.

본 발명은 굴피나무 추출물이 자유 라디칼 소거활성, MCP-1과 같은 케모카인 유전자 발현의 저해활성, TNF-α 유도성 인간 대장 상피세포에 대한 단핵구 부착 저해활성 등 대장에서의 다양한 항염증 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 염증성 장질환의 치료 및 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다는 새로운 용도를 발견하여 이루어졌다.

본 발명에서 사용되는 상기 굴피나무 추출물은 굴피나무 줄기를 에탄올 수용액으로 추출한 에탄올 추출물인 것이 바람직하다. 이때, 상기 에탄올 수용액은 70% 에탄올 수용액인 것이 보다 바람직하다.

물론, 굴피나무 줄기 이외에도 뿌리, 열매 등 다른 부위도 사용가능하지만, 본 발명에서 기술된 바와 같이 다량의 폴리페놀 화합물들을 함유하기 때문에 굴피나무 줄기가 보다 바람직하다.

또한, 굴피나무를 추출하는 용매로는 에탄올 수용액 이외에도 부탄올 등 다른 알코올 또는 알코올 수용액을 사용할 수 있지만, 부탄올 등 다른 알코올을 사용하여 추출한 추출물은 단핵구의 대장 상피세포에 대한 부착 활성 저해 효과가 떨어져 염증성 장질환의 치료제로 효과가 감소하므로, 에탄올 추출물이 보다 바람직하다.

이때, 굴피나무를 에탄올 수용액으로 추출하는 경우 굴피나무 줄기의 10배 중량의 70% 에탄올 수용액을 가하고 25℃에서 24시간 동안 추출한다.

상기 굴피나무 추출물을 함유하는 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

본 발명의 굴피나무 추출물은 전체 약학조성물 100 중량부에 대하여 10-20 중량부로 함유되는 것이 바람직하다. 만약, 굴피나무 추출물이 상기 범위를 벗어나 소량으로 포함되면 염증성 장질환의 치료 및 예방 효과가 떨어지며, 상기 범위를 벗어나 과량으로 포함되면 용량에 비해 염증성 장질환의 치료 및 예방 효과가 둔화될 것이며, 굴피나무 추출물의 부작용도 야기될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 굴피나무 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 10 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

또한, 굴피나무 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 굴피나무 추출물은 천연약재로서 안전한 물질이며, 특히 50% 치사량(LC50)이 1000 mg/kg 이하로 안정성이 확보된 것으로서, 본 발명의 약학조성물에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 건강식품은 굴피나무 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 굴피나무 추출물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 부작용이 적으면서도 뛰어난 자유 라디칼 소거 활성, MCP-1과 같은 케모카인 유전자 발현의 저해활성 및 TNF-α 유도성 인간 대장 상피세포에 대한 단핵구 부착 저해활성 등 대장에서의 다양한 항염증 활성을 나타내는 굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 신뢰할 수 있는 염증성 장질환의 치료제로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 굴피나무 추출물 제조

경동약재시장(서울 소재)에서 구입한 굴피나무 줄기 50g에 70% 에탄올 수용액 500 ml를 가하고 25℃에서 24시간 동안 마그네틱 교반기로 교반하여 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고 진공 하에서 로터리 증발기를 이용하여 페이스트 농축물로 증발시켜 굴피나무 에탄올 추출물(EPC)을 얻었다.

비교를 위하여, 굴피나무 줄기 50g에 부탄올 500 ml를 가하고 25℃에서 24시간 동안 마그네틱 교반기로 교반하여 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고 진공 하에서 로터리 증발기를 이용하여 페이스트 농축물로 증발시켜 굴피나무 부탄올 추출물(EPC)을 제조하였다.

이때, 제조한 굴피나무 추출물에 함유된 전체 폴리페놀 화합물의 함량을 측정하기 위하여 변형 Folin-Ciocalteu 비색법으로 검토한 결과, 전체 폴리페놀 화합물의 함량은 추출물 100g 당 카테킨 역가로써 각각 굴피나무 에탄올 추출물의 경우 240.86±1.70 mg이고, 굴피나무 부탄올 추출물의 경우 328.9±0.48 mg였다.

< 실시예 2> DPPH 라디칼 소거활성 검토

산소 자유 라디칼, 호중구, 전염증성 사이토카인이 염증성 장질환의 병인과 관련되기 때문에 자유 라디칼 소거 활성을 근거로 염증 반응을 검토하였다.

1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH)을 이용한 자유 라디칼 소거 활성은 알려 진 이전 방법(Nature , 181: 1199-1200, 1958)으로 수행하였다. 즉, DPPH를 메탄올에 용해시켜 200μM의 DPPH 용액을 준비하고, 상기 DPPH 용액(190㎕)을 실시예 1에서 제조한 굴피나무 에탄올 추출물 또는 굴피나무 부탄올 추출물 10㎕에 가하고, 10초 동안 격렬하게 흔들어서 혼합하였다.

30분 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 하기 수학식 1에 의해 산출되었다. 이때, H 및 H₀는 굴피나무 추출물을 함유한 용액의 흡광도와 굴피나무 추출물을 함유하지 않는 용액의 흡광도를 각각 나타낸다.

라디칼 소거 활성(%) = {(1 - H)/ H₀} X 100

그 결과, 하기 표 1과 같이 농도의존적으로 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 항산화제로 널리 알려진 비타민C 및 비타민E와 유사한 항산화 활성을 나타내었다.

	저해(%)
	10 ㎍/ml	50 ㎍/ml	100 ㎍/ml
굴피나무에탄올추출물	65.27±0.78	79.33±0.23	85.13±0.32
굴피나무부탄올추출물	40.47±0.58	81.88±0.26	91.84±0.16
비타민C	83.58±0.38	92.89±0.09	93.49±0.03
비타민E	46.32±1.22	90.34±0.09	92.25±0.09

< 실시예 3> 세포 생존율 에세이

인간대장 상피세포주 HT-29 세포(American Type Culture Collections, Rockville, MA, USA)를 10% 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mmol/L 글루타민을 함유한 RPMI 1640에서 배양하고, 95% 공기 및 5% CO₂의 환경 하 37℃에서 상기 세포주를 유지하였다. 이하 실험은 36계대 이하인 세포를 사용하였다.

세포들은 0.25% 트립신 및 1% EDTA를 함유한 D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 이용하여 주단위로 계대배양 하였다. 배양 배지는 이틀마다 교체하였다. 컨플루언트하게 자란 후, 1:5 비율로 분할하여 서브컬쳐 하였다.

실험을 위하여, 혈청 함유 배지를 포함하는 플라스틱 세포배양 웰에 세포를 분주하고, 24시간 동안 부착시켰다. 그후, 모든 실험은 혈청 없는 조건에서 수행되었다.

3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 에세이를 이용하여 HT-29 세포에 대한 굴피나무 추출물의 세포독성을 검토하였다. 즉, HT-29 세포(1X10⁴ 세포/웰)를 96웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc, Denmark)에 분주하고, 0 내지 100㎍/ml에 걸친 다양한 농도의 굴피나무 추출물을 24시간 동안 처리한 후, 20㎕의 MTT(sigma) 용액(5mg/ml)을 각 웰에 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다.

MTT 용액을 함유한 배지를 흡입하여 제거하고, DMSO(200㎕)를 가해 형성된 포마잔(formazan) 결정을 용해하였다. 포마잔 결정의 양은 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Versa MAX Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 상대적인 세포 생존율은 포마잔 결정으로 전환된 MTT의 양에 의해 결정되며 대조군 배양물의 퍼센트로서 표현된다.

그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 굴피나무 에탄올 추출물(EPS) 및 부탄올 추출물(BPS) 모두 HT-29 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

< 실시예 4> U937 부착능 에세이

IBD 환자들은 염증을 일으킨 점막으로 많은 T 세포 및 단핵구/대식세포가 침윤되므로, 이러한 단핵구 부착능 에세이를 검토하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로 인간대장 상피세포주 HT-29 세포를 배양하여 사용하고, 또한 인간 백혈병 세포주 U937 세포(American Type Culture Collections, ATCC, VA, USA)를 10% FBS, 1mM 소듐 피루베이트, 200 IU/ml 페니실린 및 200 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유한 RPMI 1640에서 배양하고, 95% 공기 및 5% CO₂의 환경 하 37℃에서 상기 세포주를 유지하였다. 이하 실험은 36계대 이하인 세포를 사용하였다.

단핵구-대장 상피세포 부착은 37℃에서 1시간 동안 2',7'-비스(2-카르복시에틸)-5(6)-카르복시플루오레세인 아세톡시메틸 에스테르(BCECF/AM, 10㎍/ml)로 표식된 U937 세포를 이용하여 검토하였다.

컨플루언트하게 24웰 플레이트에서 배양된 HT-29 세포는 1시간 동안 실시예 1에서 제조한 굴피나무 추추물로 전처리된 후, TNF-α(10ng/ml)를 3시간 동안 처리하여 배양하였다. 이때, 양성대조군으로, 20mM의 5-아미노살리실산(5-ASA)을 사용하였다.

그후, HT-29 세포는 37℃에서 30분 동안 BCECF/AM-전표식된 U937 세포(1X10⁶ cells/well)와 공배양되었다. 부착되지 않은 U937 세포는 제거되고 PBS로 2회 세정되었다.

U937 세포가 부착된 HT-29 세포는 디지털 카메라(TMS; Nikon, Japan)에 연결된 역광현미경에 의해 이미지화 한 후, 0.1 mol/ℓ 트리스에 용해된 0.1% 트리톤 X-100를 이용하여 용해시켰다. 이들 세포 용해물을 485 nm에서 여기 및 520 nm에서 발광을 이용하여 플루오스타 옵티마 마이크로플레이트 리더(BMG LABTECH GmbH, Germany)로 형광을 측정하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이 3시간 동안의 TNF-α 자극에 의해 HT-29 대장 상피세포에 대한 형광 표식된 U937 세포 부착이 유의하게 증가되었고, 이러한 증가는 굴피나무 에탄올 추출물(EPC)의 첨가에 의해 농도의존적으로 저해되었다.

반면, 도 4에 도시된 바와 같이 굴피나무 부탄올 추출물(BPC)은 TNF-α 유도성 단핵구 부착에 대한 저해 활성이 농도의존적이지 못하며, 굴피나무 에탄올 추출물(EPC)보다 감소하는 것을 확인하였다.

이하 실험에서는 TNF-α 유도성 단핵구 부착에 대한 높은 저해 활성을 나타낸 실시예 1에서 제조한 굴피나무 에탄올 추출물(EPC)을 대상으로 하여 각 실험들을 수행하였다.

< 실시예 5> 역전사효소 - 폴리머라아제 사슬 반응( RT - PCR )

MCP-1을 타켓으로 한 간섭이 IBD의 새로운 치료법으로 알려져 TNF-α로 유도된 HT-29 세포에서의 MCP-1 분비에 대한 굴피나무 에탄올 추출물의 효과를 검토하였다.

MCP-1 및 IL-8 유전자의 발현은 RT-PCR에 의해 결정되었다. 먼저, MCP-1 및 IL-8 유전자의 발현을 검토하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 굴피나무 에탄올 추출물을 TNF-α의 처리 1시간 전에 전처리한 HT-29 세포(실시예 3과 동일한 방법으로 배양함)에 TNF-α(10ng/ml)의 자극을 3시간 가한 후, HT-29 세포를 트리졸 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 전령 세포성 RNA를 추출하였다. 이때, 양성대조군으로, 20mM의 5-아미노살리실산(ASA)을 사용하였다.

mRNA 농도는 자외선·가시광선분광기(UV-Visible spectrophotometer; Shimadzu, Japan)를 이용하여 결정하였고, Ready-To-Go T-Primed First Strand Kit(Amersham Biosciences, USA)를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 역전사하였다.

RT-PCR은 0.5U Taq DNA 폴리머라아제(TaKaRa, Japan)의 존재 하에 인간 MCP-1 및 IL-8 각각에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 수행하였다. 모든 유전자의 mRNA 양은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제(GAPDH)를 내부 대조군(Qiagen)으로 이용하여 표준화하였다.

이때, MCP-1 유전자의 발현을 위한 RT-PCR은 94℃에서 4분 동안(1회 주기); 94℃에서 60초 동안, 58℃에서 60초 동안, 72℃에서 60초 동안(35회 주기); 및 마지막으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰고, 사용된 프라이머는 각각 서열번호 1 및 2와 같다.

또한, IL-8 유전자의 발현을 위한 RT-PCR은 94℃에서 4분 동안(1회 주기); 94℃에서 45초 동안, 65℃에서 45초 동안, 72℃에서 90초 동안(19회 주기); 및 마지막으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰고, 사용된 프라이머는 각각 서열번호 3 및 4와 같다.

또한, GAPDH 유전자의 발현을 위한 RT-PCR은 94℃에서 4분 동안(1회 주기); 94℃에서 45초 동안, 58℃에서 45초 동안, 72℃에서 45초 동안(30회 주기); 및 마지막으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰고, 사용된 프라이머는 각각 서열번호 5 및 6과 같다.

얻어진 PCR 산물은 2% 아가로오즈겔 전기영동에서 분리되고, 0.5㎍/ml의 에티듐 브로마이드로 염색되어 시각화되며, 겔분석기(gel documentation system; UVP, Cambridge, UK)를 이용하여 UV 광선 하에서 촬영되었다. MCP-1, IL-8 및 GAPDH의 엠플리콘 길이는 각각 300, 766 및 496 염기쌍이었다.

그 결과, 도 5a 및 도 5b와 같이 MCP-1 mRNA의 양은 TNF-α의 처리로 유의하게 증가하였으나, 굴피나무 에탄올 추출물(EPC)에 의해 TNF-α 유도성 MCP-1 mRNA를 억제하였다.

또한, 도 6a 및 도 6b와 같이 IL-8 mRNA의 양은 TNF-α의 처리로 유의하게 증가하였으나, 굴피나무 에탄올 추출물(EPC)에 의해 농도의존적으로 TNF-α 유도성 IL-8 mRNA를 억제하였다.

< 실시예 6> 독성실험

150±5g의 ICR계 마우스(중앙실험동물)와 235±10g의 특정병원부재(SPF) 스프라그-도올리(Sprague Dawley, Biogenomics사) 랫트를 각각 3마리씩 3군으로 나누어 실시예 1에서 얻어진 굴피나무 에탄올 추출물을 각각 20 mg/㎏, 10 mg/㎏, 1 mg/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간동안 독성여부를 관찰하였다.

그 결과, 3군 모두에서 사망한 예를 전혀 관찰할 수 없었고, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

이하, 본 발명의 굴피나무 에탄올 추출물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 주사제의 제조

실시예 1에서 얻어진 굴피나무 에탄올 추출물 100 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎, 메틸파라벤 0.8 ㎎, 프로필파라벤 0.1 ㎎ 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

실시예 1에서 얻어진 굴피나무 에탄올 추출물 200 ㎎, 유당 100 ㎎, 전분 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

실시예 1에서 얻어진 굴피나무 에탄올 추출물 100 ㎎, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 4> 건강식품의 제조

실시예 1에서 얻어진 굴피나무 에탄올 추출물 200 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

< 제제예 5> 건강음료의 제조

실시예 1에서 얻어진 굴피나무 에탄올 추출물 1.28㎎, 꿀 522㎎, 치옥토산아미드 5㎎, 니코틴산아미드 10㎎, 염산리보플라빈나트륨 3㎎, 염산피리독신 2㎎, 이노시톨 30㎎, 오르트산 50㎎ 및 물 200㎖의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 굴피나무 추출물의 HT-29 세포에서의 생존율을 나타낸 것이고,

도 2는 실시예 1에서 제조한 굴피나무 에탄올 추출물의 HT-29 세포에서의 TNF-a 유도성 단핵구 부착 억제 활성을 형광 이미지로 나타낸 것이고,

도 3은 실시예 1에서 제조한 굴피나무 에탄올 추출물의 HT-29 세포에서의 TNF-α 유도성 단핵구 부착 억제 활성을 형광세기로 정량하여 나타낸 것이고,

도 4는 실시예 1에서 제조한 굴피나무 부탄올 추출물의 HT-29 세포에서의 TNF-α 유도성 단핵구 부착 억제 활성을 형광세기로 정량하여 나타낸 것이고,

도 5a 및 도 5b는 실시예 1에서 제조한 굴피나무 에탄올 추출물의 TNF-α 유도성 MCP-1 mRNA 발현 억제 활성을 나타낸 것이고,

도 6a 및 도 6b는 실시예 1에서 제조한 굴피나무 에탄올 추출물의 TNF-α 유도성 IL-8 mRNA 발현 억제 활성을 나타낸 것이다.

<110> Yeungnam University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for treating and preventing inflammatory bowel disease comprising extract of Platycarya strobilacea <130> dp-gu-2007-0045 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR sense primer for MCP-1 gene <400> 1 atgaaagtct ctgccgccct t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR antisense primer for MCP-1 gene <400> 2 tcaagtcttc ggagtttggg t 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR sense primer for IL-8 gene <400> 3 atgacttcca agctggccgt ggct 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR antisense primer for IL-8 gene <400> 4 tctcagccct cttcaaaaac ttctc 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR sense primer for GAPDH gene <400> 5 ggtgaaggtc ggagtcaacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR antisense primer for GAPDH gene <400> 6 caaagttgtc atggatgacc 20

Claims

굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 굴피나무 추출물은 굴피나무 줄기를 에탄올 수용액으로 추출한 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 굴피나무 추출물은 전체 약학조성물 100 중량부에 대하여 10-20 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료 및 예방용 약학조성물.
굴피나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환 개선용 건강식품.