KR100954865B1 - 필발로부터 분리된 세포접착저해 물질을 유효성분으로 하는염증성 질환 의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 필발(Piper longum) 추출물 및 필발로부터 추출한 아마이드계(amide) 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 필발 추출물 또는 이들로부터 유래된 아마이드계 화합물을 유효성분으로 하는 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

필발, 세포간 접착인자-1(ICAM-1), 백혈구 기능 관련 항원-1(LFA-1), 세포접착, 염증, 리노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 타입-1(HIV-1)

Description

필발로부터 분리된 세포접착저해 물질을 유효성분으로 하는 염증성 질환 의 예방 및 치료용 조성물 {Pharmaceutical composition comprising inhibitors of cell adhesion molecule isolated from Piper longum for the prevention and treatment of inflammatory disease}

본 발명은 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 필발(Piper longum) 추출물 및 이들로부터 유래된 아마이드계(amide) 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 필발 추출물 또는 필발로부터 추출한 아마이드계 화합물을 유효성분으로 하며, 세포간 접착인자-1(ICAM-1)와 백혈구 기능 관련 항원-1(LFA-1; CD11a/CD18) 간의 결합을 특이적으로 저해하여 혈관협착, 관절염, 천식, 골다공증, 건선, 아토피, 염증성 장염, 암전이 또는 이식거부와 같은 염증성 질환, 또는 리노바이러스 또는 인간 면역결핍 바이러스 타입-1 (HIV-1)에 의한 질환과 같은 감염성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.

세포간 접착인자-1 (Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1; CD54)은 면역글로불린 상과(Ig-superfamily)에 속하는 접착 수용체(adhesion receptor)로서, 혈관내피세포, 일부 임파구(lymphocyte) 및 단핵구(monocyte)에서 저밀도로 발현되며 (Springer, Nature , 346:425-434, 1990; Rothlein et al., J. Immunol ., 137:1270-1274, 1986) IL-1, TNF-α 또는 IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인 또는 지질다당질(lipopolysaccharide, LPS)을 처리했을 때, 다양한 세포(multiple cell type)에서 ICAM-1의 발현은 증가된다 (Hubbard and Rothlein, Free Radic . Biol . Med., 28:1379-1386, 2000).

백혈구 기능 관련 항원-1 (Leukocyte function associated antigen-1, LFA-1; CD11a/CD18)은 ICAM-1의 리간드로서 정지기의 백혈구(resting leukocyte)에서는 불활성이지만, T 세포 수용체에 의해 매개되는 신호 또는 포볼에스테르(phorbolester)와 같은 다양한 자극인자에 의해 활성화 된다 (Dustin and Springer, Nature , 341: 619-624, 1989; Rothlein and Springer, J. Exp . Med ., 163: 1132-1149, 1986).

한편, 백혈구가 염증부위에 침윤하기 위해서는 백혈구가 혈관내피세포 표면에서 혈관내피세포에 접착하는 과정을 통해야만 한다. ICAM-1은 특히 염증반응이 일어난 혈관내피세포에서 많이 발현되며 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관벽에 접착하고 침투하는 것을 증진시키는 작용을 한다. 또한 혈소판과 혈관내피세포 간의 접착에도 ICAM-1이 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀졌다 (Thomas and DeGraba, Neurology, 49: 15-19, 1997).

세포접착은 동맥경화, 관절염, 골다공증, 세균감염, 암 전이, 및 혈관신생, 건선, 천식, 알레르기, 루푸스 또는 크론씨 병 등의 난치성 만성질환들과 매우 밀접하게 관련이 되어있다 (Poston et al., Am . J. Pathol ., 140:665-673, 1992; Macchioni et al., J. Reumatol ., 21(10):1860-1864, 1994; Mason et al., Arthritis Rheum ., 36:519-527, 1993; Kling et al., Clin . Invest ., 71:299-304, 1993). 이 중, 동맥경화는 혈중의 과다한 콜레스테롤 농도에 기인한 동맥경화 발생기전과 더불어 고혈압, 독소 또는 병원체에 의해 혈관벽의 내피세포(endothelial cell)에 미세한 손상이 일어나면 만성염증의 형태로 발전한다. 또한, 내피세포에서 발현된 세포접착인자에 의해 혈중 단핵구가 혈관벽으로 침투하고, 혈관벽에서 대식세포(macrophage)로 분화하여 혈중에 유입된 콜레스테롤을 저장하는 거품세포(foam cell)로 변형되면서 혈관세포의 섬유화를 점진적으로 진행시켜 혈관이 좁아지는 비가역적 변성을 일으키게 된다 (Ross, Annu . Rev . Physiol., 57:791-804, 1995; Christoper and Joseph, Cell, 104:503-516, 2001). 따라서 이러한 염증반응과 동맥경화 진전 과정에서 세포접착인자가 중요한 역할을 하고 있으며, 단핵구와 내피세포 사이에서 이들 세포접착인자의 발현을 차단하는 저해제의 개발이 다양하게 시도되고 있다.

이러한 결과로 미루어 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착 저해제는 동맥경화 및 면역관련 염증질환을 위한 잠재적인 치료제로서의 가치가 충분하다 (Oppenheimer-marks and Lipsky, Clin . Immunol . Immunopathol ., 79:203-210, 1996). 특히, ICAM-1이 염증반응에 중요하게 관여하고 있다는 사실은 ICAM-1의 단일클론항체 및 여러 종류의 질환모델 동물실험을 통해서 밝혀지고 있다. ICAM-1 또는 LFA-1에 직접적으로 대응하는 단일클론항체를 이용한 ICAM-1 및 LFA-1 간의 결합 저해가 동맥경화, 천식, 사구체 신염 또는 관절염 등의 자기면역질환에 유효한 것으로 밝혀졌으며, 면역응답반응에 있어서 T 세포의 활성화에는 T 세포 수용체를 통한 항원 특이적인 신호 이외에도 ICAM-1 및 LFA-1 등의 항원 비특이적인 신호가 반드시 필요한 것으로 밝혀졌다 (Cornejo et al., Adv . pharmacol ., 39:99-141, 1997; Patel et al., Circulation, 97:75-78, 1998; Nishikawa et al., J. Exp . Med., 177:667-77, 1993; Kobayashi et al., Cell Immunol ., 164:295-305, 1995; Nagase et al. Am . J. Respir . Crit . Care Med ., 152:81-86, 1995).

ICAM-1은 염증성 질환 뿐만 아니라 바이러스 감염에도 중요한 역할을 한다. 감기 바이러스인 리노바이러스(rhinovirus)는 ICAM-1을 수용체로서 사용하여 감염된다는 것이 입증되었다 (Greve et al., Cell, 56: 839-847, 1989; Staunton et al., Cell, 56:849-853, 1989; Tomassini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 86:4907-4911, 1989). 또한 인간 면역결핍 바이러스 타입-1 (human immunodeficiency virus type-1, HIV-1) 역시 ICAM-1과 LFA-1 간의 결합을 이용하여 감염되며 ICAM-1과 LFA-1의 결합 저해제로 알려진 스타틴(statin)계 화합물이 HIV-1 바이러스의 증식을 억제하는 것으로 보고되었다 (Giguere and Tremblay, J. Virology 78: 12062-12065, 2004). 따라서 ICAM-1 또는 LFA-1의 활성 저해제는 염 증성 질환의 치료제 뿐만 아니라 리노바이러스 또는 HIV-1의 항바이러스제로서도 이용할 수 있다.

현재 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착 저해제의 개발은 그들의 중화항체가 대상이었으며 천연물로부터는 수종의 저해제만이 보고되어 있는 실정이다. 애보트 (Abbott) 사에서 합성품으로서 ICAM-1 발현 저해물질을 보고하였으며 (Stewart et al., J. Med . Chem ., 44:988-1002, 2001) ICAM-1의 에피톱을 모체로 한 합성물질인 LFA-1의 안타고니스트가 노바티스(Novartis) 사 및 로슈(Roche) 사로부터 개발되었으나 (Welzenbach et al., J. Biol . Chem ., 277:10590-10598, 2002, Gadek et al., Science , 295:1086-1089, 2002), 아직 질환동물모델을 이용한 생체 내 (in vivo) 활성에 대한 보고는 없다. 한편, 천연물로부터는 세코-리모니드 (seco-limonids)계 물질 (Trichilia rubra, IC₅₀; 10～25 nM), 큐커바이타신 (cucurbitacins, Conobea scoparioides, IC₅₀; 0.18～1.36 mM) 및 아드잔스로마이신 (adxanthromycins, Streptomyces sp. Na-148, IC₅₀; 1.5～6.5 mM) 등이 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착을 저해하는 물질로 보고되고 있다 (Musza et al., Tetrahedron, 50:11369-11378, 1994; Musza et al., J. Net . Prod ., 57:1498-1502, 1994; Nakano et al., J. Antibiotics , 53:12-18, 2000).

본 발명자들은 천연자원으로부터 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착 저해제를 탐색한 결과, 필발 추출물, 그 분획물 또는 이들로부터 유래된 아마이드 화합물들 이 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착을 저해하는 효과가 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 필발을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 필발 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 필발 추출물을 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 용출 용매를 사용하여 얻어진, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 필발 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 필발 추출물 또는 화학식 1 내지 4의 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 필발을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 필발 추출물에 관한 것이다.

본 발명에서 필발 추출물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 필발 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메 탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C₁) 내지 4(C₄)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 필발 조추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 필발 추출물은 하기 실시예와 같이, 50 ㎍/㎖의 농도에서 sICAM-1과 사람 단핵구 세포주인 THP-1 세포(LFA-1이 발현) 간의 접착을 50 % 이상 저해하였다 (표 1). 따라서 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료에 적합하다.

본 발명의 필발 추출물은 상기와 같이 필발을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 후, 이를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 용출 용매를 사용하여 분획하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명은 상기 필발 추출물을 헥산 및 클로로포름을 용매로 하여 순차적으로 반복 추출하여 얻어진 클로로포름 분획물에 관한 것이다.

본 발명에서 추가되는 단계에서는, 상기 필발 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트 또는 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis , 3rd Ed. p6-7, 1998). 구체적으로, 상기 필발 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산 및 클로로포름을 용매를 이용하여 연속 추출로 필발 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 필발 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 클로로포름을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명에서 염증성 질환이란 상기 추출물에서 언급한 바와 같이, 전신성 홍반성 루푸스 및 경피증과 같은 다기관에 관련하는 자가면역질환; 궤양성 대장염 및 크론병 등을 포함하는 염증성 장 질환; 알츠하이머병, 다발성 경화증, 운동뉴런질환, 파킨슨병, 만성피로증후군과 같은 중추신경계 염증 질환; 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염 같은 IgE 매개성(타입Ⅰ) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 병성, 포도막염, 결막염과 같은 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후근 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 거대세포 동맥염과 같은 혈관질환; 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염 및 결핵같은 만성적 염증질환, 다중경화 및 만성 전립선염 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다(Mullins RF et al., Mol Vis. 30(12):224-35, 2006; Mason et al., Arthritis Rheum., 36:519-527, 1993; Kling et al., Clin. Invest., 71:299-304, 1993; Oh et al., Asthma and Immunology, 82(6):579-585, 1999; Klok et al., Br J Ophthalmol. 83(7):847~851, 1999; Poston et al., Am. J. Pathol., 140:665-673, 1992; Macchioni et al., J. Reumatol., 21(10):1860-1864, 1994; Papayianni et al., Nephrology Dialysis Transplantation, 17(3):435-441,2002; Hayashi et al., Clin Exp Immunol. 102(2):360-7, 1995; Sugimoto et al., Diabetes, 46(12) 2075-2081, 1997; Lavigne et al., Biological Therapy, 5(3):313-320, 2005; WO96/34015; US5,472,849). 또한, 본 발명에서 감염성 질환이란 리노바이러스(rhinovirus) 또는 HIV-1 에 의한 감염성 질환을 포함한다.

본 발명의 필발의 클로로포름 분획물은 하기 실시예와 같이, 50 ㎍/㎖의 농도에서 sICAM-1과 사람 단핵구 세포주인 THP-1 세포 간의 접착을 70 % 이상 저해하였다 (도 2). 따라서 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료에 적합하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 필발 추출물 또는 화학식 1 내지 4의 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 화학식 1 내지 4의 아마이드계 화합물들은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다. 본 발명에 따른 필발로부터 아마이드계 화합물의 추출, 분리 및 정제방법은 다음과 같다.

상기 클로로포름 가용성 분획물을 클로로포름 및 메탄올의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 이때, 클로로포름과 메탄올은 100:1 내지 0:100인 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 분리된 활성분획의 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 n-헥산 및 에틸아세테이트의 혼합용매(50:1 내지 0:100, v/v)를 사 용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리하고, 그 중 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 메탄올을 용출용매로 사용하여 역상 컬럼 크로마토그래피로 분리한다. 이렇게 얻어진 최종 분획 중 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성이 높은 분획들을 모아 90% 메탄올을 사용하여 5 ㎖/분으로 흘려주면서 HPLC(high performance liquid chromatography)로 화학식 1 내지 4의 화합물을 분리할 수 있다.

하기 실시예와 같이, 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 25 ㎍/㎖ 에서 sICAM-1과 THP-1세포와의 접착을 약 40 % 저해하였고, 화학식 3 및 화학식 4의 화합물은 90% 이상 저해하였으며, 본 발명의 화합물은 농도가 증가할수록 sICAM-1과 사람 단핵구 세포주인 THP-1 세포 간의 접착을 효과적으로 억제하였다 (도 3). 따라서 본 발명의 화학식 1 내지 4의 화합물은 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료에 적합하다.

본 발명의 필발 추출물 또는 화학식 1 내지 4의 화합물들은 ICAM-1과 LFA-1 매개성 세포접착 저해활성로 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내피세포에 접착하고 침투하는 것을 저해하여 염증관련 질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 아마이드계 화합물은 필발로부터 추출, 분리, 정제하여 사용하였으나, 통상적인 모든 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 시약을 사용할 수 있다. 본 발명의 필발 추출물 또는 화학식 1 내지 4의 화합물들은 오랫동안 생약으로 사용되어오던 약제인 필발로부터 유래한 것이므로 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 필발 추출물 또는 화학식 1 내지 4의 화합물을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%로 포함한다.

본 발명의 필발 추출물 또는 화학식 1 내지 4의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크 같은 활택제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 또는 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 또는 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 또는 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 필발 추출물 또는 화학식 1 내지 4의 화합물은 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착을 저해하여 단핵구, 호중구 및 임파구와 같은 혈구세포가 혈관내피세포에 접착하고 침투하는 것을 저하시키는데 유효하므로, 염증성 질환 및 ICAM-1을 이용하여 감염되는 감염성 질환의 예방 및 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명은 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1. 필발로부터 아마이드 계 화합물의 추출, 분리 및 정제

1-1. 필발로부터 추출

필발은 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조한 후, 와링 브랜드로 분말화 시켰다. 분말화된 필발 100 g에 건조된 필발 중량에 대해 3배의 메탄올을 가하여 7일간 실온에서 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 감압 농축하여 조추출물을 얻었다.

상기 조추출물에서 활성물질을 분리, 정제하기 위하여, 필발 조추출물을 물 에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하였고, 이 수가용성 분획물에 클로로포름을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득하였다. 수득한 분획물들을 하기 실시예 2의 방법에 의해 세포간 접착 저해활성을 측정하였더니, 클로르포름층에서 가장 우수한 세포간 접착 저해활성을 나타내었다.

1-2. 클로로포름층의 분리 및 정제

상기 실시예 1-1에서 얻은 클로로포름층을 감압 농축하고(7.5g), 클로로포름:메탄올 = (100:1 내지 0:100)으로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다.

상기 분리된 활성분획의 세포간 접착 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아, 용출용매로 n-헥산:에틸아세테이트 = (50 : 1 내지 0 : 100)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다. 상기 활성분획 중 세포간 접착 저해활성이 가장 높은 분획을 모아 80% 및 90% 메탄올을 용출 용매로 사용하여 5 ㎖/분으로 흘려주면서, 고속액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography; HPLC, YMC Jsphere ODS H-80, 150 ×20 ㎜)를 실시하여 네 종의 순수화합물을 얻었다. 활성물질의 검출은 UV 210㎚에서 행하였으며, 세포간 접착 저해활성 물질은 25분(화학식 1), 30분 (화학식 2), 41분 (화학식 3) 및 54분 (화학식 4)에 용출되었다.

1-3. 활성물질의 구조 분석

완전히 분리정제된 화합물 1은 짙은 무색의 결정성 분말로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 406 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₄H₃₃NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 261㎚에서 나타났으며, 295 내지 305㎚에서 shoulder 흡수가 나타났으므로 화합물의 구조중에 컨주게이트된 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였다. 비율 기록 적외선 분광기 (Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)를 이용하여 IR 흡광도를 측정한 결과 -NH- (3300 ㎝^-1)의 존재가 확인되었다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험중에, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 한개의 메틸렌디옥시 프로톤(methylenedioxy proton, 5.74, d, J=15.3)이 관찰되었으며, δ6.0~7.3 사이에 9개의 올레핀 프로톤(olefinic proton)이 관찰되었다. 한편, δ3.15에서 -NH-와 결합하는 메틸렌 프로톤 (methylene proton)이 관찰되었다. 상기 측정 결과는 아미드(amide) 결합을 구조중에 포함하는 귀넨신의 구조와 아주 유사하므로, 발표된 문헌(Banerji A., J. Banerji and A. Chatterjee 1980. Structure & Sterochemisty of an alkamide from Piper sylvaticum: Indian J Chemistry 19B, 346-349)의 데이타와 비교 분석한 결과, 화학식 1의 화합물은 귀넨신으로 판명하였다.

완전히 분리정제된 화합물 2는 짙은 무색의 결정성 분말로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 352 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₀H₂₇NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 261㎚에서 나타났으며, 295 내지 305㎚에서 shoulder 흡수가 나타났으므로 화합물의 구조중에 컨주게이트된 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였다. 비율 기록 적외선 분광기 (Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)를 이용하여 IR 흡광도를 측정한 결과 -NH- (3303 ㎝^-1)와 카르보닐 그룹 (1667 ㎝^-1) 의 존재가 확인되었다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험중에, ¹H-NMR 스펙트럼은 화합물 1과 유사한 signal이 관찰되었다. 그리고 ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 20개의 탄소에서 기인한 signal이 관찰되었다. 이상의 기기분석 스펙트럼 및 기존에 보고 된 데이타(Banerji, A., Bandyopadhyay, D., Sarkar, M., Siddhanta, A. K., Pal, S. C., Ghosh, S., Abraham, K. and Shoolery, J. 1985. Structural and synthetic studies on the retrofractamides-amide constituents of Piper retrofractum. Phytochemistry 24, 2799)와 비교 분석한 결과, 화학식 2의 화합물은 아이소부틸아마이드계의 화합물인 레트로프렉타마이드 씨(retrofractamide C)로 판명하였다.

완전히 분리정제된 화합물 3은 무색의 오일 상으로, 분자량을 측정한 결과 [M+H]⁺가 m/z 340 이었으며, 고분해 FAB-MS 에서 분자식이 C₂₁H₂₅NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 최대 흡수치가 207㎚ 과 261㎚에서 나타났으며, 295 내지 303㎚에서 shoulder 흡수가 나타났으므로 화합물의 구조중에 컨주게이트된 디엔아미드(dienamide)가 존재할 것으로 추정하였다. 화합물의 구조를 결정하기 위해 NMR 시험을 행하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 카보닐 탄소(carbonyl carbon, δ165.80)가 관찰되었으며, 더블 본드의 메틴 탄소(methine carbon, δ120.59, δ121.26, δ121.26, δ130.43, δ137.34, δ138.39)가 6개 관찰되었다. 한편, 한개의 메틸렌디옥시 탄소(δ101.12) 와 벤젠고리의 메틴 탄소(δ105.71, δ108.41, δ120.60)가 세 개 관찰되었으며, 피페르딘기의 메틸렌 탄소(δ46.76), 메틴 탄소(δ28.51)가 6개 관찰되었다. ¹H-NMR 스펙트럼에서는 한개의 메틸렌디옥시 프로톤(methylenedioxy proton, 5.93, s)이 관찰되었으며, δ6.74~6.88 사이에서 세 개의 벤젠고리의 메틸렌 프로톤(methylene proton)이 관찰되었다. δ6.03 과 δ6.27의 메틸렌 프로톤이 각각 관찰되었으며, 이 프로톤들은 HMBC 스펙트럼에서 벤젠고리의 탄소(δ105.36, δ108.18, δ120.16) 및 메틸렌 탄소 (δ29.23, δ36.93)와 먼 거리 결합(long-rang couping) 이 관찰되어, 벤젠고리의 옆에 위치함을 추정할 수 있었다. 한편, δ5.44에서 -NH-의 프로톤(br s)이 관찰되었으며, δ1.34~2.17에서 여섯 개의 메틸렌 프로톤(methylene proton)이 관찰되었다. 또한, δ3.08에서 -NH-와 결합하는 메틸렌 프로톤, δ1.76의 메틴 프로톤(methine proton) 그리고 δ0.92 과 δ0.89에서는 메틸 프로톤이 관찰되었으며, 이 프로톤들로부터 아이소 부틸기(isobuthyl group)의 존재를 추정할 수 있었다. 상기 측정 결과와 기존의 문헌(Kikuchi, F., NAkamura, N., Tsuda, Y., Kondo, K. and Yoshimura, H. 1988. Studies on crude drugs effective on Visceral larva migrans. IV. isolation and identification of Larvicidal priciples in pepper: Chem Pharm Bull 36, 2452-2465)에 발표된 화합물 1-[(E)-9-(3,4-methylenedioxy phenyl)-8-nonenoyl]pyrrolidine을 비교한 결과, 화합물 3은 피롤리딘기(pyrrolidine group) 대신에 아이소 부틸 아미드(amide) 결합을 구조 중 에 포함하는 화합물인 9-(3,4-methylenedioxyphenyl)-8-nonenoyl] isobutyl amide로 판명되었다.

완전히 분리정제된 화합물 4 는 엷은 노란색의 오일로, 분자량을 측정한 결과 [M+Na]⁺가 m/z 364 이었으며, ESI-MS 에서 분자식이 C₂₁H₂₇NO₃로 추정되었다. 화합물의 자외선 흡광도를 측정한 결과 210 과 268 nm 에서 흡수가 나타났으며, 비율 기록 적외선 분광기 (Bio-Rad Digilab Division, FTS-80)를 이용하여 IR 흡광도를 측정한 결과 카르보닐 그룹 (1656㎝^-1) 의 존재가 확인되었다. 화합물의 구조를 결정하기 위한 NMR 시험 중에, ¹H-NMR 스펙트럼에서는 4개의 olefinic 프로톤의 signal이 δ 6.00 (1H, dt, J = 15.9, 6.6 Hz, H-2), 6.80 (1H, dt, J = 15.3, 6.9 Hz, H-3), 6.23 (1H, dt, J = 15.3, 2.1 Hz, H-8) 그리고 6.26 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-9)에서 관찰되었으며, 메틸렌디옥시 프로톤이 δ 5.90 (s)에서 관찰되었다. 또한, 두 개의 아릴릭 메틸렌 프로톤과 피페리딘 (piperidine) 링과 겹쳐지는 5개의 메틸렌 프로톤이 δ 2.12-2.24 (4H, m) 및 δ 1.43-1.68 (10H, m)에서 각각 관찰되었고, 피페리딘 링의 브로드한 두 개의 싱글렛 피크는 N의 영향으로 δ 3.45 및 3.57 (each 2H, br s)의 저자장 영역에서 관찰되었다. 그리고 ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 21개의 탄소가 존재함이 관찰되었다. 카르보닐 탄소, 메틸렌다이옥시 group의 탄소, 4개의 메틸렌 탄소 및 올레핀 탄소 그리고 피페리딘 과 벤젠 링의 탄소 가 관찰되었다. 이상의 기기분석 스펙트럼 및 기존에 보고된 데이터 (Yang YC, Lee SG, Kim MK, Lee SH, Lee HS. A piperidine amide extracted from Piper longum L. fruit shows activity against Aedes aegypti mosquito larvae. J. Agric. Food Chem. 2002; 50: 3765-3767) 와 비교한 결과, 화합물 4는 피페리딘 아마이드계의 화합물인 피페노날린 (pipernonaline)으로 판명되었다.

실시예 2. 필발 추출물의 세포간 접착 저해활성측정

CHO-ICAM-1 과 CHO-K1 세포는 각각 1x10⁴ cells/200 ㎖ 및 1x10⁵ cells/200 ㎖ 을 시딩(seeding)한 후 96-웰 플레이트에서 3일간 배양하였다. THP-1 세포 (1x10⁶ cells/㎖)는 BCECF-AM (5 mM) 첨가 후 30~60분간 37℃에서 반응시켜 형광 표 지한 뒤 RPMI 1640 배지로 1회 세척하였다. 1x10⁶ cells/㎖ 로 조절한 THP-1 세포를 CHO-ICAM-1 또는 CHO-K1 cells이 완전히 자란 상태의 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 처리하였다. 이 96-웰 플레이트에 LFA-1의 활성을 증가시키는 LFA-1/2 항체 (500 ng/㎖) 및 시료를 5 ㎖씩 처리한 후 30분간 37℃에서 반응시켰다. 반응 후 결합하지 않은 THP-1 세포를 제거하기 위하여 배지를 150 ㎕씩 넣고 봉인(sealing) 한 후 96-웰 플레이트를 뒤집어 30분간 상온에서 방치하였다. 배지는 제거하고, PBS로 3회 세척한 뒤 PBS (1% Triton X-100)로 세포를 가용화 시킨뒤 형광 (ex, 485, em. 592) 을 측정하였다.

필발의 에탄올 추출물을 세포배양액에 첨가하여 세포접착저해 활성을 측정하였고, 그 결과, 필발의 에탄올 추출물은 LFA-1/2 항체에 의해 유도된 세포접착을 50 ㎍/㎖의 농도에서 60% 의 저해활성을 확인하였다 (표 1).

	형광도 (ex. 485- em. 590)	저해율 (%)
LFA-1/2 항체 (-)	15770	100
LFA-1/2 항체 (+)	32312	0
LFA-1/2 항체 (+) + 필발 에탄올 추출물 (50 ㎍/ml)	20860	69.23

실시예 3. sICAM -1과 THP -1 세포 간의 결합저해 활성

재조합 sICAM-1 (R&D Systems, Abingdon, UK)을 10 ㎍/㎖ (in PBS)로 희석한 후, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 4 ℃에서 12시간 반응시켰다. PBS로 1회 세척하고, 10 mg/㎖ BSA를 100 ㎕ 씩 넣고 상온에서 1~2시간 차단했다. THP-1 세포 (1x10⁷ cells/㎖)는 BCECF-AM (5 μM) 첨가 후, 30~60분간 37 ℃에서 반응시켰다. THP-1 세포를 PBS로 세척하고 LFA-1/2 항체 (500 ng/㎖)를 처리하여 37 ℃에서 10 내지 20분간 반응시킨 후, THP-1 세포와 시료를 재조합 sICAM-1이 코팅되어있는 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 씩 넣고 37 ℃에서 30 내지 60분간 반응시켰다. 반응 후 결합하지 않은 THP-1 세포를 제거하고, PBS로 3회 세척하였다. PBS (1% Triton X-100)로 세포을 가용화 시킨 뒤 형광 (ex. 485, em. 592)을 측정하였다.

필발의 에탄올 추출물 및 클로로포름 분획은 50 ㎍/㎖의 농도에서 sICAM-1및 THP-1 세포 간의 접착을 각각 50 및 70 % 이상 저해하였다 (도 1 및 도 2).

본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 25 ㎍/㎖ 에서 sICAM-1과 THP-1세포와의 접착을 약 40 % 저해하였고, 화학식 3 및 화학식 4의 화합물은 90% 이상 저해하였으며, 본 발명의 화합물은 농도가 증가할수록 sICAM-1과 사람 단핵구 세포주인 THP-1 세포 간의 접착을 효과적으로 억제하였다 (도 3).

실시예 4. 실험용 생쥐에 대한 경구투여 급성독성 시험

6 주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트(rat)를 군당 5 마리씩으로 나누어, 본 발명의 필발 추출물 및 그 분획물 또는 피페노날린으로 대표되는 아마이드계 화합물을 0.5% 메틸셀룰로오즈 용액에 현탁하여 10 mg/kg의 용량으로 단회 경구투여 하였다. 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 시료를 투여한 동물에서는 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학적 검사 및 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 실험한 상기 화합물은 랫트에서 10 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 mg/kg 이상인 물질로 판단되었다.

실시예 5. 제형화

5-1. 산제의 제조

필발 추출물 및 그 분획물 또는 아마이드계 화합물 0.1g, 유당 1.5g, 및 탈크 0.5 g 을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

5-2. 정제의 제조

필발 추출물 및 그 분획물 또는 아마이드계 화합물 0.1 g, 락토스 7.9 g, 결정성 셀룰로오스 1.5 g 및 마그네슘 스테아레이트 0.5 g을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 500 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 50 ㎎이다.

5-3. 분말제의 제조

필발 추출물 및 그 분획물 또는 아마이드계 화합물 0.1 g, 옥수수전분 5 g 및 카르복시 셀룰로오스 4.9 g 을 잘 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

5-4. 주사제의 제조

필발 추출물 및 그 분획물 또는 아마이드계 화합물 0.1 g, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

5-5. 액제의 제조

필발 추출물 및 그 분획물 또는 아마이드계 화합물 0.1 g, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g 및 정제수 적량을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

도 1은 필발의 에탄올 추출물이 가용성 ICAM-1 (sICAM-1) 및 THP-1 세포 간의 접착을 저해하는 저해활성 정도를 나타낸 것이다.

도 2는 필발의 클로로포름 분획물 및 물 분획물이 가용성 ICAM-1 (sICAM-1) 및 THP-1 세포 간의 접착을 저해하는 저해활성 정도를 나타낸 것이다.

도 3은 필발의 클로로포름 분획물로부터 분리된 화학식 1 내지 4의 화합물이 가용성 ICAM-1 (sICAM-1) 및 THP-1 세포 간의 접착을 저해하는 저해활성 정도를 나타낸 것이다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 화학식 1 내지 4의 화합물 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 ICAM-1 및 LFA-1 매개성 세포접착에 의해 유발되는 염증성 질환으로서 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 크론병, 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 혈관협착, 가와사키병, 거대세포 동맥염, 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부 및 만성 전립선염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환, 또는 리노바이러스 또는 HIV-1에 의한 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

   
8. 제 7항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 제 7항에 있어서, 화학식 1 내지 4의 화합물이 필발(Piper longum)로부터 분리된 물질인 조성물.

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