KR100261916B1

KR100261916B1 - 피누 솔라이드 유도체

Info

Publication number: KR100261916B1
Application number: KR1019950009237A
Authority: KR
Inventors: 한병훈; 양현옥; 서대연; 김용철; 강영화; 고현정
Original assignee: 우재영; 일양약품주식회사; 한병훈
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1995-04-19
Publication date: 2000-07-15
Also published as: KR960037672A

Abstract

본 발명은 다음의 일반구조식(1)로 표시되는 신규 화합물 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

식중 R₁은 =O, -OH, -OAc 또는 X-Y와 함께를 형성하며, R₂는 -CH₃, =CH₂, -CH₂OH, -CH₂OAc, -OH, =O,또는를 나타내며, R₃는 -COOCH₃, -CH₂OAc 또는 -CH₂OH를 나타내며, X-Y는 CH-CH₂- 또는 C=CH-를 나타낸다.

본 발명의 화합물 및 그 조성물은 PAF-길항제로서 유효한 약리활성을 가진다.

Description

피누솔라이드 유도체

제1도는 피누솔롤(Pinusolol)(화합물I)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제2도는 피누솔롤아세테이트(Pinusololacetate)(화합물 II)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제3도는 중수소치환 피누소디올(Pinusodiol)(화합물 III)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제4도는 피누소디올-디아세테이트(Pinusodiol-diacetate)(화합물 IV)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제5도는 피누솔라놀리드(Pinusolanolide)(화합물 V)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제6도는 피누솔락톤(Pinusolactone)(화합물 VI)(CDCl₃, 80MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제7도는 피누소푸란(Pinusofurane)(화합물 VII)(CDCl₃, 80MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제8도는 피누솔리독시드(Pinusolidoxide)(화합물 VIII)(CDCl₃, 80MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제9도는 중수소치환 피누솔글라이콜(Pinusolglycol)(화합물 IX)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제10도는 피누솔글라이콜-이소프로폭시드(Pinusolglycol-isopropoxide)(화합물 X)(CDCl₃, 80MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제11도는 노르-피누솔리돈(nor-Pinusolidone)(화합물 XI)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제12도는 노르-피누솔라놀(nor-Pinusolanol)(화합물 XII)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR스펙트럼을 나타내며,

제13도는 피누솔리다논(Pinusolidanone)(화합물 XIII)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제14도는 피누솔리돌(Pinusolidol)(화합물 XIV)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타내며,

제15도는 피누솔리돌아세테이트(Pinusolidolacetate)(화합물 XV)(CDCl₃, 250MHz)의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 다음 일반구조식 (1)로 표시되는 신규 피누솔라이드 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

식중 R₁은 =O, -0H, -OAc 또는 X-Y와 함께를 형성하며, R₂는 -CH₃, =CH₂, -CH₂OH, -CH₂OAc, -OH, =O,,또는를 나타내며, R₃는 -COOCH₃, -CH₂OAc 또는 CH₂OH를 나타내며, X-Y는 CH-CH₂- 또는 C=CH-를 나타낸다.

혈소판 활성화 인자(Platelet Activating Factor, 이하 PAF라 함)는 이뮤노글로뷸린(Immunoglobulin) E 등이 관여하는 면역반응시 각종 면역 담장세포에서 방출되며, [Benveniste, J., Henson, P. M. and Cochrane, C. G., J. Exp. Med, 136, 1356-1377 (1972)], 혈소판 막(膜)에 있는 수용체(receptor)에 결합하여 혈소판을 활성화시키고, 각종 세포들(혈소판, 백혈구(leukocyte)등}의 응집반응 및 이와 관련된 여러 가지 생화학적 세포내 반응을 개시하여 일어나는 말초 순환 장애와 깊이 관련되어 있다[Snyder, F., Medical Res. Review 5, 107-140(1985); Mclytre, T. M., Zimmerman, G. A., Satoh, K. and Prescott, S. M., J. Clin. Inv. 76, 271-280(1985); Hayashi, H., Kudo, I., Inoue, K., Onozaki, K., Tsushima, S., Nomura, H. and Nojima, S., J. Biochem. 97, 1737-1745(1985). 뿐만 아니라, 혈관투과성을 증가시켜 급성 염증을 일으키고, 기관지수축과 과민반응으로 천식을 일으키고, 장기이식에 관한 거부반응, 심장성 아나필락시(cardiac anaphylaxis), 내독소 쇼크(endotoxin shock), 위궤양, 급성 알러지(allergy)반응, 알러지성 피부염, 동상 등과 같은 병리적 반응과 같이 관련되어 있음이 최근 연구에 의하여 밝혀지고 있으며 종전에 알려진 각종 오타코이드(autacoid)[히스타민(histamine), 류코트리엔(leucotrienes), 프로스타글라니딘(prostaglanidins)]들 보다 1/1000 내지 1/10000의 저농도에서 이들 오타코이드들의 합성 또는 방출을 일으켜 이른바 과격한 면역반응으로 인한 자기 파괴적인 병리적 반응의 개시인자로 알려지고 있다. 각종 면역반응이 일어나는 것은 근본적으로 자기 방어를 위한 반응이지만 그 방어 반응으로 인한 후속 반응들 중 자기 파괴적인 반응이 PAF와 관련되어 있다. PAF-길항제(PAF-antagonist)는 PAF가 혈소판의 막에 있는 수용체와 결합하는 것을 방해하는 물질로서 PAF의 수용체 결합이 방해받고 있는 동안에 혈장 중의 가수분해 효소(acetyl hydrolase)등에 의하여 PAF가 파괴되면 불할성화되기 때문에 이 자기 방어적인 면역반응에 대해서는그대로 두고 후속반응인 자기 파괴적인 반응을 막아줄 수 있을 것이라는 기대하에 많이 연구되고 있는 물질이다[Benveniste, J., Henson, P. M. and Cochrane, C. G., J Exp. Med. 136, 1356-1377(1972); Snyder, F., Medical Res. Review 5, 107-140(1985); Mclytre, T. M., Zimmerman, G. A., Satoh, K. and Prescott, S. M., J. Clin, Inv. 76, 271-280(1985); Hayashi, H., Kudo, I., Inoue, K., Onozaki, K., Tsshima, S., Nomura, H, and Nojima, S., J. Biochem. 97, 1737-1745(1985); 工藤一郎 , 井上圭三, 炎症, 7, 309(1989); 工藤一郎, Med. Immunol,, 11, 707(1986); 井上圭三, 代謝, 23, 891-899(1986); 和久敬莊 , 代謝, 24, 625-639(1987); 和久敬莊, 井上圭三, 血小板活性化因子, 東京化學同人(1989)].

민간과 한방에서 각종 말초 순환 장애(류마티즘, 천식, 혈전증, 알러지성 질환 등)에 사용하고 있는 국내 생약 202가지를 대상으로 PAF 수용체 결합 저해 효과를 검색한 결과 측백엽(側柏葉)의 MeOH 추출물에서 강력한 저해활성이 나타났다. 이에 활성-추적 분리법(Activity-guided isolation)으로 피누솔라이드(Pinusolide : C₂₁h₃₀o₄, M. W. =346, mp 82-83℃, IC₅₀=2.56x 10^-7M)를 분리하여 그 유효성분으로 이미 보고하였으며, 특허출원한 바 있다[Isolation and characterization of platelet-activating factor receptor binding antagonists from Biota orientalis, H. O. Yang, D. Y. Suh and B. H. Han, Planta Medica, 61(1), 37 (1995); 특허출원 제93-13598(공개 제 95-2770호)].

PAF 수용체에 대한 PAF-길항제, 피누솔라이드의 구조활성 상관관계를 연구하기 위하여 피누솔라이드의 주요한 관능기(Functional groups)를 변형하여 상기 일반구조식(1)로 표시되는 15종의 신물질 유도체들(화합물 I 내지 XV)을 합성하여 PAF 수용체 결합 시험분석(PAF receptor binding assay)으로 그 활성을 비교, 검토하였고, PAF로 유도한 마우스의 사망률의 개선효과, 국소 염증 억제작용, 및 LD₅₀과 같은 생물학적 활성(Biological activity)을 조사하였다.

이하, 실시예, 실험예 및 제제실시예로써 본 발명을 상세히 설명한다. 이 때, 본 발명의 실시에서 사용한 실험재료는 다음과 같았다.

시약 : 칼럼 크로마토그라피(이하, CC라 함)용 실리카겔은 키젤겔(Kieselgel)60(230-400 mesh ASTM, Merck Art. 9385)을 박층 크로마토그라피(Thin Layer chromatography : 이하, TLC라 함)용 전피복판(precoated plate)은 키젤겔 60 F₂₅₄(layer thickness 0.25mm, 20 x 20cm, Merck Art, 5715)를 사용하였으며, TLC 점적(spot)의 발색은 254nm UV lamp 및 I₂증기 그리고 분무시약(spray reagents)으로는 10% H₂SO₄과 드라겐도르프(Dragendorff) 시약을 사용하였다.

PAF는 뵈링거만하임(Boehringer Mannheim)(C₁₈-PAF)과 시그마(Sigma)(C₁₆-PAF)에서,³H-PAF는 아머샴(Amersham Co.)에서 구입하였으며, 소혈청알부민(Bovine Serum Albuin)(이하, BSA라 함)은 뵈링거만하임(Fraction V)에서, 트롬빈(Thrombin), 콜라겐(Collagen)은 크로노-로그(Chroneo-log Co.)에서 POPOP, 2, 5-디페닐옥사졸(2, 5-diphenyloxazol, 이하 POP라 함), 크로톤유(Croton oil)는 시그마에서 구입하였고, CV 6209는 다께다(Takeda Co.)에서 제공받았다. 그외 다른 시약은 특별한 언급이 없는 한 1급 시약(EP)을 사용하였다.

기기 :

pH meter : Analab 88

Centrifuge : RT 6000, Sorvall Co.

Platelet counter : Chrono-log, Model PLT-4

Aggregometer : Chrono-log, Whole blood aggregometer

Micrometer L 0.01mm unit, Fowler Precision Tools

Multichannel autopipette : Rainin Co.

Autopipette : Gilson Co.

Cell harvester : Skatron Co.

CF-G filter : Skatron (glass fiber) Co.

Liquid scintillation counter L Hewlet Packard Co.

Scintillation vial : Boehringer Mannheim (6ml) Co.

mp : Mitamura Riken Heat Block Model-MRK로 측정하고 보정하지 않았다.

mass : VG TRIO-II GC/MS system

Hewlet Packard Model HP 5985 B GC/MS system(70eV, 30eV)

[실시예 1]

화합물 I과 화합물 III의 합성

피누솔라이드 3g(8.67 mmole)과 리튬알루미늄 하이드라이드(Lithium aluminium hydride) 0.99g(26.01 mmole)을 무수 THF 50ml에 녹인 후 질소기류하에서 5시간 동안 환류(reflux)하였다. T LC로 반응의 완결을 확인한 후 반응혼합물을 얼음(ice)-1N-HCl에 서서히 가한 다음 EtOAc로 3회 추출하고 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산(hexane) : EtOAc = 5:1에서 n-헥산 : EtOAc =7 : 1용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 I 0.5g(수율 17%)과 화합물 III 1.5g(수율 54%)을 얻었다. 화합물 I과 화합물 III의¹H-NMR 챠트는 도 1, 도 3와 같다.

[화합물 1]

Mass (El. m/z, 70eV, relative intensity, %) : 332(M⁺-H₂0, 2.0), 275(5.5), 262(11.2), 123(100), 107(20), 91(18.1)

[화합물 III]

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 304(M⁺-H₂O, 0.13), 273(1.78), 205(2.3), 153(100), 135(16.0), 121(30), 122(10.5), 123(22.4), 109(38.4)

[실시예 2]

화합물 II의 합성

화합물 I 3g(8.67mmole)과 아세트산 0.78ml(13.01 mmole)을 피리딘 50ml에 녹여 5시간 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 물과 EtOAc로 추출한 다음 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산 : EtOAc=7:1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 II 2.3g을 얻었다(수율 74%). 화합물 II의¹H-NMR 챠트는 도 2와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 392(M⁺1.7), 332(10), 262(75), 181(41.5), 121(100), 107(37.5)

[실시예 3]

화합물 IV의 합성

화합물 III 2.8g(8.67 mmole)과 아세트산 0.78ml(26.01 mmole)을 피리딘 50ml에 녹여 5시간 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 물과 EtOAc로 추출한 다음 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산 : EtOAc=8:1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 IV 2.2g을 얻었다(수율 70%). 화합물 IV의¹H-NMR챠트는 도 4와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 406(M⁺0.5), 346(14.2), 287(20), 276(90), 273(50), 216(40), 134(87.1), 121(79)

[실시예 4]

화합물 V의 합성

피누솔라이드 2g(6.00 mmole)과 CoCl₂·6H₂O 1.4ml(6.00 mmole)을 질소 기류하 무수 에탄올 30ml에 녹인 후 얼음욕(ice-bath)에서 질소 기류하의 무수 에탄올에 녹아 있는 NaBH₄0.43g(11.6 mmole)을 주사기로 뽑아 주입하고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. T LC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 얼음-3N-HCl에 서서히 가한 다음 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산 : EtOAc=5:1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 V 1.5g을 얻었다(수율 72%), 화합물 V의¹H-NMR 챠트는 도 5와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 348(M⁺, 20), 316(20.5), 288(98), 273(30), 181(38.5), 149(38.5), 121(100), 109(37)

[실시예 5]

화합물 VI의 합성

피누솔라이드 3.5g(10 mmole)과 10% Pd/C 31.8g에 무수 THF 300ml를 가한 후 수소 기류하에 촉매수소화(Catalytic hydrogenation)를 실시하였다. 30분 동안 반응을 진행시킨 다음 반응물을 여과하고 여액을 농축하여 화합물 VI 3.5g을 얻었다(수율 100%). 화합물 VI의¹H-NMR 챠트는 도 6와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 350(M⁺1.5), 318(8.4), 292(12.0), 291(60.9), 290(87.8), 273(8.9), 123(100), 109(51.9), 95(38.5)

[실시예 6]

화합물 VII의 합성

피누솔라이드 1.7g(5 mmole)을 질소 기류하에 무수 THF 50ml에 녹인 후 -30℃에서 교반하면서 1.0-DIBAL의 n-헥산 용액 5ml(5 mmole)를 가했다. -30℃에서 5시간동안 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물에 10% H₂SO₄1ml를 서서히 가한 다음 EtOAc로 3회 추출하고 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산 : EtOAc=10 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 VII 1.0g을 얻었다(수율 61%). 화합물 VII의¹H-NMR 챠트는 도 7과 같다.

Mass (El. m/z, 70eV, relative intensity, %) : 330(M⁺48), 315(5.5), 271(14.7), 190(2.5), 189(38.5), 188(15.1), 121(100), 81(100)

[실시예 7]

화합물 VIII의 합성

화합물 VII 1.5g(4.6mmole), m-CPBA 1.2g(4.6 mmole), NaOAc 0.8g(9.2 mmole)을 무수 CH₂Cl₂30ml에 녹인 후 질소 기류하의 상온에서 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 CHCl₃로 희석하고 1N-NaOH로 세척하였다. EtOAc로 추출하여 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산 : EtOAc=10 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 VIII 1.0g을 얻었다(수율 60%). 화합물 VIII의¹H-NMR 챠트는 도 8과 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 362(M⁺1.4), 347(13.0), 285(11.1), 273(5.1), 265(77.1), 255(15.0), 237(21.3), 215(13.5), 187(23.2), 173(47.1), 159(25.8)

[실시예 8]

화합물 IX의 합성

피누솔라이드 1.5g(4.3 mmole)을 디옥산(11ml)에 녹인 후 OsO₄1.1g (4.3mmole)이 디옥산 용액을 가하고 5시간 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 NaHSO₃수용액과 EtOAc로 추출한 다음 EtOAc 층를 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 CHCl₃: MeOH=25.:1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 IX 7g을 얻었다(수율 42%), 화합물 IX의¹H-NMR 챠트는 도 9와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 362(M⁺-H₂O, 22.4), 349(29.1), 285(12.2), 271(90.2), 237(44.1), 219(9.2), 181(19.7), 153(28.5), 121(78.6), 109(100)

[실시예 9]

화합물 X의 합성

화합물 IX 3g(7.9 mmole)에 2,2-디메톡시프로판 5.5ml를 넣고 교반하면서 TsOH·H₂O을 촉매량 가하였다. 약 10분후 TLC로 반응의 완결을 확인한 후 NaHSO₃수용액과 EtOAc로 추출하여 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 m-헥산 : EtOAc = 4 : 1이 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 X 2.3g을 얻었다(수율 69%). 화합물 x의¹H-NMR 챠트는 도 10과 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 420(M⁺, 4.5), 405(51.5), 362(57.8), 345(28.7), 285(100), 274(19.3), 237(19.0), 127(91.55)

[실시예 10]

화합물 XI의 합성

화합물 IX 3g(7.9 mmole)의 MeOH 25ml에 소디움 페리오데이트(Sodium periodate) 3.38g(15.8 mmole)의 1N-H₂SO₄10ml를 가하여 2시간 동안 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 물과 에테르(ether)로 추출한 다음 에테르 층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 CHCl₃: MeOH=25 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 XI. 1.7g을 얻었다(수율 62%). 화합물 XI의¹H-NMR 챠트는 도 11과 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 348(M⁺, 4.1), 333(9.1), 289(4.4), 273(10.4), 251(32.2), 238(43.8), 223(100), 191(11.2), 163(17.1), 121(38.0)

[실시예 11]

화합물 XII의 합성

화합물 XI 3g(8.62 mmole)의 MeOH 용액에 고체 NaBH₄0.96g(25.9 mmole)을 가하여 15시간 교반하였다. T LC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 1N-HCl에 서서히 가한 다음 EtOAc로 3회 추출하고 EtOAc층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 CHCl₃:MeOH 15 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 XII 2.7g을 얻었다(수율 89%). 화합물 XII의¹H-NMR 챠트는 도 12와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 350(M⁺, 4.5), 335(100), 300(7.2), 275(45), 237(37.2), 175(21.5), 121(75.2), 109(68.7)

[실시예 12]

화합물 XIII의 합성

화합물 XI 1g(2.87 mmole)를 MeOH 25ml에 녹이고 Pd/C, HCOONH₄를 차례로 가한 후 상온에서 30분 동안 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 물과 에테르로 추출한 다음 에테르층을 무수 망초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산 : EtOAc =4 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 XIII 1g을 얻었다(수율 100%). 화합물 XIII의¹H-NMR 챠트는 도 13과 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 350(M⁺, 80), 335(100), 275(75.2), 223(99), 163(47), 121(89.2)

[실시예 13]

화합물 XIV의 합성

피누솔라이드 3g(8.67 mmole)을 무수 THF 50ml에 녹인 후 질소 기류하의 얼음욕(ice-bath) 0℃에서 교반하면서 2.0M-BH₃S(CH₃)₂의 THF 용액 0.22ml(2.89 mmole)을 점적하였다. 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후에 상온으로 옮기고 30%-H₂O₂0.23㎖와 3N-NaOH 2.9ml를 가한다. 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC로 반응의 완결을 확인한 후 반응 혼합물을 물과 에테르로 추출한 다음 에테르층을 무수아초로 탈수한 후 감압 농축하고 n-헥산 : EtOAc = 5 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 XIV 2.3g을 얻었다(수율 73%). 화합물 XIV의¹H-NMR 챠트는 도 14와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 364(M⁺, 2.0), 275(5.5), 262(11.2), 123(100), 107(20), 91(18.1)

[실시예 14]

화합물 XV의 합성

화밥물 XIV 2g(5.50 mmole)과 아세트산 0.78ml(8.24 mmole)의 아세틸화반응(acetylation)은 상기 실시예 2와 같이 실시하였다. n-헥산 : EtOAc = 7 : 1의 용매로 실리카겔 CC를 실시하여 화합물 XV 1.7g을 얻었다(수율 76%). 화합물 XV의¹H-NMR 챠트는 도 15와 같다.

Mass (El. m/z, 30eV, relative intensity, %) : 406(M⁺, 4.3), 373(4.3), 346(19.2), 314(19.0), 286(100), 271(28.1), 121(80)

상기 실시예들에서 제조된 화합물 I 내지 XV의 피누솔라이드 유도체들은 다음과 같이 각각 분석, 확인하였다.

(I) 피누솔라이드의 LiAlH₄에 의한 환원 C₂₁H₃₄O₄

화합물 I은 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 350이었으며, 피누솔라이드의¹H-NMR과 화합물 I의¹H-NMR을 비교해 보았을 때,¹H-NMR에서 피누솔라이드 X-Y 부분의 δ 7.078(1H, t) 수소가 사라지고 R₁부분의 δ 5.15(1H, d) 수소가 관찰되었다. 피누솔라이드에는 없는 δ 2.75(1H, s) 알코올(-OH) 봉우리가 관찰되었다. D₂O 처리를 하여 δ 2.75(1H, s)가 알코올 봉우리인지 확인하였다.

(II) 화합물 I의 아세틸레이션 C₂₃H₃₆O₅

화합물 II는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 392이었으며, 화합물 I의¹H-NMR과 비교해 보았을 때 R₁부분의 δ5.15(1H, d) 수소가 δ5.97(1H, d)로 이동하였다. δ2.75(1H, s)에 알코올(-OH) 봉우리가 사라지고 아세틸기의 메틸기(-CH₃) 수소가 δ1.61(3H, s)에서 관찰되었다.

(III) 피누솔라이드의 LiAlH₄에 의한 환원 C₂₀H₃₄O₃

화합물 III은 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 322이었으며, 피누솔라이드, 화합물 III의¹H-NMR과 비교해 보았을 때,¹H-NMR에서 피누솔라이드 X-Y 부분의 δ 7.078(1H, t) 수소가 사라지고 R₁부분의 δ5.15(1H, d) 수소가 관찰되었다. 피누솔라이드의 δ3.59(3H, s)에 메톡시기(-OCH₃) 1개가 사라지고 δ3.2(1H, s)에서 알코올(-OH) 봉우리와 인접한 메틸렌기(-CH₂-)가 δ 3.71(1H, q), δ3.25(1H, q)에서 관찰되었다. D₂O 처리를 하여 δ2.75(1H, s)가 알코올 봉우리인지 확인하였다.

(IV) 화합물 III의 아세틸레이션 C₂₄H₃₈O₅

화합물 IV는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 406이었으며, 화합물 III과 비교하였을 때, δ2.75(1H, s) 에 알코올 (-OH) 봉우리가 사라지고 아세틸기의 메틸기(-CH₃) 2개가 δ2.05(3H. s), δ1.58(3H, s)에서 관찰되었다.

(V) 피누솔라이드의 CoCl₂-NaBH₄에 의한 환원 C₂₁H₃₂O₄

화합물 V는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 348이었으며, 피누솔라이드 분자량보다 분자량이 2 증가한 것으로 X-Y 부분의 이중결합이 환원된 것을 추정할 수 있었다. 피누솔라이드의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 피누솔라이드 X-Y 부분의 δ7.078(1H, t) 수소가 사라졌다.

(VI) 피누솔라이드의 촉매 수소화(Catalytic hydrogenation)에 의한 환원 C₂₁H₃₄O₄

화합물 VI는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 350이었으며, 피누솔라이드의 분자량보다 분자량이 4증가한 것으로 X-Y 부분과, R₂부분의 이중결합이 환원된 것을 추정할 수 있었다. 피누솔라이드의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 피누솔라이드 X-Y 부분의 δ7.078(1H, s) 수소가 사라지고 락톤 고리의 메틸렌(-CH₂-) 수소 2개가 고자장에서 나타난 것으로X-Y 부분의 이중결합이 포화된 것을 알 수 있었다. R₂부분의 δ4.78(1H, s), δ4.55(1H, s)에 =CH₂수소 2개가 사라진 것으로 R₂부분이 포화된 것을 알 수 있었다.

(VII) 피누솔라이드의 DIBAL-H에 의한 환원 C₂₁H₃₀O₃

화합물 VII는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 330이었으며, 피누솔라이드의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 피누솔라이드 X-Y 부분의 δ7.078(1H, s) 수소가 사라지고 δ7.35(1H, s), δ7.19(1H, s)에 수소 2개와 δ6.25(1H, d)에 수소 1개가 나타난 것으로 락톤 고리 부분이 퓨란 고리로 된 것을 알 수 있었다.

(VIII) 화합물 VII의 m-CPBA에 의한 산화 C₂₁H₃₀O₅

화합물 VIII는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 362이었으며, 화합물 VII의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 락톤 고리 X-Y 부분의 δ7.078(1H, s) 수소가 나타나고 δ7.35(1H, s), δ7.19(1H, s)에 수소 2개와 δ6.25(1H, d)에 수소 1개가 사라진 것으로 푸란 고리 부분이 락톤 고리로 된 것을 알 수 있었다.

(IX) 피누솔라이드의 OsO₄에 의한 하이드록시화(수 Hydroxylation) C₂₁H₃₂O₆

화합물 IX는 무색의 결정으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 380이었으며, 녹는점이 121-122℃였다. 피누솔라이드의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 피누솔라이드의 R₂부분의 δ 4.87(1H, s), δ4.55(1H, s) 수소 2개가 사라지고 δ2.93(2H, s)에 알코올(-OH)수소 2개가 나타났으며 δ3.45(3H, d)에 메틸렌기(-CH₂-) 1개가 나타난 것을 관찰하였다. D₂O 처리를 하여 δ2.93(2H, s)가 알코올 봉우리인지 확인하였다.

(X) 화합물 IX의 아세트나이드 합성 C₂₄H₃₆O₆

화합물 X는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 420이었으며, 화합물 IX의 알코올(-OH) 수소 δ2.93(2H, s) 2개가 사라지고 δ1.41(3H, s), δ 1.32(3H, s) 메틸기(-CH₃) 3개가 나타났으며 화합물 IX의 δ3.45(3H, d) 메틸렌기(-CH₂-)가 δ3.76(3H, d) 저자장에서 나타난 것을 관찰하였다.

(XI) 화합물 IX의 NaIO₄에 의한 산화 C₂₀H₂₈O₅

화합물 XI는 무색의 결정으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 348이었으며 녹는점이 131-132℃였다. 화합물 IX의 알코올(-OH) 수소 ℃2.93(2H, s) 2개와 δ3.76(3H, d) 메틸렌기(-CH₂-)가 사라진 것을 관찰하였다.

(XII) 화합물 XI의 NaBH₄에 의한 환원 C₂₀H₃₀O₅

화합물 XII는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 350이었으며, 화합물 XI의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 화합물 XI는 없는 δ 2.93(2H, s) 알코올 (-OH) 수소를 관찰하였다. D₂O 처리를 하여 알코올 봉우리를 확인하였다.

(XIII) 화합물 XI의 Pd/C 촉매와 HCOONH₄에 의한 환원 C₂₀H₃₀O₅

화합물 XIII는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 350이었으며 화합물 XI의 분자량보다 분자량이 2증가한 것으로 X-Y 부분의 이중결합이 환원된 것을 추정할 수 있었다. 화합물 XI의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 화합물 XI의 X-Y 부분의 δ7.10(1H, t)수소가 사라진 것을 관찰하였다.

(XIV) 피누솔라이드의 수소화붕소첨가(Hydroboration) C₂₁H₃₂O₅

화합물 XIV는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 364이었으며, 피누솔라이드의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 피누솔라이드 R₂부분의 δ4.87(1H, s), δ4.55(1H, s) 수소 2개가 사라지고 δ2.75(1H, s) 알코올(-OH) 봉우리와 δ3.71(3H, d)에 메틸렌기(-CH₂-)1개가 나타난 것을 관찰하였다. D₂O 처리를 하여 δ2.93(2H, s)가 알코올 봉우리인지 확인하였다.

(XV) 화합물 XIV의 아세틸레이션 C₂₃H₃₄O₆

화합물 XV는 액상으로 질량 스펙트럼으로부터 분자량이 406이었으며, 화합물 XIV의¹H-NMR과 비교해 보았을 때, 메틸렌기(-CH₂-)가 δ4.20(1H), δ4.08(1H)로 이동하였으며, δ2.75(1H, s) 의알코올(-OH) 봉우리가 사라지고 아세틸기의 메틸기(-CH₃) 수소가 δ2.05(3H, s)에서 관찰되었다.

상기 실시예에 의해 제조된 본 발명의 일반구조식 (1)의 화합물들은 다음 표 1과 같다.

[표 1]

화합물 I-XV

다음 실험예로써 본 발명의 화합물의 효능을 측정하였다.

[실험예 1]

PAF 수용체 결합 저해 활성

1. 혈소판현탁액의 조제

ACD 용액(trisodium citrate 2.5%, citric acid 1.37%, glucose 2%) 1용량을 주사기에 미리 취한 후 토끼(2-3kg, white, male)의 심장에서 혈액을 5 용량 취하여 섞은 후 1200rpm에 10분간 원심분리하여 혈소판 펠렛(pellet)을 모아, 트리스-타이로드 완충액(Tris-tyrode buffer : pH 7.3, 0.01M)를 가하여 섞은 후 다시 원심분리하여 얻은 혈소판 펠렛에 적량의 완충액(buffer : 0.25% BSA 함유)를 가하여 2 x 10⁸cell/ml이 되도록 희석한다.

2.³H-PAF 용액의 조제

³H-PAF 일정량을 취하여 N₂기체하에서 용매를 제거한 후 완충액(0.01 Tris-tyrode buffer, pH 7.3, 0.25% BSA) 일정량(최종농도 1.2nM이 되도록)을 가하여 약 2분간 초음파처리(sonication)하였다.

3. 실험 조건 설정

최적 반응조건을 찾기 위한 기초 실험으로 반응시간과³H-PAF 농도를 변화시켜 특이결합(specific binding)이 포화농도에 이르게 하는 최소의 반응시간과³H-PAF 의 최소 농도를 아래에 기술한 실험방법으로 구하였다.

4. 실험방법

PAF 수용체 결합 저해 활성 측정은 발론(Valone)의 방법[F. H. Valone, E. Coles, V. R. Reinhold, et al., J. Immunol, 129, 1637(1982)]을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 총결합(total binding)은 검액 25㎕에 혈소한 현탁액 200㎕를 가한 후 6분간 전배양(preincubation)하고,³H-PAF (60,000 dpm, 최종농도 0.6nM)을 가하여 60분간 배양한 후 여과하였다. 비특이결합(Nonspecific binding)은³H-PAF 용액 대신³H-PAF 와 cold-PAF의 혼액(최종농도³H-PAF 0.6nM, clod-PAF 300nM) 25㎕를 가하였으며, 대조군(control)은 검액 대신 증류수 (혹은 saline)25㎕를 사용하였다. 반응 중단은 위에서 사용한 완충액으로 여과기(fillter : Skatron Co.)를 미리 적신 후 세포수 확기(Cell harvester)를 사용하여 감압 여과하고, 빙냉 완충액(ice-cold buffer)으로 세척하였다.

여과기에 남아있는 방사능(radioactivity)를 측정함으로써 혈소판 막에 결합된³H-PAF 의 양을 계산하였다. 모든 실험은 실온(18-22℃)에서 실시하였고, 모든 측정치는 4검체의 평균치로 표시하였다.

PAF 수용체에 결합된 특이결합(specific binding)은 다음 식에 의해 계산하였다.

[특이결합=총결합-비특이결합]

또한, 검체에 의한 PAF 수용체 결합 저해율(Inhibition %)은 다음 식에 의하여 산출하였다.

* Sc =대조군의 특이결합(Specific binding of control)

Ss=시료의 특이결합(Specific binding of sample)

Tc=대조군의 총결합(Total binding of control)

Ts=시료의 총결합(Total binding of sample)

Nc=대조군의 비특이결합(Nonspecific binding of control)

Ns=시료의 비특이결합(Nonspecific binding of sample)

5. 방사능의 측정

여과기(GF-C glass filter)는 상온에서 하룻밤(overningt)건조시킨 후 톨루엔계 혼합용액(cocktail solution)(PPO 4g, POPOP 0.1g in 1L toluene)을 1 바이알(vial)당 2ml씩 가하여 액체 신틸레이션 계수기(Liquid Scintillation counter)로 방사능(dpm)을 측정하였다.

[실험예 2]

국소 염증 억제 작용

국소 염증 억제 작용은 크로톤유-유도 마우스 귀-부종 시험분석법(croton oil-induced mouse ear-edema assay)[Bird, J., Kim, H. P. and Lee, H. J., Steroids, 47, 35(1986)]으로 측정하였다. 시료(Sample)는 아세톤에 녹여 사용하였고, 실험동물은 ICR계 마우스(female, 20-25g)를, 양성 대조군(positive control)으로는 하이드로코르티손(hydrocortison)을 사용하였고, 실험과정은 다음과 같이 행하였다. 즉, 약물을 투여전에 미리 마우스의 귀 두께를 마이크로메터(0.01mm unit, Fowler Precision Tools)로 측정하고, 아세톤에 녹인 시료 용액(혹은 아세톤) 25㎕를 마우스 귀에 오토피펫(autopipet)으로 골고루 펴 바른 후, 30분 후에 아세톤에 녹인 크로톤유(5% croton oil) 25㎕를 마우스 귀에 바른다. 5시간 경과후에 귀의 두께를 측정하였고, 국소 염증 억제율(Edema inhibition)은 아래의 식에 의하여 계산하였다.

X : 대조군의 귀 두께(mm)

Y : 시료군의 뒤 두께(mm)

[실험예 3]

PAF로 유사한 마우스 사망률 개선 효과

시료는 EtOH에 녹인 뒤 생리식염수로 희석하여 꼬리 정맥에 주사하였고, 실험동물은 ICR 계 마우스(male, 20g 내외)를, 양성 대조군으로 CV6209를 사용하였다. 먼저, EtOH 5%-saline 용액(5mg/kg)을 마우스의 꼬리정맥에 주사한 5분후에 PAF 용액(200, 100, 75 ㎍/kg/5ml, 0.25% BSA-saline 용액)을 꼬리정맥에 주사하여 LD₈₀을 유도하는 PAF의 용량을 결정하였다. 그 다음, 시료(혹은 EtOH 5%-saline 용액)를 마우스의 꼬리 정맥에 주사한 5분후에 PAF 용액을 꼬리정맥에 주사하여 살아남은 마우스의 백분율을 계산하였다.

[실험예 4]

LD₅₀의 측정

ICR계 생쥐 수컷 10마리를 1군으로 하여 3가지 이상의 용량으로 0.5% CMC 현탁액으로 조제한 시료를 1회 경구 투여후 2주 동안 생사여부를 관찰한다. 2주후 치사 동물수를 측정하여 프로빗 분석법(Probit Analysis)에 의하여 LD₅₀치를 구하였다.

상기의 결과, 피누솔라이드 유도체들의 시험관내(in vitro) PAF 수용체 결합 억제 효과는 아래 표 2와 같다. 락톤 고리에 불포화결합이 있는 경우에 활성이 가장 강하였다. A(R₂), B(R₃)환이 소수성일수록(hydrophobic) 활성이 증가하였다.

[표 2]

PAF 수용체 결합 억제효과

피누솔라이드 유도체들의 국소염증억제작용은 다음의 표 3에 나타내었다.

[표 3]

국소염증 억제작용

* 군당 5마리의 실험동물로 하여 평균값을 구하였다.

** 귀 두께 변화=크로톤유 처치 후의 귀 두께-처치전의 귀 두께

***P＜0.0001

PAF로 유도한 마우스의 사망률의 개선효과는 다음의 표 4에 나타내었다.

[표 4]

마우스에서 PAF 유도 사망률에 대한 피누솔라이드 유도체의 개선효과

* PAF(100㎍/kg)를 주사하기 5분 전에 시료를 전처리하였다(i.v.)

* 대조군 : 10% EtOH-saline solution 5mg/kg.

피누솔라이드 유도체들의 LD₅₀값은 다음의 표 5와 같다.

[표 5]

피누솔라이드 유도체들의 LD₅₀

이상의 실험예 및 그 결과에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 피누솔라이드 유도체들은 PAF-길항제로서 유효한 약리활성을 가지고 있으며 그 급성독성도 매우 낮은 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 화합물들은 질병의 예방과 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물들은 일일 0.1mg 내지 1000mg의 용량을 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제나 또는 보조제와 혼합하고 통상의 약제학적인 방법으로 경구 또는 비경구로 투여할 수 있는 약학적 제제로 제조하여 의약품으로 사용될 수 있다.

다음에 제제실시예로써 본 발명의 제제의 제조예를 예시한다.

제제실시예 1 : 정제의 제조

화합물 1 10mg

유당 20mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼하바고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 50mg의 정제로 타정한다.

제제실시예 2 : 캅셀제의 제조

화합물 5 10mg

유당 20mg

전분 19mg

탈크 1mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캠슐제의 제조방법에 따라서 50mg의 젤라틴 캡슐에 충진한다.

제제실시예 3 : 주사제의 제조

화합물 7 2mg

용해보조제 적량

주사용멸균정제수 적량

상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법에 의하여 2ml의 앰플에 충진하고 밀봉한 다음 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제실시예 4 : 시럽제의 제조

화합물 10 50mg

설탕 5g

이성화당 5g

정제수 적량

전체 50ml

상기의 성분을 정제수에 넣고 잘 교반한다음 50ml의 유리병에 충진하고 멸균하여 시럽제를 제조한다.

제제실시예 5 : 연고제의 제조

화합물 12 1g

디에타놀아민 1.5g

카르복시비닐폴리머 940 1g

하이드록시에틸 셀룰로오스 5g

에탄올 20g

폴리비닐피롤리돈 5g

프로필렌글리콜 30g

증류수를 가하여 전체 100ml로 함

상기의 성분을 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조한다.

제제실시예 6 : 크림제의 제조

화합물 15 1g

이소프로필 미리스테이트/이소프로필 팔미테이트 5g

/d이스프로필 스테아레이트 혼합물

팔미트산 및 모노- 및 디-글리세라이드 혼합물 4g

극히 고분자량의 적당히 가교결합된 폴리아크릴산 0.5g

세틸팔미테이트 4g

세틸스테아릴알콜 1g

45%(intensity)의 수산화나트륨 0.11g

글리세린 3g

벤진알콜 3g

정제수를 가하여 전체 100ml로 한다.

상기의 성분을 통상의 크림제의 제조방법에 따라서 크림제를 제조한다.

Claims

다음의 일반구조식 (1)로 표시되는 화합물

식중 R₁은 =O, -OH, -OAc 또는 X-Y와 함께를 형성하며, R₂는 -CH₃, =CH₂, -CH₂OH, -CH₂OAc, -OH, =O,또는를 나타내며, R₃는 -COOCH₃, -CH₂OAc 또는 -CH₂OH를 나타내며, X-Y는 CH-CH₂- 또는 C=CH-를 나타낸다.
제1항의 일반구조식 (1)의 화합물을 유효성분으로 함유하고 통상의 약제학적으로 사용되는 부형제 또는 보조제와 혼합하고 통상의 약제학적으로 사용되는 방법으로 제제화한 혈소판활성화인자(PAF) 길항 효과를 갖는 약학적 제제.