KR101704678B1 - 필발 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

필발 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 필발 (Piper longum) 추출물 및 필발로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 스쿠티카충 감염에 따른 어류 세포 사멸을 억제하고 스쿠티카충의 사멸을 유도하므로 양식 어류의 기생충 감염 질환 예방 및 치료제로 효과적으로 사용 가능하다.

Description

필발 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING PARASITIZATION IN FISHES COMPRISING PIPER LONGUM EXTRACT, OR ISOLATED COMPOUNDS THEREFROM}
본 발명은 필발 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 예방 또는 개선용 사료 조성물, 상기 조성물을 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
어류양식어업은 수산자원의 고갈에 대항하는 혁신적인 대안으로 1990년대 중반부터 정부에서 적극 장려하여 현재 넙치, 조피볼락, 새우, 돌돔 등의 주요 어종의 양식이 이루어지고 있으며, 그 중 넙치는 성장이 빠르며 수요도 많아 전체 어류 양식 생산량에 있어서 많은 비중을 차지하고 있다. 그러나, 현재 우리나라 양식의 폐사율은 연간 20%를 상회하며, 그 주요원인으로 수온 상승으로 인한 난치성 질병 발생 및 혼합 감염 (바이러스, 세균, 기생충), 약제 치료효과의 저감이 지목되고 있다.
특히 양식어류에 기생충이 감염될 경우에 피해가 상당하여 대량 폐사의 원인이 되어 양식 산업에 있어서 큰 문제가 된다. 예컨데, 기생충성 감염 질환의 하나인 스쿠티카증은 육상의 약식수조나 해상가두리에서 양식되고 있는 해수 어류, 특히 넙치 등에서 주로 발병하는 질병으로서 원생동물의 섬모충의 일종인 스쿠티코실리아티다목 (Scuticociliatids)에 속하는 기생충인 스쿠티카충이 넙치의 피하조직에 침입하여 궤양을 일으킴으로서 발생한다. 이 충에 어체가 감염되면 종묘에서 지속적으로 증식하여 폐사율이 높아지며, 이 경우는 밀식을 피하고 유기물질이 수조 밑바닥에 남지 않도록 제거해 주어야 하며, 종래 사용되어왔던 치료방법으로는 스쿠티카충이 체표나 아가미 및 지느러미와 같은 외부에 기생했을 때 100-150ppm의 포르말린으로 1시간 정도 약욕하는 방법을 사용하여 왔다.
포르말린은 대표적 발암물질인 포름알데히드를 물에 녹여 35~38%의 농도로 만든 것이다. 이는 소독제, 방부제로 널리 쓰이며 국내에서는 수질환경보전법(제29조), 유해화학물질관리법(제15조), 폐기물관리법(제25조) 등에 따라 독극물로 분류돼 엄격한 관리를 요구받고 있고, 포름알데히드는 대기환경보전법(제2조)에 따라 유해물질로 분류된다.
한편, 수산양식분야에서 어류의 기생충약으로서 포르말린의 사용은 현재 일본에서 2003년 양식 복어에서 포르말린이 검출돼 논쟁 끝에 결국 사용이 금지됐고 제주도에서도 2006년 7월 제주특별자치도 출범에 맞춰 포르말린이 수산물에서 검출되면 반출을 금할 것을 조례를 통해 규정하고 있다. 그러나, 일본에서 사용이 금지된 포르말린을 우리나라에서는 제주도 이외의 시도에서 사용가능하게 함으로써 일본과의 무역마찰과 소비자의 문제제기를 자초하고 있다.
실제로 과거 해양수산부 산하기관에서 1997년에 내놓은 보고서(<화학 처리에 따른 성장기 넙치(광어)의 급성 독성 효과>)에서도 "포르말린, 이산화염소, 과산화수소 중 포르말린은 다른 둘보다 저농도에서도 치사 확률이 높아 매우 유독하기 때문에 포르말린보다는 과산화수소를 쓰는 것이 효과적"이라고 포르말린 사용을 자제할 것을 권고하기도 했다.
따라서 스쿠티카충의 치료약으로서 포르말린의 사용은 제주도는 물론 국내의 양식장에서도 더 이상 사용이 어렵게 되었으며, 이를 대체할 약제 조성물 등의 개발이 필요하나, 아직 특별한 대체조성물이 개발되지 않은 상태이며, 포르말린을 대체할 천연물 유래 스쿠티카충 구제제의 개발이 시급한 실정이다.
이와 관련하여 칠피(Rhus verniciflua bark) 및 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물 유래의 조성물이 항스쿠티카충 활성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다.(한국등록특허 제 1117754호, 제 1149382호)
한편, 필발 (Piper longum)은 호초과 (Piperaceae)의 덩굴성 다년초로 전통적으로 콜레라, 소화불량, 복부통증, 구토, 식욕감퇴 뿐 아니라 임질, 생리통, 결핵, 관절염, 종양 등에 사용해왔는데, 필발에는 알카마이드 (alkamide) 계열의 화합물이 주요 활성 화합물로 보고되어 있으며, 약리작용으로 억균작용, 항경련작용, 피부혈관확장작용, 항산화작용, 항심근허열 및 항심박이상작용 및 고지혈 강하작용 등이 보고되었으나, 항기생충 활성에 대해서는 전혀 보고된 바 없었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 어류의 기생충 감염 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로 포르말린과 달리 독성을 띄지 않을 천연물질에 주목하게 되었다. 이에, 이들 화합물들의 세포 접합 억제 효능 (Lee et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 4544-4546, 2008)을 포함한 다양한 생리활성을 연구해 왔으며, 천연물 유래의 어류 기생충 질환 구제제의 탐색 중 필발 추출물 및 필발로부터 분리된 화합물이 항기생충 활성이 있음을 규명하고, 이를 활용한 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 하나의 목적은 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 필발(Piper longum) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014118286825-pat00001
[화학식 2]
Figure 112014118286825-pat00002
[화학식 3]
Figure 112014118286825-pat00003
[화학식 4]
Figure 112014118286825-pat00004

본 발명에서 용어 "필발 (Piper longum)"은 호초과 (Piperaceae)의 덩굴성 다년초를 의미하며, 전통적으로 미숙 과실을 사용한다. 생김새는 원주형으로 과축(果軸)의 주위에는 작은 알맹이의 열매가 무수히 붙어있는 그물 눈 모양을 나타내며 길이 2~5cm, 지름 5~8mm의 크기를 가진다. 표면이 적갈색 또는 흑갈색으로 변할 때 채취하여 햇빛에 말린다.
필발은 특이한 방향이 있고, 매운 맛이 특징이며 전통적으로 콜레라, 소화불량, 복부통증, 구토, 식욕감퇴 뿐 아니라 임질, 생리통, 결핵, 관절염, 종양 등에 사용해왔다 (Mata et al., J. Nat . Prod ., 67, 1961-1968, 2004; Lee et al., J. Agric. Food Chem., 54, 9759-9763, 2006).
필발에는 3,4-메틸렌다이옥시페닐(3,4-methylenedioxyphenyl)을 포함한 알카마이드(alkamide) 계열의 화합물이 주요 활성 화합물로 보고되어 있으며, 피페린 (piperine), 귀닌신(quineensine), 피페노날린(pipernonaline), 디하이드로피페노날린(dehydropipernonaline), 레트-로프랙타마이드 씨(ret-rofractamide C), 피페롤레인 비(piperrolein B) 등이 이에 해당한다.
필발의 약리작용으로 억균작용, 항경련작용, 피부혈관확장작용, 항산화작용, 항심근허열 및 항심박이상작용 및 고지혈 강하작용 등이 보고되었다.
그러나, 필발의 항기생충 활성에 대해서는 아직까지 알려진 바 없었다. 그에따라 본 발명에서는 상기 필발 추출물이 스쿠티카충을 포함한 기생충에 대한 항기생충 활성이 있음을 밝힌 것이다.
본 발명에서 용어 "추출물"은 상기 필발의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명의 상기 필발 추출물에 있어서, 상기 필발을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 필발을 추출하는 데에 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글라이콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 바람직하게, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택되는 용매로 추출한 것일 수 있으며, 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로필알코올 또는 부탄올일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 필발 추출물을 얻기 위한 방법으로 보다 바람직하게는 필발 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1)내지 4(C4)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 냉침 추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 필발 조추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 필발을 분말화 한 후, 분말화 된 필발의 중량대비 3배의 메탄올을 가하여 추출하였다(실시예 1).
본 발명에서 용어 분획물은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 필발을 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물은 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택되는 용매로 분획한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 필발 추출물의 분획물을 얻기 위한 방법으로, 상기에서 얻은 필발 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄 등의 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다 (Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998). 구체적으로, 상기 필발 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트 용매를 이용하여 연속 추출로 필발 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 필발 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 클로로포름을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 필발로부터 얻은 추출물을 물에 현탁한 뒤, 순차적으로 동량의 n-헥산과 클로로포름으로 분획한 뒤 감압 농축하여 분획물을 수득하였다(실시예 1).
본 발명에서는 상기 필발 추출물의 항기생충 활성뿐만 아니라 이로부터 분리된 화합물의 항기생충 활성 역시 확인하였다. 상기 화합물은 이에 제한되지는 않으나, 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112014118286825-pat00005
[화학식 2]
Figure 112014118286825-pat00006
[화학식 3]
Figure 112014118286825-pat00007
[화학식 4]
Figure 112014118286825-pat00008

본 발명의 일 실시예에서는, 필발 추출물 또는 이의 분획물로부터 어류의 기생충 감염 예방 또는 치료 효과가 있는 4종의 유효 화합물을 분리하였다(실시예 2).
구체적으로, 4종의 유효 화합물은 화학식 1의 귀니신(guineesine), 화학식 2의 피페노날린(pipernonaline), 화학식 3의 피페리사이드(pipericide) 및 화학식 4의 디하이드로피페노날린(dehydropipernonaline)으로, 귀니신은 (2E,4E,12E)-13-(1,3-벤조다이옥솔-5-일)-N-(2-메틸프로필)트리데카-2,4,12-트리엔아마이드((2E,4E,12E)-13-(1,3-benzodioxol-5-yl)-N-(2-methylpropyl)trideca-2,4,12-trienamide)로, 피페노날린은 (2E,8E)-9-(1,3-벤조다이옥솔-5-일)-1-피페리딘-1-일노나-2,8-다이엔-1-온((2E,8E)-9-(1,3-benzodioxol-5-yl)-1-piperidin-1-ylnona-2,8-dien-1-one)으로, 피페리사이드는 (2E,4E,6E,10E)-11-(1,3-벤조다이옥솔-5-일)-N-(2-메틸프로필)언데카-2,4,6,10-테트라에나마이드((2E,4E,6E,10E)-11-(1,3-benzodioxol-5-yl)-N-(2-methylpropyl)undeca-2,4,6,10-tetraenamide)로, 디하이드로피페노날린은 N-(9-(3,4-메틸렌다이옥시페닐)-2,4,8-노나트라이에노일)피페리딘(N-(9-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2,4,8-nonatrienoyl)piperidine)으로 명명된다.
상기 화학식 1 내지 4의 화합물들은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 필발로부터의 화합물의 추출, 분리 및 정제방법은 다음과 같으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 클로로포름 가용성 분획물을 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있다. 상기 분리 조건은 클로로포름과 메탄올을 100:1 내지 1:100인 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 박층크로마토그래피로 확인하여 하위 분획물을 수득할 수 있다. 하위 분획물은 물과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하며, 바람직하게는 60, 70, 80, 90, 100% 메탄올을 이동상으로 사용할 수 있다. 이렇게 얻은 최종 분획물은 이동상을 90% 메탄올, 유속 5 ml/분의 조건으로 프리퍼레이티브 HPLC (preparative High Performance Liquid Chromatography)로 화학식 1 내지 4의 화합물을 분리할 수 있다.
본 발명에서 상기 어류는 본 발명에 따른 기생충 감염 질환이 발병할 수 있는 모든 어류를 제한없이 통칭할 수 있으며, 바람직 하게는 넙치, 조피볼락, 숭어, 참돔, 돌돔, 농어, 가자미, 고등어, 능성어, 참다랑어, 감성동 등을 포함할 수 있다. 또한, 바람직하게는 양식 어류일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적으로 어류 세포인 FMH 세포를 사용하여 실험을 수행하였다.
본 발명에서 상기 기생충은 다른 종 생물에 기생하는 생명체를 말하며 본 발명의 목적상 어류에 기생하는 기생충을 의미할 수 있고, 바람직하게는 백점충(Ichthyophthirius multifillis), 해산백점충(Cryptocaryon irritans), 트리코디나(Trichodina), 킬로도넬라(Chilodonella), 암비프리야(Ambiphrya), 아피오소마(Apiosoma), 에피스틸리스(Epistylis), 카케시움(Carchesium), 스쿠티카충(Scuticociliatids)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 스쿠티카충일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 기생충들은 양식어류의 스쿠티카증, 익티오보증, 백점충증, 트리코디나증 등 기생충성 질병을 야기시켜 양식어류에 커다란 피해를 주고 있으며, 특히 스쿠티카충은 한국과 일본에서 양식중인 넙치 치어에 기생하여 큰 피해를 주는 경우가 적지 않다.
상기 스쿠티카충은 넙치 스쿠티카증을 유발하는데, 스쿠티카증은 30~40㎛의 스쿠티카 섬모충에 의해 발생되며 육상의 양식수조나 해상가두리에서 양식되고 있는 해수 어류, 특히 넙치의 인공종묘 및 양성어에 감염되며 감염부위도 체표와 지느러미 그리고 간장, 혈관 및 뇌조직까지의 심부 감염을 유발하고, 대부분 소성결합조직의 파괴를 통하여 넙치를 대량 폐사시킨다. 이 스쿠티카 섬모충은 다른 어류의 기생충과는 달리 혈관을 통하여 뇌조직까지 침입하여 기생하기 때문에 감염시 치료가 어려운 질병이다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 필발 추출물 및 필발로부터 분리된 화합물인 피페노날린이 스쿠티카충에 의한 어류 세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음을 확인하였으며(표 1, 도 2 및 도 3), 나머지 세 개의 화합물 역시 스쿠티카충에 의한 어류 세포의 사멸을 억제하는 효과가 있음을 확인함으로써(도 4 내지 도 6), 본 발명의 필발 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 스쿠티카충을 포함한 어류의 기생충 감염 예방, 개선 또는 치료 용도에 적합하다는 것을 밝혔다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 조성물에 의해 어류의 기생충 감염 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 치료는 상기 조성물에 의해 어류의 기생충 감염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 어류의 질병 치료라는 목적상 약욕제의 형태로 제공되는 것이 가장 바람직할 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 어류의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 수의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014118286825-pat00009
[화학식 2]
Figure 112014118286825-pat00010
[화학식 3]
Figure 112014118286825-pat00011
[화학식 4]
Figure 112014118286825-pat00012

상기 필발 추출물, 이로부터 분리된 화합물, 및 상기 유효 성분의 항기생충 활성에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 목적상, 필발 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물은 어류의 기생 감염 질환의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 사용될 수 있기 때문에, 사료 첨가제로 포함되어 사료 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 상기 사료 첨가제는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 개선을 목적으로 첨가되는 물질을 의미한다. 본 발명의 필발 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 상기 사료 첨가제로서 사료 조성물에 포함될 수 있으며, 상기 사료는 어류에 공급되는 모든 식품을 총칭하는 의미로 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위해 첨가되는 결착제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있고, 효용 증대를 위하여 첨가되는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
또한, 상기 어류용 사료 조성물에 통상적으로 사용되는 배합사료로는 어분, 카제인, 육골분, 새우분말 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질원 또는 고구마 전분, 감자전분, 밀 전분 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 탄수화물원 또는 채종유, 대두유, 옥수수유, 명태간유, 오징어간유 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 지질원 등이 있으나 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 배합사료와 배합하여 사용하더라도 본 발명에서 나타내는 기생충 감염 질환 예방 또는 개선 효과는 동일하게 발생된다.
또 다른 하나의 양태로서, 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014118286825-pat00013
[화학식 2]
Figure 112014118286825-pat00014
[화학식 3]
Figure 112014118286825-pat00015
[화학식 4]
Figure 112014118286825-pat00016

상기 필발 추출물, 이로부터 분리된 화합물, 및 상기 유효 성분의 항기생충 활성에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료 방법은, 상기 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 단계를 포함함으로써, 어류에 직접 또는 간접적으로 본 발명의 조성물이 전달되는 모든 수단을 포함할 수 있다. 구체적으로, 예컨데 어류에 직접적으로 주사하거나 급이함으로써 본 발명의 목적을 달성할 수도 있으며 약욕시키거나 섭식시키는 등의 수단을 통해서도 달성될 수 있다. 바람직하게는 유효농도의 약액을 제조하여 기생충 감염 질환으로 인한 병변을 가진 어류를 침지하여 약욕시키는 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이 때 본 조성물의 투여량은 피처리 어류의 중량, 건강상태, 투여시간, 질환의 중증도에 따라 그 범위를 달리할 수 있다.
본 발명의 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물들을 유효성분으로 포함하는 조성물은 스쿠티카충 감염에 따른 어류세포 사멸을 억제하고 스쿠티카충의 사멸을 유도하므로 양식 어류의 기생충 예방 및 치료제로 사용이 가능하다.
도 1은 필발 추출물의 스쿠티카충 살충 효과를 현미경으로 관찰한 것이다.
도 2는 필발 추출물(10, 25, 50 ㎍/㎖)의 스쿠티카충 감염에 의한 어류 세포 사멸 방지 효과를 현미경으로 관찰한 것이다.
도 3은 화학식 2의 피페노날린(10, 25, 50 μM)의 스쿠티카충 감염에 의한 어류 세포 사멸 방지 효과를 현미경으로 관찰한 것이다.
도 4는 화학식 1의 귀니신(25, 50 μM)의 스쿠티카충 감염에 의한 어류 세포 사멸 방지 효과를 현미경으로 관찰한 것이다.
도 5는 화학식 3의 피페리사이드(25, 50 μM)의 스쿠티카충 감염에 의한 어류 세포 사멸 방지 효과를 현미경으로 관찰한 것이다.
도 6은 화학식 4의 디하이드로피페노날린(25, 50 μM)의 스쿠티카충 감염에 의한 어류 세포 사멸 방지 효과를 현미경으로 관찰한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 필발 추출물 및 분획물의 제조
필발의 어류 기생충 질환 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여 필발로부터 추출물 및 이의 분획물을 제조하였다.
필발은 물로 완전히 세척하고 음건한 후, 와링 브랜드로 분말화하였다. 분말화된 필발 100 g에 중량 대비 3배의 메탄올을 가하여 7일간 실온에서 추출한 후 여과하였다. 이를 감압 농축하여 조추출물 32 g을 얻었다.
또한, 상기 조추출물에서 생리활성 화합물을 분리, 정제하기 위하여 조추출물을 물에 현탁한 뒤, 순차적으로 동량의 n-헥산과 클로로포름으로 분획한 뒤 감압 농축하여 각각의 분획물을 수득하였다.
실시예 2: 필발로부터 화합물의 분리
상기 실시예 1에서 필발 추출물을 제조하였는바, 이의 활성성분을 탐색하기 위하여 유효 화합물을 분리하고자 하였다.
상기 클로로포름 분획물 (7.5 g)을 클로로포름과 메탄올의 단계농도 구배 (step gradient, 100:0, 80:1, 60:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 각 3 L)의 이동상 용매 시스템을 통한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 총 8개의 하위 분획물을 수득하였다.
상기 수득한 하위 분획물 중 활성 분획은 n-헥산과 에틸아세테이트의 단계농도 구배 (step gradient, 50:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 1:1, 각 2 L)의 이동상 용매 시스템을 통한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 총 8개의 하위 분획물을 수득하였다.
상기 수득한 분획물은 고속액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography)와 YMC J스피어(sphere) ODS H-80 컬럼, 80 및 90% 메탄올의 이동상을 통해 총 5 종의 화합물을 순수 단리하였다.
상기 순수 단리된 4 종의 화합물을 NMR, MS, IR 등의 기기분석과 발표된 문헌과의 비교를 통해 구조 동정하였으며, 그 결과 상기 4종의 화합물은 각각 귀니신(guineensine), 피페노날린(pipernonaline), 피페리사이드(pipericide), 디하이드로피페노날린(dehydropipernonaline)인 것으로 확인되었다.
실시예 3: 필발 추출물의 항스쿠티카충 활성 확인
상기 실시예 1에서 추출한 필발 추출물을 대상으로 어류의 스쿠티카충에 대해서 항스쿠티카충 활성을 갖는지 확인하고자 하였다.
96-웰 접시 (96-well plate)에 스쿠티카충을 5 × 106 / 100㎕로 분주하고 필발 추출물을 50 ㎍/㎖로 처리한 후 72시간 후 형태변화 (morphology)와 운동성 (motility)로 구분하여 관찰하였다 (Novotony, M. J. et al, Diseases of aquatic organisms, 24, 223-237). 그 결과, 약 50%의 세포가 원형 또는 불규칙적인 모양으로 형태가 변화하였고, 세포 중 50%이상이 사멸되고 세포가 비정상적인 운동성을 나타내었다(도 1).
실시예 4: 필발 및 화합물의 항스쿠티카충 활성 확인
상기 실시예 1에서 추출한 필발 추출물 및 실시예 2에서 분리한 화합물을 대상으로 어류의 기생충 중 대표적인 스쿠티카충에 대해서 항기생충 활성을 갖는지 확인하고자 하였다.
항스쿠티카충의 인비트로(in vitro) 활성 시험을 위하여 스쿠티카충이 감염된 넙치로부터 분리하여 순수 배양한 YS2 균주(strain)를 사용하였으며, 배양 및 증식을 위한 먹이로 어류세포 FMH 세포를 공급하였다. FMH 세포는 DMEM(Dulbescos Modified Eagle Medium, high glucose)에 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 처리하여 15 내지 20℃에서 배양하였다. 스쿠티카충 감염에 따른 어류세포 사멸 억제 시험을 위해 96-웰 접시(96-well plate)에 FHM 세포를 1 × 106 / 200 ㎕의 농도로 분주하고, 필발 추출물을 50, 25, 10 ㎍/㎖로, 필발로부터 분리된 화합물인 피페노날린을 50, 25, 10μM 농도로 1시간 전처리하였다. YS2를 넣어주고 6시간 후 남아있는 FHM 세포에 살아있는 세포의 측정이 가능한 WST-1 어세이(assay) 시약을 20 ㎕씩 각각 처리하고 형광을 측정하였으며, YS2는 WST-1에 염색되지 않아 결과에 영향을 주지 않았다. 그 결과 필발 추출물은 50 ㎍/㎖, 피페노날린은 50 μM의 농도에서 각각 96.9% 이상의 효과로 스쿠티카충에 의한 어류세포 사멸을 방지하였다. (표 1, 도 2 및 도 3)
샘플 농도 형광도
(590 nm ) 		어류 세포 사멸 억제
(%)
스쿠티카충 (-) 1.570 100
스쿠티카충 (+) 0.644 0
필발 50 ㎍/㎖ 1.794 >100
25 ㎍/㎖ 1.475 89.7
10 ㎍/㎖ 1.344 75.6
pipernonaline 50 μM 1.542 96.9
25 μM 0.971 35.3
10 μM 1.012 39.7
따라서, 표 1, 도 2 및 도 3과 같이 필발 추출물 또는 피페노날린이 어류세포인 FMH에 대하여 항스쿠티카충 활성을 가져 어류 세포 사멸을 억제하는 바, 본 발명의 필발 추출물 및 피페노날린이 항기생충 활성을 가짐을 알 수 있었다.
나아가 나머지 화합물인 귀니신, 피페리사이드, 디하이드로피페노날린에 대하여 50, 25μM 농도로 상기와 동일한 실험을 수행한 결과, 이들 역시 피페노날린과 마찬가지로 항스쿠티카충 활성을 가져 어류 세포 사멸을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 4 내지 도 6).
결론적으로 본 발명의 필발 추출물 또는 상기 필발로부터 분리된 화합물들은 항스쿠티카충 활성을 가지므로 어류의 기생충 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 필발(Piper longum) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 스쿠티카충 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택되는 용매로 추출한 것인, 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 분획물은 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택되는 용매로 분획한 것인, 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물인 것인, 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112014118286825-pat00017

    [화학식 2]
    Figure 112014118286825-pat00018

    [화학식 3]
    Figure 112014118286825-pat00019

    [화학식 4]
    Figure 112014118286825-pat00020

  5. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것인, 약학 조성물.

    [화학식 2]
    Figure 112014118286825-pat00021

  6. 제 1항에 있어서, 상기 어류는 양식 어류인 것인, 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 스쿠티카충 감염 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.

    [화학식 1]
    Figure 112016090306593-pat00022

    [화학식 2]
    Figure 112016090306593-pat00023

    [화학식 3]
    Figure 112016090306593-pat00024

    [화학식 4]
    Figure 112016090306593-pat00025

  9. 제 8항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물은 필발로부터 분리된 것인, 약학 조성물.
  10. 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 스쿠티카충 감염 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  11. 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는, 어류의 스쿠티카충 감염 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물.

    [화학식 1]
    Figure 112016090306593-pat00026

    [화학식 2]
    Figure 112016090306593-pat00027

    [화학식 3]
    Figure 112016090306593-pat00028

    [화학식 4]
    Figure 112016090306593-pat00029

  12. 필발 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 스쿠티카충 감염 질환 예방 또는 치료 방법.
  13. 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 스쿠티카충 감염 질환 예방 또는 치료 방법.

    [화학식 1]
    Figure 112016090306593-pat00030

    [화학식 2]
    Figure 112016090306593-pat00031

    [화학식 3]
    Figure 112016090306593-pat00032

    [화학식 4]
    Figure 112016090306593-pat00033

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