KR101904371B1

KR101904371B1 - 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101904371B1
Application number: KR1020180049646A
Authority: KR
Inventors: 김나영; 정승희; 조미영; 김명석; 서정수; 지보영; 김수경; 원경미; 전은지
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-04-30
Filing date: 2018-04-30
Publication date: 2018-10-08

Abstract

본 발명은 한인진 및/또는 참당귀를 포함하는 생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물 및 치료 또는 예방방법은 새우의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸하거나 증식을 억제하는 효과가 뛰어나, 새우의 급성간췌장괴사증후군의 치료 및 예방 효과가 우수하고, 새우에 부작용이 없는 생약성분으로써 안전하며, 사료와 함께 경구투여가 가능하여 양식업계에서 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.

Description

새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 조성물{Composition for treating or preventing Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease of Shrimp}

본 발명은 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 한인진 및/또는 참당귀를 포함하는 생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

유엔식량농업기구(FAO)가 최근 발표한 '세계수산양식현황' 보고서에 따르면, 전 세계 수산물 공급량 중 양식산이 차지하는 비중이 급속하게 증가하는 것으로 나타났으며, 연도별로 살펴보면 1990년에 13.4%에 불과했으나, 2012년에 42.2%, 2014년에는 79.0%로 증가하였고, 이 중에서도 특히 양식새우의 비중은 56%나 되는 것으로 나타났다(FAO, 2014).

우리나라의 새우양식은 서해안을 중심으로 1960년대부터 축제식 양식장이 개발되기 시작하였고, 1990년부터는 단기간 고소득을 올릴 수 있는 양식으로 각광을 받아 연안 가까이 위치한 논이나 밭을 저수지 형태로 개량하여 축제식 양식장을 만들어 대하(Fenneropenaeus chinensis) 양식이 활기를 띄었으나, 새우의 감염성 질병에 기인한 폐사로 인해 막대한 경제적인 손실이 발생하고 있는 실정이다. 세균성 질병으로 전 세계 새우양식장에서 심각한 피해를 입히고 있는 급성간췌장괴사증후군(AHPND)은 조기치사증후군(Early mortality syndrome; EMS)라는 이름으로도 알려져 있는데, 이는 종묘 입식 이후 30일 이내에 발생하는 초기 대량폐사를 통칭하여 조기치사증후군라고 명칭이 붙여진 후, 원인 병원체가 알려진 후 급성간췌장괴사증후군(AHPND)으로 명명되었다.

감수성 종으로는 홍다리얼룩새우(Penaeus monodon)와 흰다리새우(Penaeus vannamei)가 있으며, 이들 종에서는 100%에 달하는 폐사를 나타내었고, 대하(F. chinensis)에서도 급성간췌장괴사증후군의 발병이 보고된 바 있다(NACA, 2013). 이병에 감염된 새우는 간췌장의 색이 엷어지고 위축되며, 소화관이 비어있거나, 성장 부진 및 갑각연화를 나타내며 폐사하게 되며, 보통 입식 후 20~30일 내에 대량 폐사하고, 경우에 따라서는 100% 폐사하는 경우도 있다(FAO, 2013).

급성간췌장괴사증후군은 2009년 중국에서 첫 발생 이후 베트남(2010), 말레이시아(2011), 태국(2012), 멕시코(2013)로 급속히 확산되면서 전세계 양식산업에 큰 타격을 입히고 있고, 우리나라에서도 큰 문제를 유발하고 있으며, 이 질병은 해수상존 세균 중 하나인 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)의 감염에 의해 발생하는 것으로 밝혀졌다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스는 특히 독성물질 발현 유전자를 가지고 있는 경우에만 병원성을 가지는 것으로 알려져 있다.

최근 국내에서도 전남 신안, 경기도, 인천 지역의 새우양식장에서 발생한 대량폐사의 원인이 급성간췌장괴사증후군으로 밝혀졌으며, 신안지역의 경우 약 사육중이던 새우의 40% 정도가 폐사한 것으로 알려졌다.

한편, 한인진과 참당귀가 어류의 감염성 질환 치료 용도로 사용된 예는 있으나(대한민국 등록특허 제10-1709169호), 새우에서 급성간췌장괴사증후군을 비롯한 다른 감염성 질환 치료 용도로 사용된 예는 없다.

수산생물에는 어류, 갑각류, 패류가 있고, 그 속에는 많은 종들이 있는데, 그 중 어류는 생리적으로 위, 장 및 면역기관인 신장, 비장을 다 가지고 있어서 먹이 섭취 후 위, 장을 거쳐 소화되며, 면역기관인 신장과 비장에 의해서 면역작용이 발생한다. 어류는 포유류와 유사하게 선천성 면역과 후천성 면역을 다 가지고 있어서 면역자극이 들어오면 선천성 면역이 작동하며, 후천성 면역의 기능으로 백신을 통해 질병에 대한 예방도 가능하다. 반면 새우는 갑각류에 속하며, 혈림프에 존재하는 방어 인자에 의한 선천성 면역만 존재해 이러한 면역체계 차이로 인해 어류에 대한 효과가 인정된 조성물이 새우에도 효과가 있을 것이라고 판단하는데는 무리가 있다.

한편, 새우의 감염성 질환의 예방 및 치료에는 경구투여를 통한 예방 및 치료가 가장 효과적으로 지속적이며 안정적으로 체내 면역력을 유지 할수 있다. 그리고 현재까지 진행 중인 새우 치료제 및 백신에 관한 유사 연구들은, 효과기간이 짧고 가격이 비싸서 사용이 어려운 문제점이 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 감염에 의한 급성간췌장괴사증후군을 예방 또는 치료할 수 있는 안전성이 확보된 치료제 개발에 예의 노력한 결과, 다양한 후보물질 중 한인진과 참당귀의 혼합생약제를 에탄올 추출하여 사용하는 경우 새우에 안전하면서도 급성간췌장괴사증후군 치료효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1709169호

본 발명의 목적은 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방을 위한 신규한 조성물 및 사료 첨가제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 새우의 급성간췌장괴사증후군을 치료 또는 예방하기 위한 신규한 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한인진 및/또는 참당귀를 포함하는 생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 한인진 및/또는 참당귀를 포함하는 혼합생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물 또는 상기 사료를 새우에 투여하는 단계를 포함하는 새우의 급성간췌장괴사증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물 및 치료 또는 예방방법은 새우의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균을 사멸하거나 증식을 억제하는 효과가 뛰어나, 새우의 급성간췌장괴사증후군의 치료 및 예방 효과가 우수하고, 새우에 부작용이 없는 생약성분으로써 안전하며, 사료와 함께 경구투여가 가능하여 양식업계에서 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.

도 1은 한인진 단독생약제, 참당귀 단독생약제, 한인진/참당귀 혼합생약제를 50% 에탄올로 추출한 추출물의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 멸균활성을 비교한 결과이다.
도 2는 한인진 단독생약제, 참당귀 단독생약제, 한인진/참당귀 혼합생약제를 50% 에탄올로 추출한 추출물의 비브리오 하베이 항균활성을 비교한 결과이다.
도 3은 새우에 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 인위감염 후, 간췌장의 감염 병변을 확인하고, 균주 감염여부를 PCR로 확인한 결과(A) 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염 새우의 간췌장 병변을 H&E 염색하여 관찰한 결과(B)이다.
도 4는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 인위감염 후, 한인진/참당귀 혼합생약제를 농도별로 투여하여 새우의 체중변화를 확인한 결과이다.
도 5는 비브리오 파라헤몰리티쿠스 인위감염 후, 한인진/참당귀 혼합생약제를 농도별로 투여하여 새우의 PO 활성을 확인한 결과이다.
도 6은 비브리오 파라헤몰리티쿠스 인위감염 후, 한인진/참당귀 혼합생약제를 농도별로 투여하여 새우의 누적폐사율을 확인한 결과이다.
도 7은 한인진/참당귀 혼합생약제를 농도별로 새우에 투여한 후, 간췌장과 장을 H&E 염색하여 안전성 평가를 진행한 결과이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체적인 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 새우의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염에 따른 급성간췌장괴사증후군를 치료할 수 있는 생약제를 개발하기 위하여, 생약제 10종의 후보물질을 선별하고 테스트해보았다. 그 결과, 이들 후보물질중 한인진과 참당귀가 가장 우수한 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 사멸 및 증식 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 특히 이들을 혼합한 후 에탄올 추출하였을 때 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 사멸 및 증식 억제 효과가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 혼합생약재 추출물은 in vivo 상에서도 새우의 급성간췌장괴사증후군을 치료할 수 있는 효과를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 한인진 및/또는 참당귀를 포함하는 생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "유효성분"이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 약품의 효능, 효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 한인진 및/또는 참당귀를 포함하는 생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군의 치료 또는 예방용 조성물은 약학제제일 수 있으며, 본 발명의 약학제제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학제제의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며, 특히 경구 투여용 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 사료첨가제 조성에 관한 것이다. 본 발명의 사료첨가제 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 한인진 및/또는 참당귀의 에탄올 추출물을 이외에 사료첨가제 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 성장발육 촉진 물질, 면역 증강용 물질 등 각종 공지의 기능성 사료 첨가제용 물질들을 함께 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 오일 또는 분말 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 조성물 또는 상기 사료를 새우에 투여하는 단계를 포함하는 새우의 급성간췌장괴사증후군을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 투여는 경구 투여인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 조성물은 경구 투여가 가능하며, 본 발명에 따른 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 근육내, 복강내, 국소 투여 및 약욕(침치) 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명에서 한인진 및 참당귀 혼합생약제의 바람직한 투여 농도는, 한인진 및 참당귀 에탄올(50%) 혼합 추출물 0.01~1%(v/w), 바람직하게는 0.05~0.5%(v/w)가 되도록 사료에 침지시켜 매일 1~3회, 8주 내지 12주간 투여하는 것이 권장되나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 상기 한인진 및 참당귀 혼합생약제 투여방법은 사료에 침지시켜 경구 투여하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 유효 투여량은 피처리 새우의 크기, 질량, 투여시간, 투여방법, 건강상태, 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술분야의 통상의 전문가에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법은 새우 급성간췌장괴사증후군의 치료를 위하여 단독으로, 또는 기타 약물치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 조성물 및 방법을 적용할 수 있는 새우로는 홍다리얼룩새우(Penaeus monodon), 흰다리새우(Penaeus vannamei), 대하(Fenneropenaeus. chinensis), 청새우(Penaeus stylirostris), 인도 흰새우(Penaeus indicus) 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 혼합생약재 추출물은 인진:당귀의 비율이 중량비로 1:0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 1:1인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 혼합생약재 추출물은 생약을 열수 추출 또는 유기용매(메탄올 또는 에탄올)를 이용한 초음파 추출할수 있으며, 에탄올의 농도가 30% 내지 100%인 것이 바람직하고, 50% 내지 70%인 것이 가장 바람직하다.

본 발명은 일 양태에서 한인진과 참당귀를 혼합하여 한꺼번에 추출하였으나, 다른 양태로 인진과 당귀를 각각 추출하여 수득된 추출물을 혼합할 수도 있을 것이다.

본 발명에서 '참당귀'는 산형과의 여러해살이풀인 승검초의 뿌리로서, 주로 항염증, 진통작용 등이 있다.

본 발명에서 '인진'은 한인진을 말하며 더위지기의 지상부(Artemisia iwayomogi kitamura)로, 간보호 효과와 고지혈에 효과가 있다고 알려져 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방를 위한 생약재 후보물질 선정 및 항균활성 측정

항생제 대체제로 사용 가능한 생약재를 개발하고자, 수산용 동물용의약품으로 조기 개발하여 품목허가 취득이 가능한 생약 중, 특히 식품의 원료, 식품첨가물, 식용 섭취, 의약품 원료 등으로 사용되는 오배자, 한인진, 참당귀, 황금, 정향, 고삼, 귤피, 금은화, 자소엽, 동과자를 선정하고, 각 생약재의 열수 추출물(DW) 및 에탄올(EtOH, 각각 100, 90, 70, 50%) 초음파 추출물을 제작하였다. 열수 추출물은 생약 각 10g을 물 100ml로 6시간 동안 끓여서 이를 원액으로 사용하였으며, 에탄올 추출물은 생약 각 10g을 10배 부피의 에탄올로 50℃에서 1시간 동안 초음파 추출을 3회 반복한 후 40℃ 증발기로 농축 하고 동결건조 하였으며, 이는 10ml에 녹여 이를 원액으로 사용하였다.

새우의 급성간췌장괴사증후군의 원인균으로 알려진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 상기 10종의 후보물질의 항균활성을 확인하였다. 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균은 새우 양식장에서 직접 분리된 4종(V. parahaemolyticus WS, V. parahaemolyticus SC-4, V. parahaemolyticus WY-3, V. parahaemolyticus SM-3)을 사용하였다. 이를 간략히 서술하면, 4종의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 각각 10⁸ CFU/㎖의 농도로 조절하여 생약과 동일 부피비(1:1)로 혼합한 후, 5℃에서 배양한 후 0.2㎎의 p-idonitrotetazolium violet를 첨가하여 INT formazan의 생성에 의한 red color가 발색되지 않는 최소발육저지농도(MIC)를 조사해 보았다.

그 결과, 다른 후보물질에 비하여 오배자, 한인진, 참당귀, 정향에서 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 항균 효과가 높게 나타났고, 오배자의 경우 100% 또는 50% 에탄올 추출물에서, 한인진, 참당귀, 정향의 경우 50% 에탄올 추출물에서 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이에, 경제성과 효능을 모두 고려하여, 오배자, 한인진, 참당귀, 정향의 50% 에탄올 추출물을 사용하는 것으로 하고, 항균력에 대한 정밀분석을 진행하였다.

상기 후보군의 효과를 좀 더 면밀히 검증하고자, 100mm 플레이트에 배지를 넣고 상기 오배자, 한인진, 참당귀, 정향의 50% 에탄올 추출물을 각각 10, 100, 1,000, 10,000, 100,000 ppm의 농도로 추가 도포한 후, 양식장에서 분리한 4 종의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 각각 10⁸ CFU/㎖의 농도로 조절하여 생약과 동일 부피비(1:1)로 혼합한 후, 25℃에서 배양한 후 0.2㎎의 p-idonitrotetazolium violet를 첨가하여 INT formazan의 생성에 의한 red color가 발색되지 않는 최소발육저지농도(MIC)를 조사하였다.

그 결과, 4 종의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대하여 한인진, 참당귀, 오배자, 정향의 순으로 항균력이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 한인진, 참당귀 단독생약재 추출물과 한인진 및 참당귀 혼합생약재 추출물의 항균활성 비교

실시예 1의 실험 결과, 한인진과 참당귀의 50% 에탄올 추출물을 단독으로 사용하였을 때에도 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균에 대한 항균활성을 나타내었으나, 이를 혼합하여 추출하는 경우 더 나은 항균활성을 나타내는지 확인하고자 하였다.

이를 위하여, 각각 한인진, 참당귀, 한인진과 참당귀의 혼합 추출물을 각각 100, 500, 1,000, 5,000ppm의 농도로 비브리오 파라헤몰리티쿠스 SM-3 균주에 처리하여 향균력을 확인하였다.

그 결과, 하기 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 한인진과 참당귀를 각각 사용하였을 때에 비하여 함께 사용하였을 때, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주에 대한 현저히 상승(synergy) 효과가 나타남을 알수 있었고, 특히 100 ppm의 농도에서는 한인진 또는 참당귀 단독 사용시 전혀 항균활성을 나타내지 않았으나, 한인진과 참당귀를 혼합 사용하자 뛰어난 항균활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

	에탄올 추출물 농도(ppm)
	5,000	1,000	500	100
한인진	+++	++	+	-
참당귀	+++	+	-	-
한인진/참당귀	+++	+++	++	++

실시예 3: 한인진 및 참당귀 혼합 추출물의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균주에 대한 특이성

새우에 감염을 일으키는 비브리오 균으로는 비브리오 오웬시(V. owensii (FP8083)), 비브리오 하베이(V. harveyi (FP8112)), 비브리오 알지노라이티쿠스(V. alginolyticus (FP8506)) 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스(V. parahaemolyticus)가 알려져 있다.

이 중 한인진/참당귀 혼합 추출물의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 특이적 효과를 확인하기 위하여 한인진, 참당귀 각각의 단일 추출물과 한인진/참당귀 혼합 추출물의 항균 효과를 비브리오 하베이를 대상으로 확인해 보았다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 비브리오 하베이의 경우 한인진/참당귀 혼합 추출물을 100ppm 처리하여도 전혀 항균효과가 나타나지 않는 것으로 나타났다. 이는 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대한 혼합 추출물의 항균효과와 대조적인 결과로, 본 발명의 혼합 추출물이 특히 비브리오 파라헤몰리티쿠스에 대한 항균 효과가 현저함을 보여준다.

실시예 4: 한인진 및 참당귀 혼합 추출물의 새우의 급성간췌장괴사증후군에 대한 치료 효능 검증

새우에 급성간췌장괴사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 3×10³cfu/ml로 희석하고, 이를 새우에 0.1ml씩 근육주사하여 인위감염을 유발하였다.

감염 여부는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 특이적 프라이머를 이용하여(도 3A) 또는 감염된 새우의 간췌장에서 병변을 H&E 염색하여(도 3B) 확인하였다.

이후 한인진 및 참당귀 혼합생약제의 에탄올(50%) 추출물을 4%(v/w)의 농도로 대하용 사료(CJ, 한국)에 침지시키고, 매일 2회(오전 9시 및 오후 5시) 사료망을 이용하여 12주간 투여하며, 2주, 4주, 8주, 12주에 새우의 체중증가를 측정하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여 한인진 및 참당귀 혼합생약제의 에탄올(50%) 추출물을 투여한 그룹에서 약 20% 체중이 높게 평가되어, 더 건강한 개체로 성장하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

또한, 한인진 및 참당귀 혼합생약재의 에탄올(50%) 추출물을 0.1~1% 4%(v/w)의 농도로 대하용 사료(CJ, 한국)에 침지시켜 투여한 새우의 혈구분석 및 면역활성을 측정하였다. hemocytometer에 넣어 전체 혈구수(THC)를 계산하였고, Haemocyte의 형태를 granular cell(GC), hylaine cell(HC)로 구분하여 혈구를 계산하였으며, PO활성 측정은 채혈된 haemolymph에 homogenizer buffer를 넣어 마쇄한 후, 원심분리하여 상층액을 이용하였다. 분리된 상층액에 trypsin과 L-DOPA를 첨가하여 O.D. 490nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.

	Hemocyte count (× 10 ⁵ cell)	control	Concentration( % )
	Hemocyte count (× 10 ⁵ cell)	control	0.1	0.5	1
2 week	THC	71.13±35.67	77.05±27.72	81.88±25.42	88.85±38.63
	HC	46.94±29.42	53.40±18.74	55.81±18.68	60.90±29.90
	GC	24.19±8.93	23.65±9.59	26.06±7.99	27.95±11.50
4 week	THC	70.36±19.30	77.83±35.28	67.95±22.71	73.28±37.04
	HC	42.57±8.72	38.83±19.66	38.55±11.10	39.00±18.27
	GC	27.79±13.06	39.00±15.87	29.40±12.34	34.28±20.59
8 week	THC	106.00±58.08	138.94±30.03	128.69±44.63	130.40±47.94
	HC	68.75±44.57	62.94±19.47	48.38±19.07	52.25±32.09
	GC	37.25±14.77	76.00±13.27	80.31±38.55	78.15±19.98
12 week	THC	128.35±45.51	192.60±52.90	174.72±71.61	155.11±87.35
	HC	64.20±25.74	109.00±34.85	77.11±40.99	57.11±47.18
	GC	64.15±20.49	83.60±21.56	97.61±31.65	98.00±42.05

그 결과, 상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 전체 혈구수는 대조구 대비 추출 투여구에서 2주차부터 증가하기 시작해서 8주차에서 가장 많은 전체 혈구수(THC)를 나타냈고, 12주차까지 유지되었다. 투여농도는 4주차부터 0.1% 투여구에서 혈구수가 높게 나타나기 시작해서 12주차에 가장 높게 나타났다.

한편, PO 활성은 추출물 투여 후 2주부터 활성 증가를 나타내고 8주차에 최고 활성을 나타내어 12주까지 유지되었으며, 투여 농도 중에서는 0.1% 투여군에서 현저히 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

마지막으로, 한인진 및 참당귀 혼합생약재의 에탄올(50%) 추출물을 투여한 새우의 기간별, 농도별 상대생존율 및 누적폐사율을 확인해 보았다. 상대생존율(RPS)는 하기와 같은 식으로 계산하였다.

상대생존율(RPS) = 1-(실험구 폐사량/대조구 폐사량)×100

그 결과, 하기 표 3에서 볼 수 있듯이, 0.1% 농도 투여군이 8주 내지 12주간 투여하는 경우 가장 높은 상대생존율을 나타내는 것을 확인할 수 있었고 누적폐사율도 0.1% 농도 투여군이 8주간 처리한 경우 가장 적은 것으로 확인되었다(도 6).

4 weeks(%)			8 weeks(%)			12 weeks(%)
0.1	0.5	1.0	0.1	0.5	1.0	0.1	0.5	1.0
15	25	35	70	60	15	30	25	15

실시예 5: 한인진 및 참당귀 혼합 추출물의 새우에 대한 안전성 확인

새우에 한인진 및 참당귀 혼합생약제의 에탄올(50%) 추출물을 농도별로 투여하고, 새우의 급성간췌장괴사증후군의 주요 감염 조직인 간췌장과 장을 적출하여 davidson 용액(37.5% 에탄올, 12.5% 아세트산, 25% 포름알데히드(37% 용액))에 루 고정 후 2차 고정하여 H&E 염색 후 조직 검경을 진행하였다.

그 결과, 0.1%, 0.5%, 1% 투여된 모든 그룹의 간췌장과 장에서 대조구와 비교하여 유의적 병변이 관찰되지 않았다(도 7 참조). 이와 같은 결과로부터 한인진 및 참당귀 혼합생약제의 투여에 따른 새우의 안전성에는 큰 문제가 없는 것으로 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

한인진 및 참당귀를 포함하는 생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 한인진 및 참당귀는 1:0.5 내지 2의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에탄올은 30 내지 100% 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 새우의 급성간췌장괴사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균의 사멸하거나 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
한인진 및 참당귀를 포함하는 혼합생약재의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 새우의 급성간췌장괴사증후군 치료 또는 예방용 사료 첨가제.
제5항에 있어서, 상기 한인진 및 참당귀는 1:0.5 내지 2의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 첨가제.
제5항에 있어서, 상기 에탄올은 30 내지 100% 농도인 것을 특징으로 하는 첨가제.
제1항의 조성물 또는 제5항의 사료 첨가제를 새우에 투여하는 단계를 포함하는 새우의 급성간췌장괴사증후군을 치료 또는 예방하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 투여는 경구 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 한인진 및 참당귀의 에탄올 추출물은 0.01~1%(v/w)가 되도록 사료에 침지시켜 매일 1~3회, 8주 내지 12주간 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.