KR102098079B1 - 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물 - Google Patents
발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 발효 흰점박이꽃무지 유충의 추출물이 세포독성은 없으면서, 항산화 효과, COLⅠA1의 감소효과, AST 및 ALT의 감소효과가 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물에 비해 현저하므로, 발효 흰점박이꽃무지 유충의 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 간 기능 개선용 건강기능식품 또는 간 섬유화 및 간경변의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
현대인의 간 손상 원인은 다양하며, 알코올, 흡연 외에도 바이러스에 의한 감염, 독물 또는 약제에 의한 중독, 영양장애 및 순환장애, 스트레스 같은 신변의 원인 등이 있다. 특히 바이러스나 음주에 의해서 가장 많이 발생하는 간염이나, 간암은 확실한 치료약이 없기 때문에 치유보다는 더이상 질병이 진행되지 않도록 하는 소극적 치료 조절에 의존하고 있는 것이 대부분의 실정이다. 또한, 한국인의 간암에 의한 사망률은 10만 명당 23.4명으로 세계 1위이고, 만성 간질환의 경우도 28.8명으로 3위로 조사되었으며, 최근 통계청에서 우리나라 40대의 경우 인구 10만 명당 56.1명이 간질환을 앓고 있다고 발표하였다.
이러한 간 관련 질병에 의한 폐해가 커짐에 따라서 간 관련 치료제 시장뿐만 아니라 건강기능성 식품시장에도 간 기능성 개선 제품에 대한 관심과 소비자의 요구도가 높아지고 있는 실정이다. 따라서 간을 보호하고 치유하는 효과가 있는 약물이나 기능성 식품을 개발하는 것은 대단히 중요하며, 간 질환의 치료를 위한 합성 의약품에 관한 보고가 있으나 합성 의약품은 부작용과 독성을 간과할 수 없기 때문에, 천연물로부터 부작용 없는 간 기능 개선제와 이를 위한 자연식품의 개발이 절실한 실정이다.
한편, 흰점박이꽃무지는 민간 및 동의보감(東醫寶鑑) 등의 전통 한방의서에서 '제조' 또는 '굼벵이'라는 속명으로 불리고 있는 딱정벌레목(Coleoptera), 풍뎅이과(Scarabaeidae), 꽃무지아과(Cetoniinae)에 속하는 크기 17~24㎝의 식식성(phytophagous) 곤충으로, 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 및 시베리아 동부 지역에 서식하는 것으로 알려져 있다.
흰점박이꽃무지는 3령의 성숙유충 상태로 월동하며, 성충은 주간에 활동하고 복숭아, 배 등의 성숙한 과일이나 옥수수, 상수리 나무 등의 즙액을 먹이로 하며, 항상 군집성이다. 또한, 이들의 유충은 퇴비나 건초더미 등의 유기물이 풍부한 부식성 토양 속에서 서식한다.
한편, 흰점박이꽃무지의 기능에 대한 연구는 많이 진행되어 있지만, 미생물을 이용하여 발효를 진행한 연구는 여전히 부족한 실정이다. 여기서 발효란, 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해, 합성 등 다양한 과정을 통해 산화 및 환원시키는 것을 말한다. 이를 통해 유기물의 소화 및 흡수를 용이하게 하고, 새로운 약성이나 약효를 띄게 할 수 있다는 사실이 지속적으로 보고되고 있다. 따라서 흰점박이꽃무지 유충을 균주로 발효시켰을 경우 상당한 시너지 효과가 있을 것으로 기대된다.
한편, 한국등록특허 제1539057호에 산겨릅나무 추출물을 함유하는 간 기능 개선용 음료 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1758718호에는 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 화합물을 함유하는 항혈전용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물을 제공하고, 상기 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 항산화 효과, COLⅠA1의 감소효과, AST 및 ALT의 감소효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 섬유화 및 간경변의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 발효 흰점박이꽃무지 유충의 열수 추출물이 세포독성은 없으면서, 항산화 효과, COLⅠA1의 감소효과, AST 및 ALT의 감소효과가 비발효 흰점박이꽃무지 유충의 열수 추출물에 비해 현저하므로, 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물 또는 간 섬유화 및 간경변의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 소재로 사용할 수 있다.
도 1은 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 세포독성을 확인한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, F-Pbl-0d는 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다.
도 2는 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 인간 간 성상세포(LX-2)의 증식 억제효과를 확인한 결과이다. TGF-β1을 처리하여 세포 증식을 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, DPI(diphosphoinositide)는 양성대조군이다. F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다. **은 음성대조군에 비해 TGF-β1 처리시 세포 증식이 유의미하게 증가하였음을 의미하며, p<0.01이다. ##은 TGF-β1 단독 처리군에 비해 F-Pbl-0d 병행 처리군의 세포 증식이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다. @@는 TGF-β1 및 F-Pbl-3d 50㎍/㎖ 처리군에 비해 TGF-β1 및 F-Pbl-3d 250㎍/㎖ 처리군의 세포 증식이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다.
도 3은 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 COLⅠA1의 발현 감소효과를 확인한 결과이다. TGF-β1을 처리하여 COLⅠA1의 발현을 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, DPI(diphosphoinositide)는 양성대조군이다. F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다. **은 음성대조군에 비해 TGF-β1 처리시 COLⅠA1의 발현이 유의미하게 증가하였음을 의미하며, p<0.01이다. #은 TGF-β1 단독 처리군에 비해 F-Pbl-0d 병행 처리군의 COLⅠA1의 발현이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.05이다. @@는 TGF-β1 및 F-Pbl-0d 처리군에 비해 TGF-β1 및 F-Pbl-3d 50㎍/㎖ 처리군의 COLⅠA1의 발현이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다.
도 4는 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 항산화효과를 확인한 결과이다. H2O2를 처리하여 산화를 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다. **은 음성대조군에 비해 H2O2 처리시 DCF(dichlorofluorescein)의 강도가 유의미하게 증가하였음을 의미하며, p<0.01이다. ##은 H2O2 단독 처리군에 비해 F-Pbl-0d 병행 처리군의 DCF의 강도가 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다. @@는 H2O2 및 F-Pbl-0d 처리군에 비해 H2O2 및 F-Pbl-3d 50㎍/㎖ 처리군의 DCF의 강도가 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다.
도 5는 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 AST(A) 및 ALT(B)의 활성을 확인한 결과이다. H2O2를 처리하여 효소의 활성을 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, DPI(diphosphoinositide)는 양성대조군이다. F-F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다.
도 2는 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 인간 간 성상세포(LX-2)의 증식 억제효과를 확인한 결과이다. TGF-β1을 처리하여 세포 증식을 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, DPI(diphosphoinositide)는 양성대조군이다. F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다. **은 음성대조군에 비해 TGF-β1 처리시 세포 증식이 유의미하게 증가하였음을 의미하며, p<0.01이다. ##은 TGF-β1 단독 처리군에 비해 F-Pbl-0d 병행 처리군의 세포 증식이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다. @@는 TGF-β1 및 F-Pbl-3d 50㎍/㎖ 처리군에 비해 TGF-β1 및 F-Pbl-3d 250㎍/㎖ 처리군의 세포 증식이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다.
도 3은 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 COLⅠA1의 발현 감소효과를 확인한 결과이다. TGF-β1을 처리하여 COLⅠA1의 발현을 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, DPI(diphosphoinositide)는 양성대조군이다. F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다. **은 음성대조군에 비해 TGF-β1 처리시 COLⅠA1의 발현이 유의미하게 증가하였음을 의미하며, p<0.01이다. #은 TGF-β1 단독 처리군에 비해 F-Pbl-0d 병행 처리군의 COLⅠA1의 발현이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.05이다. @@는 TGF-β1 및 F-Pbl-0d 처리군에 비해 TGF-β1 및 F-Pbl-3d 50㎍/㎖ 처리군의 COLⅠA1의 발현이 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다.
도 4는 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 항산화효과를 확인한 결과이다. H2O2를 처리하여 산화를 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다. **은 음성대조군에 비해 H2O2 처리시 DCF(dichlorofluorescein)의 강도가 유의미하게 증가하였음을 의미하며, p<0.01이다. ##은 H2O2 단독 처리군에 비해 F-Pbl-0d 병행 처리군의 DCF의 강도가 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다. @@는 H2O2 및 F-Pbl-0d 처리군에 비해 H2O2 및 F-Pbl-3d 50㎍/㎖ 처리군의 DCF의 강도가 유의미하게 감소하였음을 의미하며, p<0.01이다.
도 5는 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리에 의한 AST(A) 및 ALT(B)의 활성을 확인한 결과이다. H2O2를 처리하여 효소의 활성을 유도하였다. Control은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, DPI(diphosphoinositide)는 양성대조군이다. F-F-Pbl-0d는 500㎍/㎖의 비발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이고, F-Pbl-3d는 농도별 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물 처리군이다.
본 발명은 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 발효 흰점박이꽃무지 유충은 흰점박이꽃무지 유충에 고초균(Bacillus subtilis)을 혼합하여 발효한 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발효는 25~35℃에서 2~5일 동안 이루어지는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 30℃에서 3일 동안 발효하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물은 C1~C4의 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출한 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물을 이용하여 추출하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에서 상기 발효 흰점박이꽃무지 유충의 추출은 발효 흰점박이꽃무지 건조분말 1 중량부에 대하여 5~20 중량부의 용매를 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 발효 흰점박이꽃무지 건조분말 1 중량부에 대하여 10 중량부의 용매를 첨가하여 추출하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 간 기능 개선용 조성물은 H2O2에 의해 증가된 AST 또는 ALT의 활성을 감소시키는 특징이 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 발포정 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 발효 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 섬유화 및 간경변의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 간 섬유화 및 간경변의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제제, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예
1. 발효 굼벵이(
흰점박이꽃무지
유충) 추출물 및
비발효
굼벵이 추출물의 제조
(1) 발효 굼벵이 추출물의 제조
굼벵이는 열풍 건조한 후 분말화 하였다. 굼벵이 분말은 121℃에서 15분 동안 멸균 후 시료로 사용하였다.
발효에 사용한 균주는 고초균(Bacillus subtilis)이고, 동결하여 보관된 균주를 30℃, 100rpm 조건하에 1일 동안 OD 660nm 값이 1.7~1.8이 될 때까지 전 배양한 후, 균주의 활성을 상승시키기 위하여 30℃, 100rpm 조건하에 1일 동안 OD 660nm 값이 1.7~1.8이 될 때까지 1차 계대배양하였다. 그 후 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 균체(pellet)만 획득한 후 멸균수를 1:1 중량비로 혼합하여 균체를 현탁하였다. 그 후 멸균한 굼벵이 시료 300g에 균주 300㎖를 접종한 후 촉촉해질 정도로 멸균수를 추가하였으며, 중간 중간 멸균수로 버무려주며 30℃에서 3일 동안 발효하였다.
발효 후 굼벵이 발효물은 50℃에서 5시간 동안 열풍 건조한 후 분말화하였으며, 분말 1 중량부에 대하여 10 중량부의 물을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 열수 추출하였다.
굼벵이 발효물의 열수 추출물은 감압여과 후 실험에 사용하였다.
(2) 비발효 굼벵이 추출물의 제조
열풍건조한 후 멸균한 굼벵이 시료 1 중량부에 대하여 10 중량부의 물을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 열수 추출하였다.
굼벵이 열수 추출물(비발효 굼벵이 추출물)은 감압여과 후 실험에 사용하였다.
실시예
1. 발효 굼벵이 추출물의 세포 생존율 확인
시료의 안정성을 알아보기 위해 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움(MTS, promega, USA) 분석 방법을 통해 정상 세포주인 인간 신장 상피 세포인 293T 세포의 생존율을 측정하였다.
세포를 96 웰 플레이트에 4x103 세포/웰 씩 분주한 다음 농도별(50, 250, 500㎍/㎖)로 시료를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 2mg/㎖의 농도로 PBS에 희석된 MTS 용액 20㎕를 첨가하고 4시간 동안 재배양한 후 마이크로플레이트 리더로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존능력은 다음의 식에 따라 계산하였다.
[식 1]
세포 생존율(%)=시료 첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도×100
그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 발효 굼벵이 추출물 및 비발효 굼벵이 추출물은 모두 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
실시예
2. 발효 굼벵이 추출물의 간 섬유화 및 간경변의 개선 기능성 분석
(1) TGF-β1 처리에 의해 증가된 세포 증식 억제효과
간 섬유화와 밀접한 관련이 있는 인간 간 성상세포(human hepatic stellate cell line, LX-2)의 증식 억제효과를 확인하기 위해 TGF-β1 처리에 의해 세포 증식을 촉진시킨 후 발효 굼벵이 추출물을 처리하여 억제하는 효과를 확인하였다.
인간 간 성상세포(LX-2 cells, obtained from Dr. Fridemann, Columbia University, New York, USA)의 배양은 37℃ 대기와 5% CO2 조건에서 시행하였다. 간 성상세포는 100mm 배양접시(Falcon, Becton Dickinson, Fanklin Lakes, NJ, USA)에서 배양하였으며, 10%(v/v) 열 비활성의 FBS(fetal bovine serum, Invitrogen, USA)와 항생제(Invitrogen)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's, Invitrogen)을 사용하였다.
세포를 96 웰 플레이트에 4x103 세포/웰 씩 분주한 다음 10ng/㎖의 TGF-β1 및 농도별(50, 250, 500㎍/㎖) 발효 굼벵이 추출물 및 500㎍/㎖의 비발효 굼벵이 추출물을 처리하여 37℃, 5% CO2 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 2mg/㎖의 농도로 PBS에 희석된 MTS 용액 20㎕를 첨가하고 4시간 동안 재배양한 후 마이크로플레이트 리더로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식률은 상기 식 1의 세포 생존율 계산법에 따라 계산하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 TGF-β1 처리에 의해 증가된 세포 증식효과가 굼벵이 추출물 처리시 감소하였으며, 이러한 감소효과는 발효 굼벵이 추출물 처리에 의해 더욱 현저하다는 것을 확인하였다.
(2) COLⅠA1(collagen type Ⅰα 1 chain) 유전자 발현 확인
LX-2 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고(2.5×105/웰) 24시간 후 농도별 발효 굼벵이 추출물 및 을 농도별로 처리하고, 3시간 뒤 TGF-β1(10ng/㎖)을 추가한 뒤 24시간 동안 배양하였다.
RNA의 분리는 TRIZOL 용액(MRC, Cincinnati, OH, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 총 RNA를 분리하였으며, 분리된 총 RNA는 나노분광광도계(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 정량하였다. 분리된 총 RNA(1㎍)는 cDNA 합성을 위해 ImProm-IITM 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하였고, 합성된 cDNA는 나노분광광도계(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 정량하였다. 합성된 cDNA(200ng) 내 COLⅠA1의 유전자 발현량은 SYBR 그린 마스터 믹스 키트(QuantiMix SYBR Kit, Biosystems)를 사용하여 RG-6000 Real-Time PCR 시스템(Corbett Life Sciences, Sydney, NSW, Australia)을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 TGF-β1 처리에 의해 증가된 COLⅠA1 유전자 발현은 굼벵이 추출물 처리에 의해 감소하였으며, 특히 발효 굼벵이 추출물을 처리하였을 경우 모든 농도에서 COLⅠA1의 유전자 발현량이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예
3. 발효 굼벵이 추출물의 항산화력 분석
발효 굼벵이 추출물의 ROS(Reactive Oxygen Species) 소거능을 확인하기 위해 간암 세포인 HepG2를 이용하였다. 간세포 내 ROS의 양은 형광 프로브인 DCF-DA을 사용하여 측정하였다.
간암 세포인 HepG2는 한국세포주은행(Korean cell line bank, KCLB)에서 분양받았으며, MEM 배지에 10%(v/v) FBS(feral bovine serum)와 1%(v/v) 100 units/㎖의 페니실린-스트레프로마이신(penicillin-strepromycin)이 함유된 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
HepG2 세포들을 96 웰 플레이트에 1x104 세포/웰 씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액에 농도별(50, 250, 500㎍/㎖) 발효 굼벵이 추출물, 3μM의 DCF-DA(2',7'-Dichlorofluorescin diacetate) 및 50μM의 H2O2를 1시간 동안 처리한 다음 형성된 세포 내 과산화물을 여기(excitation) 파장 485nm, 방출(emission) 파장 535nm을 이용하여 형광을 측정하였다.
[식 2]
ROS 소거능=시료 첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도×100
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 H2O2에 의해 증가된 세포 내 ROS가 굼벵이 추출물 처리시 감소하였고, 특히 발효 굼벵이 추출물을 처리한 군에서 비발효 굼벵이 추출물을 처리한 군에 비해 ROS 감소량이 현저하였다.
실시예
4. 발효 굼벵이 추출물의 간 기능 개선 분석
간세포 내 발효 굼벵이 추출물 처리시 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase) 수치를 측정하기 위하여 아산제약의 GOT(AST), GPT(ALT) 측정용 시액 키트를 사용하여 측정하였다. HepG2 세포들을 96 웰 플레이트에 1x104 세포/웰 씩 분주하고, 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양하였다.
그 후 굼벵이 추출물을 농도별로 2시간 전처리한 후, 간독성 물질로 사용된 H2O2 처리한 다음 배양기에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양한 후 상등액을 취하여 AST와 ALT를 각각 측정하였다.
AST 및 ALT는 하기 식 3의 방법으로 계산하였다.
[식 3]
AST(또는 ALT) 활성(IU/ℓ)=B/(T2-T1)×V
B: 피루빈산염 표준곡선에서 피루빈산염의 양(pyruvate amount from pyruvate standard curve)
T1: 첫 번째 읽은 시간(time of the first reading)
T2: 두 번째 읽은 시간(time of the second reading)
V: 반응 웰에 추가된 초기 샘플 량(original sample volume added into the reaction well)
그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 H2O2에 의해 증가된 AST 및 ALT가 굼벵이 추출물 처리시 감소하는 것을 확인하였으며, 발효 굼벵이 추출물이 비발효 굼벵이 추출물에 비해 AST 및 ALT를 감소하는 효과가 현저하였다.
이를 통해 굼벵이 추출물, 특히 발효 굼벵이 추출물은 간 기능 개선효과가 있다는 것을 확인하였다.
Claims (6)
- 흰점박이꽃무지 유충에 고초균(Bacillus subtilis)을 혼합하여 발효한 발효 흰점박이꽃무지 유충의 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 발효는 25~35℃에서 2~5일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 C1~C4의 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 간 기능 개선은 H2O2에 의해 증가된 AST 또는 ALT의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 건강기능식품 조성물.
- 흰점박이꽃무지 유충에 고초균(Bacillus subtilis)을 혼합하여 발효한 발효 흰점박이꽃무지 유충의 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 섬유화 및 간경변의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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