KR100257183B1 - 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 paf-길항제 - Google Patents

측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 paf-길항제 Download PDF

Info

Publication number
KR100257183B1
KR100257183B1 KR1019930013598A KR930013598A KR100257183B1 KR 100257183 B1 KR100257183 B1 KR 100257183B1 KR 1019930013598 A KR1019930013598 A KR 1019930013598A KR 930013598 A KR930013598 A KR 930013598A KR 100257183 B1 KR100257183 B1 KR 100257183B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
paf
compound
pinusolide
antagonist
induced
Prior art date
Application number
KR1019930013598A
Other languages
English (en)
Other versions
KR950002770A (ko
Inventor
한병훈
양현옥
Original Assignee
우재영
일양약품주식회사
한병훈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 우재영, 일양약품주식회사, 한병훈 filed Critical 우재영
Priority to KR1019930013598A priority Critical patent/KR100257183B1/ko
Publication of KR950002770A publication Critical patent/KR950002770A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100257183B1 publication Critical patent/KR100257183B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/13—Coniferophyta (gymnosperms)
    • A61K36/14—Cupressaceae (Cypress family), e.g. juniper or cypress
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/35—Extraction with lipophilic solvents, e.g. Hexane or petrol ether

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이 피누솔라이드를 주성분으로 함유하는 PAF-길항제에 관한 것이다.
본 발명자들은 측백엽(側柏葉)으로부터 PAF 수용체 결합 저해 활성이 강한 유효성분을 순수분리, 동정하여 그 유효성분이 피누솔라이드라는 것을 확인하고, 이것의 새로운 활성인 PAF-수용체 결합 저해 활성을 새로이 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 방법에 따라, 측백엽을 헥산으로 추출하여 얻어진 헥산추출물을 정제하여 피누솔라이드를 제조할 수 있으며, 이를 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 보조제와 혼합하고 통상의 약제학적으로 사용되는 방법으로 제형화하여 상기 피누솔라이드를 유효성분으로 함유하는 PAF-길항제제를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 상기의 제제는 국소 염증 억제효과가 있다

Description

측백엽으로부터 피누솔라이드(pinusolide)를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 PAF-길항제
본 발명은 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이 피누솔라이드를 주성분으로 함유하는 PAF-길항제에 관한 것이다.
본 발명자들은 측백엽(側柏葉)으로부터 PAF 수용체 결합 저해 활성이 강한 유효성분을 순수분리, 동정하고, 그 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
혈소판 활성 인자(Platelet Activating Factor, 이하 "PAF"라 함)는 면역글로불린 E(Immuno-globulin E) 등이 관여하는 면역반응시 각종 면역 담당세포에서 방출되며 [Benveniste, J., Hwnaon. P. M. and Cochrane., C. G., J. Exp. Med. 136, 1356-1377(1972)], 혈소판 막(膜)에 있는 수용체(receptor)에 결합하여 혈소판을 활성화시키고, 각종 세포들(혈소판, 백혈구(leukocyte)등)의 응집반응 및 이와 관련된 여러가지 생화학적 세포내 반응을 개시하여 일어나는 말초 순환 장애와 같이 관련되어 있다. [Snyder, F., Medical Res. Review 5, 107-140 (1985); Mclytre, T. M., Zimmerman, G. A., Satoh, K. and Prescott, S. M., J. Clin, Inv. 76, 271-280 (1985); Hayashi, H., Kudo, I., Inoue, K., Onozaki, K.,, Tsushima, S., Nomura, H., and Nojima, S., J. Biochem., 97, 1737-1745 (1985)]. 뿐만 아니라, 혈관투과성을 증가시켜 급성 염증을 일으키고, 기관지수축과 과민반응으로 천식을 일으키고, 장기이식에 대한 거부반응, 심장성 아나필락시(cardiac anaphylaxis), 내독소 쇼크(endotoxin shock), 위궤양, 급성 알러지(allergy)반응, 알러지성성 피부염, 동상과 같은병리적 반응과 깊이 관련되어 있음이 최근 연구에 의하여 밝혀지고 있으며, 종전에 알려진 각종 오타코이드(autacoid)[히드타민(histamine), 류코트리엔(leucotrien es), 프로스타글란딘(prostaglanidins)]들 보다 1000분지 1 내지 10000분지 1의 저농도에서 이들 오타코이드들의 합성 또는 방출을 일으키는 이른바 과격한 면역반응으로 인한 자기 파괴적인 병리적 반응의 개시인자로 알려지고 있다. 각종 면역반응이 일어나는 것은 근본적으로 자기 방어를 위한 반응이지난 그 방어 반응으로 인한 후속 반응들 중 자기 파괴적인 반응이 paf와 관련되어 있다. paf-길항제(PAF-antagonist)는 PAF가 혈소판의 막에 있는 수용체와 결합하는 것을 방해하는 물질로서 PAF의 수용체 결합이 방해받고 있는 동안에 혈장 중의 가수분해 효소(acetyl hydrolase) 등에 의하여 PAF가 파괴되면 불활성화되기 때문에 이 자기 방어적인 면역반응에 대해서는 그대로 두고 그 후속반응인 자기 파괴적인 반응을 막아줄 수 있을 것이라는 기대 하에 많이 연구되고 있는 물질이다[Benveniste, J., Henson. P. M. and Cochrane., C. G., J. Exp. Med. 136, 1356-1377(1972); Snyder, FJ., Medical Res. Review 5, 107-140 (1985); Mclytre, T. M., Zimmerman, G. A., Satoch, K. and Prescott, S. M., J. Clin. Inv. 76, 271-280 (1985); Hayashi, H., Kudo, I., Inoue, K., Onozaki, K., Tsushima, S., Nomurea, H., and Nojima, S., J. Biochem., 97, 1737-1745(1985); 工藤一郞, 井上圭三, 炎症, 7,309 (1989); 工藤一郞, Med, Immunol., 11, 707(1986); 井上圭三 , 代謝, 23, 891-899(1986); 和久敬莊, 代謝, 24, 625-639 (1987); 和久敬莊, 井上圭三, 血小板 活性化因子, 東京化學同人 (1989)]
현재까지 알려진 PAF 특이 길항제는 PAF 구조 관련 길항제와 천연물에서 유래한 길항제로 크게 나눌 수 있다. 주로 합성품인 PAF 화학 구조 유사체는 이미 많은 연구가 진행 되어 있다[和久敬莊 , 井上圭三, 血小板 活性化因子, 東京化學同人 (1989); Z. Terashita, S. Tsushima, Y. Yoshioka, H. Nomura, Y. Inada and K. Nishikawa, Life Sci., 32, 1975 (1983); T. Miyamoto, H. Ohno, T. Yano, T. Okada, N., Hamanaka and . Kawasaki, Adv. PG TX LT Res., 15, 719 (1985); M. L. Lee, C. M. Winslow, G. F. Frisch, C. Jaeggi, F. J. D'Aries, A. K. De Lillo and R. C. Anderson, 'New Horizons in Platelet Activating Factor Reserch', ed. by M. L. Lee and C. M. Winslow, 61, John Wiley (1985); D. A. Handley, J. D. Tomesch and R. N. Saunders. Thromb. Haemostasis, 56, 40 (1986); Z. Terashita, Y. Imura, M. Takatani, S. Tsushima and K. Nishikawa, J. Pharmacol. Exp. Ther., 242, 263 91987); D. A. Hadley, R.G. Vand Valen, M. K. Melden, S. Flury, M.L. Lee, R. N. Saunders, Immunopharmacology, 12, 11 (1986); A. Tokumura, H. Homma, DJ. J. Hanahan, J. Biol. Chem., 260, 2710 (1985); P. Hadvary, H. R. Baumgartner, Prostaglandins, 30, 694 (1985); QTLEK. Wichrowski, S. Jouquey, F. Heymans, C. Broquet, J. . Golfroid, J. Fichelle, M. Worcel, "6th Int. Conference on Prostaglandins and Related Compounds", Jun e 3-6, Florence(Italy), Abst (1986); 中村紀雄 , 小池博之 , 大島 武史, 脂質生化學硏究, 30, 395 (1988)].
그리고, 천연물에서 유래한 PAF 길항제로 몇가지 알려져 있는데 그들의 구조에서 보면, PAF의 구조와 전혀 관련이 없으면서도 강한 활성을 나타내며, 지금까지 알려져 있는 길항제들도 여러 계열의 물질들이어서 천연물에서 기대할 수 있는 PAF 길항제는 그 구조에서 매우 광범위한 다양성이 예측된다. 천연물에서 유래한 PAF 길항제는 외국에서 일부 연구 되었지만[P. Braquet, GB patent 84/18, 424 (1984), Belg, BE 901, 915 (1985); P. Braqueet, B. Spinnewyn, M. Braquet, R.H. Bourgain, J. E. Taylor, A. Etienne, K. Drieu, BLOOD Vessels, 16, 559 (1985); P. Braquest, "Advances in Prostaglandin, Thromboxane, and Leukotriene Research", vol. 16, p.179. Raven Press, New York (1986); L. T. Kuster, J. Filep, J. C. Frolich, Thromb, Res., 43, 425 (1986); D. Nunez, M. Chignard, R. Korth, J.P. Le Couedic, X. Norel, B. Spinnewyn, P. Braquet, J. Benveniste, Eur. J. Pharmacol., 123, 197(1986); D. Nunez, D. Delautier, P. Braquet, J. Benveniste, "Sixth International Conference on Prostaglandins and Related Compounds", p. 319, Florence, Italy, Jun e(1986); S. Desquand, C. Touvay, J. Randon, V. Lagente, I. Maridonneau-arini, J. Lefort, A. Etienne, P. Braquet, B. B. Vargaftig, Eur. J. Pharmacol, 127, 83(1986); C. Touvay, B. Vilain, J.E. Taylor, A Etienne, Prog. Lipid. Res., 25, 277 (1985); T. Y. Shey, S.B. Hwang, M.N. Cahng, T. W. Doebber, M.H.T. Lam, M.S. Wu, X. Wang, C.Q. Han, R. Z. Li, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 672(1985); T. W. Doebber, M. S. Wu, J.C. Robbins, B. M. Choy, M.N. Chang, T. Y. Shen, Biochem. Biophys. Res. Commun., 127, 799 (1985); S.B. Hwang, C. L. Li, M.H. Lam. T. Y. Shen, Lab. Invest., 52, 617 (1985); S.B. Hwang, M.H. Lam, T. Bifu, T.R. Beattie, T-Y. Shen, J. Biol. Chem., 260, 156039 (1985); S. B. Hwang. M.N. Chang, M. L. Garcia, Q. Q. Hand, L. Huang, V. F. King, G. J. kaczorowski and R. J. Winquitst, Eur. J. Pharmacol., 141, 269 (1987); T. Biftu, N. F. Gamble, T. Doebber, S. B. Hwang, T. Y. Shen, J. Snyder, J. P. Springer, R. Stevenson, J. Med. Chem., 29, 1917 (1986); M. Okamoto, K. Yoshida, I. Uchida, M. Nishikawa, M. Kohsaka, H. Aoki, Chem. Pharm. Bull., 34, 340 (1986); N. Shimazaki, I. Shima, K. Hemmi, M. Hashimoto, Chem. Pharm. Bull., Tokyo, 35, 3527 (1986); M. Okamoto, K. Yoshida, M. Nishikawa, T. Ando, M. Iwami, M. Kohsaka, H. Aoki, J. Antibiot., Tokyo, 39, 198 (1986); S. Iwakami, Jin-Bin Wr, Y. Ebizuka and U. Sankawa, Chem. Pharm. Bull 40(5), 1196 (1992)], 국내 생약 자원에서는 연구된 적이 없다.
이에, 본 발명자들은, 지금까지와는 다른 화학 구조를 가진 PAF 길항제가 국산 생약중에 있을 것이라는 기대하에, 민간과 한방에서 각종 말초 순환 장애(류마티즘, 천식, 혈전증, 알러지성 질환 등)에 사용하고 있는 국내 생약 202가지를 대상으로 PAF 수용체 결합 저해 효과를 검색하였고, 측백엽에서 강력한 저해활성(沮害活性)을 인지(認知)하여 그 유효 성분 분리에 착수하였다.
그 결과, 측백엽에서 PAF 수용체 결합 저해 활성이 강한 유효성분 화합물 X(C21H30O4, M.W.=346, mp 82-83℃, IC50=2.56x10-7M)를 순수 분리하였으며, 그 화학 구조는 피누솔라이드(Pinusolide)로 규명되었다.
화합물 X에 대하여 PAF로 유도한 혈소판 응집 억제효과를 측정한 결과 PAF 일정 농도에서 용량 의존적인 억제율을 보였으며, 화합물 X는 혈소판의 PAF 수용체에 상경적(相競的)으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 트롬빈(Thrombin), ADP, 콜라겐(Collagen)으로 유도한 혈소판 응집 억제실험에서는 PAF로 유도한 실험에서와는 달리, 화합물 X가 혈소판 응집을 전혀 억제 하지 못했거나 억제 작용이 극히 미약하였으므로, 화합물 X는 PAF 수용체에 특이적인 억제자(specific inhibitor)임을 밝혔다.
또한, 화합물 X는 크로톤 유(croton oil)로 유도한 마우스 귀-부종 생물검사(mouse ear-edema bioassay)를 했을 때, 국소 염증 억제 효과(2mg/ear, 32% inhibition)가 있음을 밝혔다.
본 발명에서 분리제조한 피누솔라이드는 1970년에 피누스 시비리카 수지(Pinus sibirica resin)에서 처음 분리, 보고된 이래[V. A. Raldugin, A. I. Lisina, N. K. Kashtanova and V. A. Pentegova, Chem. Nat. Compds., 6(5), 559( (1970)], 칼로세드루스 데쿠렌스(Calocedrus decurrens)의 수지에 다량 함유(6.5% of resin)되어 있고[L. J. Gough, J. S. Mills, Phytochem. 13, 1612 (1974)], 시아도피티 버티실라타(Sciadopity verticillate)[S. Hasegawa and Y. Hirose, Phytochem., 24(9), 2041 (1985)], 백자인(측백나무의 종자)[M. Inoue, S. Hasegawa and Y. Hirose, Phytochem., 24(7), 1602 (1985)]에서도 분리 보고된 바 있으나, 측백엽에서는 보고된 바 없었고, 또한 피누솔라이드의 PAF-갈항제 활성에 관하여 보고한 문헌은 나타나지 않고 있다.
즉, 피누솔라이드의 PAF-길항제활성은 본 발명에 의하여 처음으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 목적는 측백엽에서 피누솔라이드를 추출하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 피누솔라이드를 주성분으로 함유하고 통상의 부형제 또는 보조제와 혼합하여 제조된 PAF-길항제의 약학적 제제를 제공하는 것이다.
이하 실시예 및 실험예로서 본발명을 자세히 설명한다.
[실험재료]
1. 시약 및 기기
1) 시약
칼럼 크로마토그라피(이하 CC라 함)용 실리카겔은 키젤겔 60(Kieselgel 60; 230-400 mesh ASTM, Merck Art. 9385)을, 박층 크로마토그라피(이하 T LC함)용 전피복 평판(precoated plate)은 키젤겔 60 F254(layer thickness 0.25mm, 20 x 20cm, Merck Art. 5715)를 사용하였으며, T LC 점적(spot)의 발색은 254nm UV lamp 및 I2증기, 그리고 분무 시약(spray reagents)으로는 10% H2SO4과 드라겐도르프(Dragendorff) 시약을 사용하였다.
PAF는 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)(C18-PAF)과 시그마(Sigma )(C16-PAF)에서,3H-PAF 는 아머샴(Amersham Co.)에서 구입하였으며, 소혈청 알부민(Bovine Serum ALbumin, 이하 BSA라 함)은 뵈링거 만하임(Fraction V)에서, 트롬빈, 콜라겐은 크로노-로그(Chrono-log Co.)에서, POPOP, 2, 5-디페닐옥사졸 (2, 5-diphenyloxazol, 이하 PPO라 함), 크로톤 유(Croton oil)는 시그마에서 구입하였고, CV 6209는 다께다(Takeda Co.)에서 제공받았다. 그외 다른 시약은 특별한 언급이 없는 한 1급 시약(EP)을 사용하였다.
2) 기기
pH meter : Analab 88
Centrifuge : RT 6000, Sorvall Co.
Platelet counter : Chrono-log, Model PLT-4
Aggregometer : Chrono-log, Whole blood aggregometer
Micrometer : 0.01mm unit, Fowler precision Tools
Multichannel autopipette : Rainin Co.
Autopipette : Gilson Co.
Cell harvester : Skatron Co.
GF-C filler : Skatron (glass fiber)Co.
Liquid scintillation counter : Hewlet Packard Co.
Scintillation vial : Boehringer Mannheim (6ml) Co.
mp : Mitamura Riken Heat Block Model-MRK로 측정하고 보정하지 않았다.
Mass : VG TRIO-II GC/MS system
Hewlet Packard Model HP 5985 B GC/MS system (70eV, 30eV)
2. 실험 동물 및 생약 원료
토끼는 체증 2-3Kg 되는 수컷(white)을, 마우스는 ICR계(male and female, 20-25g), 쥐(rat)는 스프라그-돌리(Sprague-Dawley)계(male, 200-300g)를 사용하였으며, 본 실험에 사용한 모든 생약은 시중 한의원에서 구입한 건조 생약을 원료로 하였다.
[실험방법]
1. 생약중의 PAF 수용체 결합 저해 활성 측정
1) PAF 수용체 결합 저해 활성 측정 방법
(1) 혈소판 현탁액의 조제
ACD 용액 (트리소듐 시트레이트 2.5%, 시트릭 애시드 1.37%, 글루코스 2%) 1 용량을 주사히게 미리 취한 후, 토끼 (2-3kg, white, male)의 심장에서 혈액을 5 용량 취하여 섞은 후 1200 rpm에서 10분간 원심 분리하여 PRP를 얻는다. PRP를 다시 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈소판 소결정(pellet)을 모아, 트리스-타이로드 완충액(Tria-tyrode buffer)(pH 7.3, 0.01M)를 가하여 섞은 후 다시 원심 분리하여 얻은 혈소판 소결정(pellet)에 적량의 완충액(0.25% BSA 함유)을 가하여 2 x 108 cell/ml이 되도록 희석한다.
(2)3H-PAF 용액의 조제
3H-PAF 일정량을 취하여 N2기체 하에서 용매를 제거한 후 완충액 (0.01 M 트리스-타이로드 완충액, pH 7.3, 0.25% BSA) 일정량(최종농도 1.2 nM이 되도록)을 가하여 약 2분간 초음파처리(sonication)하였다.
(3) 실험 조건 설정
최적 반응 조건을 찾기 위한 기초 실험으로 반응시간과3H-PAF 농도를 변화시켜 특이적 결합(specific binding)이 포화농도에 이르게 하는 최소의 반응시간과3H-PAF의 최소 농도를 아래에 기술한 실험 방법으로 구하였다.
(4) 실험방법
PAF 수용체 결합 저해 활성 측정은 발론(Valone)의 방법[F. H. Valone, E. Coles, V.R. Reinhold, et al., J. Immunol, 129, 1637 (1982)]을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 총 결합(total binding)은 검액 25 μl에 혈소판 현탁액 200μl를 가한 후 6분간 전배양(preincubation)하고,3H-PAF (60,000dpm, 최종농도 0.6nM)을 가하여 60 분간 배양한 후 여과하였다. 비특이적 결합(Nonspecific binding)은3H-PAF 용액 대신3H-PAF와 cold-PAF의 혼액(최종농도3H-PAF 0.6nM, cold-PAF 300 nM) 25μl를 가하였으며, 대조군(control)은 검액 대신 증류수(혹은, 식염수(saline)) 25μl를 사용하였다. 반응 중단은 위에서 사용한 완충액으로 여과기(f ilter)(Skatron Co.)를 미리 적신 후 세포 수확기(Cell havester)를 사용하여 감압 여과하고, 빙냉 완충액(ice-cold buffer)으로 세척(washing)하였다.
여과기에 남아 있는 방사능(radioactivity)을 측정함으로써 혈소판 막에 결합된3H-PAF의 양을 계산하였다. 모든 실험은 실온(18-22℃)에서 실시하였고, 모든 측정치는 4검체의 평균치로 표시하였다.
PAF 수용체에 결합된 특이적 결합은 다음 식에 의해 계산하였다.
특이적 결합=총 결합-비특이적 결합
또한, 검체에 의한 PAF 수용체 결합 저해율(Inhibition(%))은 다음 식에 의하여 산출하였다.
(5) 방사능의 측정
여과기(GF-C glass fiber)는 상온에서, 하룻밤 건조시킨 후, 톨루엔계 혼합 용액(cocktail solution; PPO 4g, POPOP 0.1g in iL toluene)을 1병(vial)당 2ml씩 가하여 액체 신릴레이션 계수기(Liquid Scintillation counter)로 방사능(dpm)을 측정하였다.
2) 생약중의 PAF 수용체 결합 저해 활성 측정
(1) 검액의 조제
검액의 조제는 각각의 건조 생약 10g씩을 취하여 증류수 100ml를 가하고 비등 수욕(boiling water bath)상에서 한약을 달이듯이 추출하여 자연 농축한 후 일정 농도(생약 1g/100ml)가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다(150종 생약). 또한, 52종 생약에 대하여는 물 추출물을 동결 건조하여 일정 농도(물 추출물 건조 분말 200μg/ml가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다.
2. 측백엽의 PAF 수용체 결합 길항제 활성 성분의 분리
[실시예 1]
1) 측백엽의 추출 및 분획
측백엽 6.0Kg을 헥산 12 리터로 3시간씩 3회 가열 추출(reflux)하고 용매를 감압하에서 제거 하여 헥산 추출물(hexane extract)을 얻었다. 헥산으로 추출한 잔사는 풍건하여 용매를 제거하고 다시 CHCl312리터로 3시간씩 3회 가열 추출하고, 용매를 제거하여 CHCl3추출물을 얻고, 다시 그 잔사를 풍건하여 용매를 제거하고 메탄올 12리터로 3시간씩 3회 가열 추출하고, 용매를 증류 제거하여 메탄올 추출물을 얻었다. 위의 추출방법을 아래의 스킴 1에 나타냈다(스킴 1). 또한 얻어진 각 추출물에 대하여 PAF 수용체 결합 저해 활성을 측정하였다. (표 1)
2) 측백엽 헥산 추출물의 칼럼 크로마토그라피
측백엽 헥산 추출물 150g을 실리카겔 칼럼 크로마토그라피(7 x 100cm, 용매 Hexane : EtOAc =10 : 1→1 : 1→EtOAc→MeOH)하여 8개의 분획(각각, BO-H1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8이라 함)으로 나뉘었으며, 각 분획에 대하여 PAF 수용 저해 활성을 측정하였다(표 2)
스킴 1. 측백엽의 추출(추출량, 20ug/ml에서의 저해 %).
3) 화합물 X의 분리
측백엽 헥산 추출물을 실리카겔 CC하여 얻은 분획 BO-H-5에서 바로 거친(crude) 결정(이하, 화합물 X라 함)를 얻고, 다시 그 여액(9.2g)을 실리카겔 CC(4. 5x 40cm, 용매 Benzene : EtOAc = 20 : 1)하여 4개의 분획으로 나누었으며 (BO-H-5-1, -2, -3, -4라 함), 분획 BO-H-5-2에서 다시 화합물 X를 얻어, BO-H-5에서 얻은 거친 결정과 합한 뒤 헥산에서 재결정하여 무색침상결정(분자량 =346, mp 82-83℃) 약 8g을 얻었고, 이 화합물은 피누솔라이드임이 밝혀졌다.
이 화합물로 PAF 수용체 결합 저해 활성을 측정하였다. (표 3)
C21H30O4,
mp 82-83℃, 수득률 : 0.13%
Mass(EI. m/z, 30eV, relative intensity, %) ; 346(M+, 0.6), 287(15), 286(24), 121(100), 109(21), 107(27), 81(26)
[α]D23=+58.5(CHCl3c 0.1)
UV(EtOH) λmax(ε) : 200.8(19200)
IR νmax (KBr, cm-1) : 3350, 3320, 2950, 1755(C=0 of lactone), 1723(C=0 of ester group)
1H-NMR(200MHz, CDCl3, δppm) : 0.49(3H, s, C20-CH3), 1.16(3H, s, C18-CH3),
3.59(3H, s, C21-OCH3), 4.56(1H, C17-CH2), 4.75(2H, dd, J=0.8, 2.5, C15-CH2), 4.87(1H, C17-CH2), 7.08(1H, t, J=0.8, C14-CH)
13C-NMR(125MHz, CDCl3, δppm) : 12.55(20-C), 19.89(2-C), 21.79(11-C), 24.61(12-C), 26.12(6-C), 28.78(18-C), 38.16(3-C), 38-63(7-C), 39.18(1-C), 40.24(10-C), 44.26(4-C), 51.12(21-C), 55.64(9-C), 56.24(5-C), 70.05(15-C), 106.65(17-C), 134.79(13-C), 143.81(14-C), 147.43(8-C), 174(16-C=0), 177.66(19-C=0)
이 화합물은 다음의 구조식을 가진다.
[실험예 1 : 화합물 X의 혈소판응집 억제작용]
PAF로 유도되는 혈소판 응집 억제작용은 본(Born)의 방법[Born, G. V. R., Corss, M. J. J. Physiol. 168, 178 (1968)] 및 핀카드(Pinckard)의 방법[Pinckard, R, N., Farr, R.S., and Hanahan, D. J. J. Immunol. 123, 1847-1857 (1979)]을 일부변형하여 측정하였다. 즉, 토끼의 심장에서 혈액을 취한 후 세척된 혈소판(washed platelet)의 현탁액을 수용체 결합 조사(receptor binding assay)에서와 같은 방법으로 조제하였다(4.5 x 108cell/ml). 시로(sample)는 DMSO에 녹인후 생리식염수로 희석하여 DMSO의 농도가 최종 0.2%가 되도록 조정하였으며, PAF의 농도는 4가지로(최종 5, 25, 50, 500nM) 용액을 사용하였다. 혈소판 응빕 억제작용 측정과정은 다음과 같다. 즉, 혈소판 현탁액을 투과율 0%, 혈소판 현탁액 조제시 사용한 완충액을 투과율 100%로 설정하고, 혈소판 현탁액 400 μl를 37℃에서 1000rpm으로 2분간 전배양(preincubation) 한 후 시료(혹은 DM SO-saline용액) 25μl를 가하여 3분간 배양( incubation)하고, PAF'를 25μl를 가하여 5-10분간 혈소판 응집 억제 유무로 인한 탁도의 변화를 관찰하였다.
실험예 2 : 트롬빈(Thrombin), ADP, 콜라겐(Collagen)으로 유도한 혈소판 응집에 미치는 영향
다음과 같은 각종 혈소판 응집 유도제에 의한 혈소판 응집에 미치는 화합물 X의 효과를 3-1의 방법으로 측정 비교하였다. 이때 사용한 트롬빈은 0.14U/ml saline으로 조제하였고, ADP는 10μM saline, 콜라겐은 1.67 ㎍/ml saline, PAF의 농도는 5x10-7M으로 제조하였다. 화합물 X의 농도는 29μM을 사용하였다. 또한, 트롬빈과 PAF로 유도한 혈소판 응집억제 실험에서는 토끼의 세척된 혈소판을 사용하였으며, ADP와 콜라겐으로 유도한 혈소판 응집억제 실험에서는 쥐의 PRP를 사용하였다. 즉 2.5% 소듐 시트레이트(sod. citrate) 용량을 주사기에 미리 취한 후 쥐(rat, SD, male 200-250g)의 심장에서 혈액을 취하여 섞고, 1150rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 PRP를 분리하여 취하고 나머지를 다시 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 PPP를 얻었다. PRP는 PPP와 식염수(saline)로 희석하여 4.5 x 108cell/ml로 조절하였으며 대조군은 PPP를 사용하였다.
실험예 3 : 혈소판 응집 억제율의 산출
시료(Sample)에 의한 혈소판 응집 억제율은 다음식에 의하여 계산하였다.
[실험예 4 : 화합물 X의 국소 염증 억제 작용]
국소 염증 억제 작용은 크로톤유 유도 마우스 귀부종 조사법(croton-oil induced mouse ear-edema assay)[Bird, J., Kim, H. P. and Lee, H. J., Steroids, 47, 35(1986)]으로 측정하였다. 시료(화합물 X)는 아세톤에 녹여 사용하였고, 실험 동물은 ICR계 마우스(female, 20-25g)를, 양성 대조군(positive control)으로는 하이드로 코르티손(hydrocortisone)을 사용하였고, 실험 과정은 다음과 같이 행하였다. 즉, 약물 투여전에 미리 마우스의 귀 두께를 측미계(micrometer : 0.01mm unit, Fowler Precision Tools)로 측정하고, 아세톤에 녹인 시료용액(혹은 아세톤) 25μl를 마우스 귀에 자동 피펫(autopipet)으로 골고루 펴 바른 후, 30분 후에 아세톤에 녹인 크로톤유(5% croton oil) 25μl를 마우스 귀에 바른다. 5시간 경과 후에 귀의 두께를 측정하였고, 국소염증 억제율은 아래의 식에 의하여 계산하였다.
[실험예 5 : 화합물 X의 PAF로 유도한 마우스 사망률 의 개선효과]
시료(화합물 X)는 EtOH에서 녹인 뒤 생리식염수로 희석하여 꼬리 정맥에 주사하였고, 실험동물은 ICR계 마우스(male, 20g내외)를, 양성 대조군(positive control)으로 CV6209를 사용하였다.
먼저 EtOH 5%-saline 용액(5ml/kg)을 마우스의 꼬리정맥에 주사한 5분 후에 PAF 용액(200, 100, 75 ㎍/kg/5ml, 0.25% BSA-saline 용액)을 꼬리정맥에 주사하여 LD80을 유도하는 PAF의 용량을 결정하였다. 그 다음, 시료(혹은 EtOH 5%-saline 용액)을 마우스의 꼬리정맥에 주사한 5분 후에 PAF 용액을 꼬리정맥에 주사하여 살아남은 마우스의 백분율을 계산하였다.
실험예 6 : 화합물 X의 LPS로 유도한 마우스 사망률 의 개선효과
바로 위의 실험예 5에서와 같은 방법으로 실험하였다.
화합물 X의 화학적 변형(Chemical modification) 및 PAF 수용체 결합 저해 활성과의 관계
실험예 7 : 화합물 X의 LiAlH4에 대한 환원(화합물 X-LR의 합성) 및 PAF 수용체 결합저해 활성 측정
1) 화합물 X 0.0692g(2mmole)과 리튬알루미늄 하이드라이드(Lithium aluminium hydride) 0.228g(6mmole)을 무수 THF 10ml에 녹인 후 질소 기류하에 5시간 동안 환류(reflux)하였다. T LC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 얼음(ice)-1N-HC1에 서서히 가한 다음 EtoAc 50ml 씩 3회 추출하였다. EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후감압 농축 하고 n-hexane : EtOAc=4 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 X-LR 0.026g을 얻었다(수율 54%). 화합물 X-LR에 대하여 PAF 수용체 결합 저해 활성을 측정하였다(표 8).
2) 화합물 X의 촉매 수소화(Catalytic Hydrogenation)에 의한 환원(화합물 X-CH의 합성) 및 PAF수용체 결합 저해 활성 측정
화합물 X 0.0346g(0.1mmole)과 10% Pd/C 0.318g(0.3mmole palladium)에 무수 THF 10ml를 가한후 수소 기류하에 촉매 수소화(catalytic hydrogeation)를 실시하였다. 30분동안 반응을 진행시킨 다음 반응물을 여과하고 여액을 농축하여 화합물 X-CH 0.035g을 얻었다(수율 100%). 화합물 X-CH에 대하여 PAF 수용체 결합 저해 활성을 측정하였다(표 8).
95(38.5)
[실험 결과 및 고찰]
1) 시험관 내(In vitro) PAF 수용체 결합 조사
반응시간을 60분,3H-PAF 농도를 0.6nM로 고정하여 모든 실험을 행하였다. PAF 길항제로 알려진 CV 6209는 본 실험에서 시험과 결과 최종 농도 10-7M일 때 98%, 10-8M일 때 76% 억제율을 보였다.
2) 화합물 X의 구조
화합물 X는 무색의 침상 결정(mp가 82-83℃)으로, TLC상에서 (용매 Hexane : EtOAc = 10 : 1, 2번 전개) Rf 0.11 이였다. I2증기, 10% H2SO4분무(spray), 드라이겐도르프 시약(dragendorff reagent)에 양성(positive)이었으나, 질소 시험(nitrogen test)을 한 결과, 음성(negative)이었다.
IR에서 1755cm-1(C=0 of lactone), 1723cm-1(C=0 of ester group)의 띠(band)로 락톤 고리(lactone 환) 및 에스테르 결합이 있음을 확인하였다. 질량 스펙트럼(Mass spectrum)에서 분자량이 346임을 확인하였으며,1H-NMR에서, δ0.49(3H, s), δ1.16(3H, s)에서 2개의 메틸기, δ3.59(3H, s)에서 메톡실기 (-OCH3) 1개, δ4.56(1H, s), δ4.87(1H, s) 봉우리(peak)에서 고리밖 메틸렌(exocyclic methylene; -CH2) 1개, δ4.75(2H, dd, J=2.5 0.8) δ7.08(3H, t, J=0.8) 봉우리가 관찰되었다.13C-NMR과 DEPT NMR 로부터 4차 탄소(quarternary carbon) 는 총 6개인데, 카보닐 탄소(carbonyl carbon) 2개(δ177. 5, 174.2), 올레핀 탄소(Olefinic carbon) 2개(δ147.3, 134.5)를 관찰하였다. 메타인 탄소(methyne carbon)는 총 3개이며, 1개의 올레핀 메타인 탄소(olefinic methyne carbon)(δ143.9)가 있었고, 메틸렌 탄소(methylene carbon)은 총 9개인데, 엑소사이클릭 올레핀 메틸렌(exocyclic olefinic methylene)으로 추정되는 탄소 1개(δ106.5)와 락톤 고리(lactone ring) 내의 메틸렌(methylene)으로 보이는 탄소 1개(δ70.0)를 관찰하였다. 또한, 메틸기는 총 2개였고, δ51.0에서 메톡실 탄소 봉우리(methoxyl carbon peak)를 관찰하였다. 이로써 화합물 X의 분자식은 C21H30O4로 결정하였다.
13C-1H COSY 스펙트럼과1H-1H COSY 스펙트럼으로부터 각 탄소 봉우리에 해당하는 양성자(proton)의 봉우리를 지정(assign)할 수 있었다. 즉, δ106.5의 탄소(carbon)에 δ4.67(1H, s), δ4.56(1H, s)의 두 양성자(proton)가 결합되어 있는 것으로부터 이중결합(double bond)을 가진 말단의 =CH2가 있음을 알 수 있었다. 또한,1H-1H COSY에서, δ7.08(1H, t, J=0.8)과 δ4.75(2H, dd, J=2.5, 0.8)이 짝지음(coupling)을 하는데, δ7.08의 양성자(proton)는 올레피닉 메틸렌 탄소(olefinic methylene carbon)(δ143.9)와 결합되어 있으며, δ4.75의 양성자(proton)는 락톤 고리(lactone ring)내의 메틸렌(methylene)으로 보이는 탄소(carbon)(δ70.0)과 결합되어 있으므로 락톤 고리(lactone ring)내에 이중결합이 있음을 알 수 있었다.
위의 사실을 근거로 이 화합물은 피누솔라이드(Pinusolide)로 동정하였다.
3) 측백엽의 각 추출물과 화합물 X에 대한 PAF 수용체 결합 저해 활성
(1) 측백엽의 헥산(Hexnae), CHCl3, MeOH 추출물의 PAF 수용체 결합 저해 활성.
측백엽을 헥산, 클로로포름, 메탄올로 가열 추출하여 얻은 각 추출물에 대하여 조사( assaY) 한 결과는 아래와 같다.(표 1)
[표 1]
표 1에서와 같이 측백엽은 PAF 수용체 결합 저해 활성 실험에서 헥산(He xane) 추출 물과 CHCl3추출물에서 강한 활성을 보였으며(92%, 66% 20 ㎍/ml), 헥산 추출물에서 보다 강력하게 저해활성을 보이므로 우선 헥산(Hexane) 추출물의 PAF 수용체 결합 저해 활성 성분의 분리를 시작하였다.
(2) 측백엽 헥산 추출물(BO-H)로부터 얻은 각 분획에 대한 PAF 수용체 결합 저해활성.
측백엽의 헥산 추출물(Hexane ext.)을 실시카겔 CC하여 얻은 8개 분획에 대하여 조사(assay)한 결과는 아래와 같다. (표 2)
[표 2]
표 2에서 보는 바와 같아, BO-H-5 분획이 가장 현저한 활성이 관찰되어 우선적으로 유효성분 분리를 시도하여 화합물 X의 순수한 결정을 얻었다. 또한 BO-H-6 분획도 활성이 있어 보였으나 T LC 상에서 화합물 X와 동일한 점적(spot)이 관찰되었다.
(3) 화합물 X에 대한 PAF 수용체 결합 저해활성
측백엽의 헥산 추출물 (BO-H)을 반복적으로 실리카겔(silicagel) CC하여 얻은 화합물 X에 대하여 조사한 결과는 아래와 같다. (표 3)
[표 3]
측백엽의 헥산추출물의 Bo-H-5 분획에서 강항 PAF 수용체 결합 저해 활성 물질인 화합물 X를 순수분리하여 그 화학 구조를 디테르페노이드(diterpenoid)인 피누솔라이드(pinusolide)로 동정하였다. 화합물 X는 IC50=2.56 x 10-7M로 측정되었다.
(4) 화합물 X의 혈소판 응집 억제작용
I) 화합물 X의 PAF로 유도한 혈소판 응집 억제작용
PAF 농도 변화에 따른 Comp X의 IC50를 구하였다. (표 4)
[표 4]
표 4에서 보는 바와 같이, 화합물 X의 혈소판 응집 억제 정도는 일정한 PAF 한가지 농도에서 용량 의존적인 억제율을 보였으며, PAF 농도 변화에 따라서도 IC50가 용량 의존적으로 낮아지는 것을 보여 주었다. 따라서 화합물 X는 PAF 수용체에서 PAF와 상경적으로 결합함을 알 수 있다.
(ii) 화합물 X의 트롬빈, 콜라겐, ADP로 유도한 혈소판 응집 제어 작용
화합물 X가 PAF 수용체 결합 조사(recetor binding assay)에서 강한 억제활성 (IC50=2.50x10-7M)을 나타내었고, 또한 PAF로 유도한 혈소판 응집 억제 실험에서도, PAF 농도와 화합물 X의 농도변화에 따른 용량의존적인 억제 작용을 나타내었으므로, 화합물 X가 PAF에 특이 억제자인가를 확인하기 위해 유도한 혈소판 응집억제 실험을 한 결과는, 화합물 X는 PAF로 유도한 혈소판 응집에는 강하게 응집 억제를 했으나, 트롬빈, 콜라겐, ADP에 의해서는 아주 약하거나 억제활성이 전혀 없었다. 그러므로 화합물 X는 PAF 수용체에서 PAF와 상경적인 결합을 하는 특이적 길항제임을 밝혔다.
(5) 화합물 X의 국소염증 억제작용
크로톤유로 유도한 마우스 귀-부종 생물검사의 결과는 표 5에 나타내었다.
[표 5]
귀 부종 생물검사(ear edema bioassay(에서 화합물의 X의 국소 항염증 활성
표 5에서와 같이 화합물 X는 하이드로코르티손(hydrocortisone)보다는 약하지만 국소염증 억제 작용이 있음을 알 수 있었다.
(6) 화합물 X의 PAF로 유도한 마우스 사망률의 개선효과
LD50를 유도하는 PAF용량은 100㎍/kg였으며 이는 문헌과도 잘 일치함을 보여주었다.
PAF 100㎍/kg i.v. 로 유도한 마우스의 사망률에 대한 화합물 X의 개선효과는 표 6과 같다.
[표 6]
표 6에서와 같이 화합물 X는 PAF로 유도한 마우스의 사망에 방어효과가 있음을 밝혔다.
(7) 화합물 X의 LPS로 유도한 마우스 사망률의 개선 효과
LD50를 유도하는 LPS용량은 10mg/kg 였으며, 이 때 화합물 X를 투여한 결과는 표 7과 같다.
[표 7]
표 7에서 보는 바와 같이 화합물 X는 LPS로 유도한 마우스의 사망률을 개선하는 효과가 있음을 밝혔다.
(8) 화합물 X의 화학적 변형 및 PAF 수용체결합 저해 활성과의 관계
(i) 화합물 X 의 LiAlH4에 의한 환원(화합물 X-LR의 합성)
화합물 X-LR은 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 304였으며, 화합물 X의1H-NMR과 화합물 X-LR의1H-NMR을 비교해 보았을 때, α, β-불포화 락톤 고리(α,β-unsaturated lactone ring)의 에스테르 결합이 에테르 결합으로 되었고, A 고리(Aring)의 메틸 에스테르가 알코올(CH2OH)로 환원 된 것을 알 수 있었다.
(ii)화합물X의 촉매 수소화에 의한 환원(화합물 X-CH의 합성)
화합물 X-CH는 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 4 증가한 것으로 화합물 X의 고리밖 이중 결합(exocyclic double bond)와 α, β-불포화 락톤 고리(α, β-unsaturated lactone ring) 의 이중 결합이 환원된 것을 추정할 수 있으며,1H-NMR로부터 이를 확인하였다.
(iii)화합물 X-LR와 화합물 X-CH에 대한 PAF 수용체 결합 저해 활성
화합물 X를 LiALH4와 팔라듐-카콜(Palladium Charcoal)으로 환원하여 얻은 화합물 X-LR와 화합물 X-CH)에 대하여 PAF 수용체 결합 저해 활성을 측정한 결과는 아래와 같다.(표 8)
[표 8]
화합물 X를 LiALH4로 환원하여 락톤 고리가 에테르 결합으로 되었을 경우 활성이 거의 없었고, 팔라듐-카콜로 환원하여 α,β-불포화 락톤 고리의 이중 결합이 환원되었을 경우에는 활성이 약 1/10배 정도로 약해진 것으로 보아 화합물 X의 PAF 길항작용을 α, β-불포화 락톤 고리의 존재가 중요한 것으로 보인다.
이상의 실험결과로부터 본 발명의 화합물은 다음과 같은 효과가 있음이 밝혀졌다.
1. 측백엽에서 PAR 수용체 결합 길항제(PAF-receptor binding antagonist) 활성이 강한 유효성분 화합물 X(C21H30O4, M.W.=346, mp 82-83℃, IC50=2.56x1 0-7M)를 순수 분리하였으며, 그 화학 구조는 피누솔라이드(Pinusolide)로 규명되었다.
2. 화합물 X에 대하여 PAF로 유도한 혈소판 응집 억제 효과를 측정한 결과 PAF 일정 농도에서 용량 의존적인 억제율을 보였으며, 또한 PAF 농도 변화에 따라서도 IC50이 용량 의존적으로 낮아짐을 보여주었다. 따라서 화합물 X는 PAF 수용체에 PAF와 상경적으로 결합함을 밝혔다.
3. 또한, 트롬빈, 콜라겐, ADP로 유도한 혈소판 응집 억제 실험에서는 PAF로 유도한 실험에서와는 달리, 화합물 X가 혈소판 응집을 전혀 억제 하지 못했거나 억제 작용이 극히 미약하였다. 그러므로 화합물 X는 PAF 수용체에 특이 억제자임을 밝혔다.
4. 화합물 X는 크로톤유(croton oil)로 유도한 마우스 귀-부종 생물검사를 했을 때, 하이드로코르티손(hydrocortisone) (1mg/ear, 46% 억제)보다는 약하지만국소적 항염증 효과(topical antiinflamatory effect)(2mg/ear, 32% inhibition)가 있음을 밝혔다.
5. 화합물 X는 PAF로 유도한 마우스의 사망으로부터 방어하는 효과가 있음을 밝혔다. (화합물 X 10mg/kg i.v. 일 때, 100% 방어(protection))
6. 화합물 X는 LPS로 유도한 마우스의 사망률 을 개선시킴을 밝혔다. (화합물 X 40mg/kg i.v.일 때, 65% 개선(improvement))
따라서 본 발명의 화합물은 PAF-길항제로 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 일일 0.1mg 내지 1000mg의 용량을 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제나 또는 보조제와 혼합하고 통상의 악제학적인 방법으로 경구 또는 비경구로 투여할 수 있는 약학적 제제로 제조할 수 있다.
다음에 제제실시예를 예시한다.
[제제실시예 1]
[정제의 제조 :]
피누솔라이드 10mg
유당 20mg
전분 20mg
스테아린산 마그네슘 적량
성기의 성분을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 의하여 50mg의 정제로 타정한다.
[제제실시예 2]
[캡슐제의 제조 :]
피누솔라이드 10mg
유당 20mg
전분 19mg
탈크 1mg
스테아린산 마그네슘 적당량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 의하여 50mg의 젤라틴 캡슐에 충전한다.
[제제실시예 3]
[주사제의 제조 :]
피누솔라이드 2mg
용해보조제 적당량
멸균정제수 적당량
상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법에 의하여 2ml의 앰플에 충진하고 밀봉한 다음 멸균하여 주사제를 제조한다.
[제제실시예 4]
[시럽제의 제조 :]
피누솔라이드 50mg
설탕 5g
이성화당 5g
정제수 적당량
전체 50ml
상기의 성분을 정제수에 넣고 잘 교반한 다음 50ml용량의 유리병에 충진하고 멸균하여 시럽제를 제조한다.
[제제실시예 5]
[연고제의 제조 :]
피누솔라이드 1g
디에탄올아민 1.5g
카르복시비닐 폴리머 940 1g
하이드록시에틸 셀루로오스 5g
에탄올 30g
폴리비닐피롤리돈 5g
프로필렌 글리콜 30g
증류수를 가해서 전체 100ml로 함
상기의 성분을 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고를 제조한다.
[제제실시예 6]
[크림제의 제조 :]
피누솔라이드 1g
이소프로필 미리스테이트/이소프로필 팔미 5g
테이트/이소프로필 스테아레이트 혼합물
팔미트산 및 모노- 및 디-글리세리드와의 4g
혼합물
극히 고분자량의 적당히 가교결합된 0.5g
폴리아크릴산
세틸팔미테이트 4g
세틸스테아릴알콜 1g
45%(intensity)의 수산화나트륨 0.11g
글리세린 3g
벤질알콜 3g
정제수를 가해 전체10)ml로 한다.
상기의 성분을 통상의 크림제의 제조방법에 따라서 크림제를 제조한다.

Claims (3)

  1. 피누솔라이드를 통상의 약제학적으로 사용되는 부형제 또는 보조제와 혼합하고 통상의 약제학적으로 사용되는 방법으로 제형화하여 제조된 PAF-길항제제.
  2. 제1항에 있어서, 제형을 정제, 캡슐제, 시럽제, 주사제, 연고제 또는 크립제에서 선택된 제형으로 제형화된 PAF-길항제제.
  3. 측백엽을 헥산으로 추출하여 얻어진 헥산추출물을 정제하여 피누솔라이드를 제조하는 방법.
KR1019930013598A 1993-07-19 1993-07-19 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 paf-길항제 KR100257183B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019930013598A KR100257183B1 (ko) 1993-07-19 1993-07-19 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 paf-길항제

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019930013598A KR100257183B1 (ko) 1993-07-19 1993-07-19 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 paf-길항제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR950002770A KR950002770A (ko) 1995-02-16
KR100257183B1 true KR100257183B1 (ko) 2000-05-15

Family

ID=19359539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019930013598A KR100257183B1 (ko) 1993-07-19 1993-07-19 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 paf-길항제

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100257183B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100481684B1 (ko) * 2001-12-28 2005-04-07 주식회사 엘컴사이언스 피누솔리드 유도체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌신경계 질환의 예방 및 치료제
KR101055108B1 (ko) * 2010-08-20 2011-08-08 (주)아모레퍼시픽 백자인 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102257044B1 (ko) * 2019-11-27 2021-05-27 윤태연 유조 하부영역의 식용유 냉각 기능을 갖는 전기 튀김기

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100481684B1 (ko) * 2001-12-28 2005-04-07 주식회사 엘컴사이언스 피누솔리드 유도체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성뇌신경계 질환의 예방 및 치료제
KR101055108B1 (ko) * 2010-08-20 2011-08-08 (주)아모레퍼시픽 백자인 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR950002770A (ko) 1995-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5021450A (en) New class of compounds having a variable spectrum of activities for capsaicin-like responses, compositions and uses thereof
WO2001003690A1 (en) Novel vasodilator cannabinoid analogs
Fried et al. The hypotensive principles of Veratrum viride
JPH04243822A (ja) カルシウム拮抗剤
US4046914A (en) Therapeutically active substituted saturated and mono-and polyunsaturated alkyl-glycerylethers
KR100257183B1 (ko) 측백엽으로부터 피누솔라이드를 추출하는 방법 및 이를 주성분으로 함유하는 paf-길항제
WO2019085847A1 (zh) 一种大叶蒟提取物及其制备方法与应用
JP3128823B2 (ja) 制癌化合物およびその製造法
US4540709A (en) Method for treatment of diseases mediated by PAF using 5-allyl-2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3a,α-methoxy-3-methyl-2,3,3a,6-tetrahydro-6-oxobenzofuran
KR100321313B1 (ko) 류코트리엔생성저해활성을가지는신이추출물및신이로부터분리한리그난화합물
CN111909228B (zh) 一种生物碱类化合物及其制备方法和应用
JPH0952899A (ja) ロイコトリエン拮抗剤
KR100261916B1 (ko) 피누 솔라이드 유도체
Saiin et al. Isolation and in vitro antimalarial activity of hexane extract from Thai Picrasma javanica B1 stembark
KR20100010205A (ko) 오수유로부터 분리된 세포접착저해 물질을 유효성분으로하는 약학 조성물
CN114539192B (zh) 松香烷型二萜化合物及其制备方法和应用
CN114533719B (zh) 松香烷型二萜类化合物在制备抗炎药物中的应用
KR100516647B1 (ko) 당뇨병 치료제 조성물
JP2003171349A (ja) 新規なジテルペン類、及びこれを用いた組成物、抗炎症剤、抗癌剤
CN110204477B (zh) 一种具有抗氧化作用的二萜生物碱及其在制备药物中的应用
WO1992015543A1 (fr) Nouveau derive d'alcool allylique
KR20090130633A (ko) 길경으로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는심혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물
KR20050006406A (ko) 홀아비꽃대로부터 추출한 시주카올 비를 함유하는동맥경화 또는 염증질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물
KR20040087223A (ko) 한국산 겨우살이 유기추출물로부터 항암 화합물 베루틴과베투린 산의 정제 및 이 추출물의 제조방법
JP2006321728A (ja) 新規な抗リーシュマニア医薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20021211

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee