KR102205365B1 - 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 항기생충, 항균 또는 어류 성장 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 기생충에 대한 항기생충 또는 항균 조성물이 제공된다. 이에 의하여 이와 같은 항기생충 또는 항균 조성물을 어류양식용 사료에 첨가함으로써 어류의 스쿠티카증이나 에드워드병을 예방 또는 치료함으로써 양식어류의 폐사율을 현저히 감소시키고 성장율을 향상시킬 수 있다.

Description

진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 항기생충, 항균 또는 어류 성장 촉진용 조성물{Composition for antimicrobial, antiparasite or promoting growth of fishes comprising Citurs unshiu Markovich juice as an effective ingredient}

본 발명은 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 항기생충, 항균 또는 어류 성장 촉진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진피의 추출물의 추출 조건을 조절하여 항기생충, 항균 또는 어류 성장 촉진 효능을 현저히 향상시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.

스쿠티카증은 어류, 갑각류 및 연체동물에서 발생하는 Scuticociliatida목에 속하는 조직 섭이성 섬모충에 의한 감염증을 말하며, 우리나라의 해산양식에 심각하게 문제가 되고 있는 기생충성 질병이다. 원인충인 스쿠티카충은 대부분의 섬모충과는 달리 혈류를 타고 장, 신장, 생식소, 비장 및 뇌 조직까지 침투하여 높은 폐사를 유발하며 증상으로 체표 궤양, 소화불량, 체색흑화, 광분유영, 이상유영 등이 있다.

한편 국내 넙치 생산량의 20~30%가량이 폐사하고 있는 실정이고 그 중 스쿠티카충에 의한 폐사율이 35% 가량으로 가장 높은 비율을 차지하고 있다. 이처럼 스쿠티카충의 감염으로 인한 수산농가의 심각한 경제적 피해가 발생되고 있어 스쿠티카증을 저감시킬 수 있는 예방 및 치료제를 개발 하는 데 심혈을 기울이고 있는 실정이다.

현재 스쿠티카증에 대한 대책으로는 포르말린 (37% folmaldehyde solution)이 유일하게 스쿠티카충 구제제로 승인되어 사용되고 있으나 식품으로의 안전성과 환경오염을 일으키는 문제가 있다. 현재까지 스쿠티카충 구제물질에 관한 연구로는 기생충 구제제를 포함한 다양한 화학요법제 그리고 천연유래물질 등을 이용한 in vitro 항스쿠티카충 효과에 관한 보고가 있었으나, 상용화되지 않고 있으며 in vivo 또는 현장실험에서의 효과는 거의 보고되어 있지 않다.

스쿠티카는 넙치의 면역기전 중 여러 세포성 면역 기전을 저해하는 물질을 분비하는 것으로 밝혀졌으며 넙치는 스쿠티카증에 대한 저항력이 다른 어종에 비해 떨어지는 것으로 나타났다. 실제로 조피볼락 양식장은 스쿠티카증에 대한 피해가 거의 없지만 유독 넙치 양식장에서 많은 피해를 받고 있는 것도 이러한 스쿠티카의 면역기전 억제능력, 그리고 넙치의 스쿠티카에 대한 낮은 저항성이 복합적으로 이루어낸 결과물이라 할 수 있다. 또한 넙치 양식장에서 소량의 스쿠티카충으로도 50%가 넘는 치사율이 나타난다. 따라서 스쿠티카증을 예방하려면 체액성 면역력을 증진시키는 면역증강제나 첨가제를 투여하고 소량의 스쿠티카충이라도 체표에 감염되는 것을 막아야한다. 이러한 스쿠티카충의 감염을 막기 위하여 백신 개발이 국내외로 활발히 진행되고 있다. 스쿠티카충의 불활화백신을 넙치에 면역하면 충에 대한 특이면역이 증강되는 것을 확인하였으며, 이 후에도 DNA 재조합 백신, 스쿠티카 백신에 효과적인 adjuvant 개발, 상용화를 위한 백신 제조 기술이전이 진행되었으나 아직까지 뚜렷한 효과를 보거나 상용화되지 못하고 있다. 또한 섬모에 I항원이 있으며 I항원에서도 여러 혈청형이 존재하는데 이러한 이유로 백신개발에는 어려움을 겪고 있다. 면역인자들이 발현되지 않거나 감소한 것으로 볼 때 충에 의한 면역억제가 일어나는 것으로 추정되며 충에 대한 면역력을 증강시키기 위해서는 선천성 면역력을 높여주는 방향으로 이루어져야 한다는 것을 알 수 있다.

정리하자면, 현재 스쿠티카증으로 넙치 양식에서 막대한 피해를 받고 있으며 이를 치료하기 위한 약물로 포르말린이 유일하게 사용되고 있는데 심각한 환경오염과 식품안전으로 문제가 대두되고 있다. 또한 넙치 양식 환경에서도 소량의 스쿠티카로도 높은 치사율을 보이고 있다. 이와 더불어 스쿠티카는 체내에서 여러 선천성 면역반응을 저해시키고 넙치의 항스쿠티카능은 다른 어종에 비해 떨어진다.

따라서 포르말린을 대체하면서도 친환경적이고, 스쿠티카 등에 대한 항기생충 효능이 높고, 제조비용을 절감할 수 있으며, 양식 어류의 사료용으로 독성이 없는 천연유리 물질의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허공보 제10- 381726호 한국공개특허공보 제2020-0004562호

본 발명의 목적은 면역력 향상의 간접적인 방법이 아니라 직접적인 스쿠티카 살충효과가 있는 성분으로 환경에 유해하면서 비용이 높은 포르말린을 대체하며, 친환경적이고, 원재료의 비용이 낮으면서도 제조공정이 매우 간소한 스쿠티카 등의 기생충과 병원균에 의한 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 기생충에 대한 항기생충 조성물, 또는 병원균에 대한 항균 조성물 및 그의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 넙치 등의 양식어류에 투여함으로써 성장율을 현저히 향상시킬 수 있는 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 성장 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명 다른 또 하나이 목적은 상기 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 첨가함으로써 사료의 공급만으로도 양식 어류의 항기생충, 항균 또는 성장 촉진 효능을 나타낼 수 있는 사료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 기생충에 대한 항기생충 조성물이 제공된다.

상기 진피 착즙액은 진피와 물의 혼합물에 대한 착즙액일 수 있다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 진피와 물의 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것일 수 있다.

상기 기생충은 스쿠티카 충(Miamiensis avidus)일 수 있다.

상기 항기생충 조성물은 기생충에 대한 살충용일 수 있다.

상기 어류는 넙치, 놀래기, 농어, 부세, 복어, 숭어, 조피볼락, 참돔, 및 농어 중에서 선택된 1종 이상의 해수어일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류를 숙주로 하는 병원균에 대한 항균 조성물이 제공된다.

상기 진피 착즙액은 진피와 물의 혼합물에 대한 착즙액일 수 있다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 진피와 물의 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것일 수 있다.

상기 병원균은 에드워지엘라 균(Edwardsiella tarda)일 수 있다.

상기 항균 조성물은 병원균의 살균용일 수 있다.

상기 어류는 넙치, 놀래기, 농어, 부세, 복어, 숭어, 조피볼락, 참돔, 및 농어 중에서 선택된 1종 이상의 해수어, 또는 틸라피아, 잉어, 미꾸라지, 뱀장어, 황어, 메기, 및 동자개 중에서 선택된 1종 이상의 담수어일 수 있다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 성장 촉진용 조성물이 제공된다.

상기 진피 착즙액은 진피와 물의 혼합물에 대한 착즙액일 수 있다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 진피와 물의 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

상기 조성물을 포함하는 어류양식용 사료 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

진피와 물을 혼합한 혼합물을 제조하여 진피 성분이 추출되도록 한 후, 압착하는 방법으로 착즙하는 단계를 포함하는 어류 기생충에 대한 항기생충 조성물의 제조방법이 제공된다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 할 수 있다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

진피와 물을 혼합한 혼합물을 제조하여 진피 성분이 추출되도록 한 후, 압착하는 방법으로 착즙하는 단계를 포함하는 어류를 숙주로 하는 병원균에 대한 항균 조성물의 제조방법이 제공된다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 할 수 있다.

진피와 물을 혼합한 혼합물을 제조하여 진피 성분이 추출되도록 한 후, 압착하는 방법으로 착즙하는 단계를 포함하는 어류 성장 촉진용 조성물의 제조방법이 제공된다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 할 수 있다.

본 발명의 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역력 향상의 간접적인 방법이 아니라 직접적인 기생충에 대한 살충활성 또는 애드워지엘라 균 등 병원균에 대한 항균활성을 가지고, 성장률을 향상시키며, 환경에 유해하면서 비용이 높은 포르말린을 대체하면서도 친환경적이고, 원재료의 비용이 낮으면서도 제조공정이 매우 간단하여 생산 효율이 매우 높은 장점을 갖는다.

또한, 본 발명의 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 사료 조성물은 넙치 등의 양식어류에 식이제공하는 것만으로도 치사율이 높은 스쿠티카증, 에드워드병 등이 질병으로부터 양식어류를 보호할 수 있다.

도 1은 실험예 1의 진피 추출방법에 따른 스쿠티카의 최소치사농도(MLC) 분석 결과이다.
도 2는 실험예 3에 따른 넙치에서 항스쿠티카능 분석 결과이다.
도 3은 실험예 5에 따른 틸라피아에서 항균능 분석 결과이다.
도 4는 실험예 6에 따른 ROI 측정 결과이다.
도 5는 실험예 6에 따른 탐식능(Phagocytic activity) 측정결과이다.
도 6은 실험예 6에 따른 탐식지수(Phagocytic index) 측정결과이다.
도 7은 실험예 6에 따른 라이소자임 활성의 측정결과이다.
도 8은 실험예 6에 따른 ACH50 측정결과이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명의 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 기생충에 대한 항기생충 조성물에 대해 설명하도록 한다.

상기 진피 착즙액은 진피와 물의 혼합물에 대한 착즙액일 수 있다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 진피와 물의 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 20 내지 27℃의 물과 진피 혼합물을 10 내지 20시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것일 수 있다.

상기 진피는 분쇄되지 않은 것을 사용하고, 이에 따라 수득된 착즙액에는 착즙박이 포함되지 않는 것을 특징으로 한다. 분쇄된 진피를 재료로 사용하는 경우 착즙액에 분쇄되어 미세화된 착즙박이 포함될 수 있고, 이 경우 목적하는 기능성을 나타내기 어렵다.

상기 기생충은 스쿠티카 충(Miamiensis avidus) 일 수 있고, 이에 대한 항기생충 효능은 면역력 향상에 의한 간접적인 효과가 아니라 스쿠티카 충에 대한 직접적인 살충용도인 것을 특징으로 한다.

상기 어류는 넙치, 놀래기, 농어, 부세, 복어, 숭어, 조피볼락, 참돔, 및 농어 중에서 선택된 1종 이상의 해수어 일 수 있고, 주로 스쿠티카증의 발병률이 높은 넙체인 것이 바람직하나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않으며 스쿠티카증이 발병되는 모든 어종을 포함한다.

본 발명은 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류를 숙주로 하는 병원균에 대한 항균 조성물을 제공한다.

상기 진피 착즙액의 특징은 상술한 바와 동일하다.

상기 병원균은 에드워지엘라 균(Edwardsiella tarda)일 수 있다.

장내 세균과에 속하는 에드워지엘라 균(Edwardsiella tarda)은 몸 표면에 편모를 가진 주모성 균으로 그람음성인 단간균이다.

에드워지엘라 균에 의해 발생하는 에드워드(Edward)병은 잉어, 틸라피아 등의 담수어에서 주로 발생하는 병이나, 넙치 등의 해수어에서도 발생할 수 있다.

에드워드 병의 증상으로는 꼬리지느러미가 붉어지고, 항문이 부어오르면서 붉어지고, 복강까지 구멍이 뚫리는 증상을 나타내기도 한다. 해부하면 간, 창자, 복부에 궤양이 생기고 악취가 나며 농이 나온다. 성행하는 시기는 주로 여름철이다.

상기 항균 조성물은 어류의 면역력 향상에 따른 간접적인 효과를 발휘하는 것이 아닌 에드워지엘라 균에 대한 살균용인 것을 특징으로 한다.

상기 어류는 넙치, 놀래기, 농어, 부세, 복어, 숭어, 조피볼락, 참돔, 및 농어 중에서 선택된 1종 이상의 해수어, 또는 틸라피아, 잉어, 미꾸라지, 뱀장어, 황어, 메기, 및 동자개 중에서 선택된 1종 이상의 담수어일 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 성장 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 진피 착즙액의 특징은 상술한 바와 동일하다.

한편, 본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 진피 착즙액의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 진피 착즙액은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 진피 착즙액은 천연물로서 과량 투여하여도 부작용이 적으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 진피 착즙액의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 진피 착즙액을 포함하는 항기생충, 항균 또는 어류 성장 촉진용 조성물이 첨가된 어류양식용 사료 조성물을 제공한다.

상기 사료 조성물에 포함되는 성분은 진피 착즙액을 제외하고 통상적인 어류양식용 사료를 적용할 수 있다.

또한, 본 발명은 진피와 물을 혼합한 혼합물을 제조하여 진피 성분이 추출되도록 한 후, 압착하는 방법으로 착즙하는 단계를 포함하는 어류 기생충에 대한 항기생충 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 진피 착즙액의 제조방법은 진피를 수분 흡수 전 미리 분쇄하지 않으며 진피 상태에서 수분을 흡수시킨 후 분쇄하고 압착하여 착즙하는 것을 특징으로 한다.

상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 진피와 물의 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 20 내지 27℃의 물과 진피 혼합물을 10 내지 20시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것일 수 있다.

상기 진피는 분쇄되지 않은 것을 사용하고, 이에 따라 수득된 착즙액에는 착즙박이 포함되지 않는 것을 특징으로 한다. 분쇄된 진피를 재료로 사용하는 경우 착즙액에 분쇄되어 미세화된 착즙박이 포함될 수 있고, 이 경우 목적하는 기능성을 나타내기 어렵다.

또한, 물의 온도가 상기 범위를 벗어나거나, 진피 추출 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 목적하는 효과를 얻기 어렵다.

또한, 본 발명은 진피와 물을 혼합한 혼합물을 제조하여 진피 성분이 추출되도록 한 후, 압착하는 방법으로 착즙하는 단계를 포함하는 어류를 숙주로 하는 병원균에 대한 항균 조성물의 제조방법이 제공된다.

진피 착즙 방법의 구체적인 조건은 상술한 바와 동일하다.

또한, 본 발명은 진피에 수분을 흡수시킨 후 착즙하여 수득된 진피 착즙액을 유효성분으로 포함하는 어류 성장 촉진용 조성물이 제공된다.

진피 착즙 방법의 구체적인 조건은 상술한 바와 동일하다.

[실시예: 진피 착즙액 제조]

실시예 1

진피를 분쇄하여 진피가루를 제조한 후 25℃의 증류수 100㎖에 진피가루 10g을 넣고 15시간 동안 두어 수분을 흡수시킨 후 부직포로 압착하여 착즙액을 수득하였다.

실시예 2

25℃의 증류수 100㎖에 분쇄하지 않은 진피 10g을 넣고 15시간 동안 두어 수분을 흡수시킨 후에 부직포로 압착하여 착즙액을 수득하고 착즙박은 제거하였다.

실시예 3

25℃의 증류수 100㎖에 분쇄하지 않은 진피를 10g을 넣고 15시간 동안 두어 수분을 흡수시킨 후에 600×g에서 15분간 원심분리 후 상층액을 분리하였다.

실시예 4

진피 10g을 증류수 100㎖에 넣고 100℃, 90℃, 80℃, 70℃, 60℃에서 각각 열수 추출하였다.

실시예 5

진피 10 g을 70% 에탄올에 넣고 Branson Bransonic® CPX Digital bath 8800 (EMERSON, St. Louis, US)으로 1시간 동안 초음파 처리하였으며 600×g으로 10분간 원심분리를 하여 수집한 상층액을 감압농축플라스크에 취하여 50℃ 이하의 수욕상에서 감압농축하여 에탄올을 모두 증발시켰다.

실시예 6

25℃의 증류수 100㎖에 분쇄하지 않은 진피를 10g을 넣고 15시간 동안 두어 수분을 흡수시킨 후에 600×g에서 15분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 침전물을 수득하였다.

[실시예: 사료 제조]

실시예 7: 진피 착즙액 첨가 사료

실시예 2에 따라 제조된 진피 착즙액을 사료 중량 대비 각각 0.1, 0.5, 1, 5%만큼 첨가하였다. 구체적으로, 사료 100g 당 D.W. 39.9㎖에 진피 착즙액 0.1㎖를 넣은 후 첨가한 군을 0.1%군, 사료 100g당 D.W. 39.5㎖에 진피 착즙액 0.5㎖를 첨가한 군을 0.5%군, 사료 100g당 D.W. 39㎖에 진피 착즙액 1㎖를 첨가한 군을 1%군, 사료 100g당 D.W. 35㎖에 진피 착즙액 5㎖를 첨가한 군을 5%군으로 하였다. 한편 D.W. 40 ㎖을 사료 100 g에 흡착시킨 군을 대조군으로 하였다. 플라스틱 통에 사료를 넣고 상기 함량으로 진피 착즙액을 첨가한 후 골고루 흔들어주어 사료 전체에 흡착이 되게 한 후 트레이에 넓게 펼쳐서 건조시켰다. 제조된 사료는 -20℃에서 보관하였다.

비교예 1: 효모 첨가 사료

사용된 효모는 Phichia anomala로 연구실에 deep freezer에서 -80℃에서 보관중인 균주를 사용하였다. 효모를 해동한 즉시 YM broth (BD, New Jersey, US)에 접종하고 37℃에서 배양하였다. 24시간 후 액체배지에서 평판고형배지로 계대하여 배양한 효모의 단일집락을 취해 액체배지 10㎖에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양한 효모를 1×10⁷, 1×10⁶, 1×10⁵, 1×10⁴ CFU/㎖를 사료 중량 대비 40%만큼 첨가하였다.

구체적으로, 효모 40㎖를 600×g에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 분리하고 펠렛을 PBS 40㎖에 희석한 것을 Y7군, 효모 4㎖를 상층액 분리 후 PBS 36㎖에 희석한 것을 Y6군, 효모 0.4㎖를 상층액 분리 후 PBS 39.6㎖에 희석한 것을 Y5군, 효모 0.04㎖를 상층액 분리 후 PBS 39.96㎖에 희석한 것을 Y4군으로 하였다. 한편, PBS 40㎖를 사료에 첨가한 것을 대조군으로 하였다.

비교예 2: 진피 착즙액 + 효모 복합 첨가 사료

진피 착즙액과 효모 복합 첨가사료는 비교예 1과 동일한 방법으로 배양한 4㎖의 효모를 600×g에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 분리하고 펠렛에 진피 착즙액 1㎖를 첨가하여 PBS 40㎖에 희석한 후 사료 100g에 첨가하고 이를 1%+Y6군으로 하였다.

[실험예]

실험예 1: 진피 추출방법에 따른 스쿠티카의 최소치사농도(MLC) 분석

스쿠티카(Miamiensis avidus)의 분리를 위해 완도의 육상수조 양식장에서 스쿠티카증을 나타내는 넙치를 실험실 내로 이동하여 최종 감염 기관인 뇌를 적출하였다. 적출한 뇌조직을 PBS (sterile phosphate buffer saline)에 1% PS (penicillin-streptomycin)를 첨가한 용액으로 3회 세척 후 25 cm² polystyrene culture flask (SPL, Pocheon, Korea)에서 25℃ 인큐베이터에서 12시간 배양하였다. 이 후 감염 조직액 1 ㎖를 PBS로 2배 단계 희석하여 순수 분리하였다. 분리한 스쿠티카충은 1651 MA medium (ATCC, Virginia, USA)에서 배양하였으며 25℃에서 7일 마다 계대하여 유지하였다. 또한, 스쿠티카(M. avidus)를 대량 배양하기 위해 2 ℓ medium bottle에 1651 MA medium (ATCC, Virginia, USA) 1ℓ를 넣고 스쿠티카를 2×10³ 수만큼 접종하였다. 접종 후 shaking incubator에서 130 rpm, 25℃로 진탕 배양하였다. 접종 후 shaking incubator에서 130 rpm, 25℃로 진탕 배양하였다. 접종 4일 후 2×10⁵ cells/㎖에 도달하였을 때 공격실험에 사용하였다.

여과된 멸균해수에 각각의 추출물들을 40%(v/v)부터 0.15%(v/v)까지 2배 단계로 희석하여 96 well plate의 각 well에 200㎕씩 넣고 4×10³ 수의 스쿠티카충을 노출시켰다. 대조군은 멸균해수에 상기 추출물 대신 증류수를 사용한 것을 제외하고 동일한 방법을 실험을 수행하였다.

추출 방법에 따라 스쿠티카에 대한 최소치사농도(MLC)를 알아보기 위해 노출시킨 즉시 스쿠티카의 운동성이 없어졌을 때, 또는 충이 완전히 터진 상태를 사멸로 보고 최소치사농도 (minimal lethal concentration, MLC)를 측정하여 (Iglesias et al., 2002) 그 결과를 도 1에 나타내었다.

이에 따르면, 실시예 1의 분쇄된 진피로 착즙한 진피 착즙액(A)과 미분쇄 진피의 착즙액에서 분리된 상층액인 실시예 3(C)의 최소치사농도(MLC)는 40%인데 반해, 미분쇄 진피의 착즙 후 착즙박을 제외시킨 실시예 2의 진피 착즙액(B)과 미분쇄 진피 착즙액에서 분리된 침전물인 실시예 6의 진피 착즙액 침전물(F)의 최소치사농도(MLC)는 5%로 큰 차이를 나타내었다.

한편, 실시예 4의 추출수 온도에 따른 진피 열수추출물(D-100, 90, 80, 70, 60)에는 100℃를 제외한 모든 추출온도에서 20%로 나타났으며 100℃에서는 살충효과가 전혀 관찰되지 않았다. 또한 실시예 5의 진피 알코올 추출물(E)은 실시예 2의 진피 착즙액(B)과 같은 5%의 MLC를 보였다. 그러나 실시예 5의 방법은 실시예 2의 방법과 비교할 때 용매의 비용이나 감압 농축시 비용이 높고 공정이 번거로운 단점이 있다.

이와 같은 결과로 볼 때, 실시예 2의 미분쇄 진피 착즙액과 실시예 6의 미분쇄 진피 착즙액의 침전물은 스쿠치카충에 대한 살충 효과가 매우 우수한 것을 알 수 있었다. 그러나 실시예 2와 동일한 성분을 포함하고 있는 실시예 1의 분쇄 진피 착즙액은 살충 효과가 매우 낮게 나타났고, 그 이유는 진피를 착즙 전 미리 분쇄처리 함으로써 착즙액에 착즙박 성분이 일부 포함되었고, 착즙박의 성분이 살충효과를 억제한 것으로 추정할 수 있다. 또한, 실시예 3의 진피 착즙액 상층액은 살충 효과가 낮은데 비해, 실시예 6의 진피 착즙액의 침전물은 실시예 2와 동일한 수준의 살충 효과를 나타내는 것은 실시예 2의 진피 착즙액 성분 중 상층액이 아닌 침전물이 스쿠치카충에 대한 살충효과를 나타낸다고 추측할 수 있다.

다시 말해, 실시예 2의 추출방법은 수분을 흡수시키고 착즙하는 간단한 공정만으로도 스쿠치카충에 대한 살충 효과가 매우 높은 성분을 수득할 수 있다.

실험예 2: 넙치의 성장률 분석

실험에 사용된 넙치 (Paralichthys olivaceus)는 전남 고흥 소재의 양식장에서 분양받아 무게를 측정하여 비슷한 중량의 넙치로 선별하여 실험수조에 순치시켰다. 순치 전 넙치는 100ppm 농도의 포르말린(37% Formaldehyde)으로 30분 동안 약욕하였다. 실험에 사용된 사각 유리수조(900㎜×450㎜×450㎜)에 해수를 수심 400㎜만큼 채운 후 수온은 20±3℃로 유지하였으며 순환 여과식 사육법을 사용하였다. 환수는 일주일에 1회씩 100% 실시하였다. 환수에는 과산화수소 100ppm으로 소독된 해수를 사용하였다.

선별 과정에서 실험어의 최초 무게를 측정하고 실험수조에 실시예 2의 진피 착즙액 첨가사료인 0.1%군, 0.5%군, 1%군, 5%군과 효모 첨가사료인 Y6, Y7군 및 진피 착즙액과 효모를 혼합하여 첨가한 사료인 1%+Y6군을 설정하여 각 군당 넙치 10 미를 넣고 하루에 어체중량의 2%만큼 7일간 급여하였다. 급여 후 공격실험 시 수조에 침지시키기 전에 최종무게를 측정하여 성장률을 측정하였다.

성장률 측정은 넙치를 수조에 순치시키기 전 최초무게를 측정하였고 7일간 첨가사료 급여 후 실험 전에 최종무게를 측정하여 성장률을 측정하였다. 섭취한 사료량은 사료를 공급한 지 30분 후에 섭취하지 않은 사료를 전부 채취하여 건조시킨 후 전체 공급량에서 제외하여 측정하였다. 최종 무게 측정 후 아래와 같은 식을 이용하여 증체량, 증체율, 및 일일 성장률을 산출하였다.

[식]

증체량(g) = 최종체중(g) - 최초체중(g)

증체율(%)= [100×(최종체중 - 최초체중) / 최초체중]

일일성장률(Specific growth rate) = [{ln최종체중(g) - ln최초체중(g)} / DAY]×100

이와 같이 성장률을 측정한 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

측정치	사료 형태
	대조군	0.1%	0.5%	1%	5%	Y6	Y7	1%+Y6
최초체중(g)	385	372	383	361	385	380	371	363
최종체중(g)	490	508	507	522	526	507	513	520
증체량 (g)	105	136	124	161	141	127	142	157
증체율(%)	27.27	36.56	32.38	44.60	36.62	33.42	38.27	43.25
일일성장률(%)	1.72	2.23	2.00	2.63	2.23	2.06	2.31	2.57

이에 따르면, 모든 군에서 대조군에 비해 사료효율이 개선되는 것으로 나타났으며, 진피 착즙액과 효모를 혼합하여 첨가한 사료의 경우 진피 착즙액을 단독으로 첨가하였을 때보다 사료효율이 개선되는 효과가 좋지 않았다. 따라서 넙치에서는 효모를 고농도로 첨가하여도 사료효율이 개선되며, 효모를 단독으로 첨가하였을 때보다 진피 착즙액과 혼합하여 넣었을 때에는 사료효율이 더욱 개선되지만 진피 착즙액을 단독으로 첨가하였을 때보다는 효과가 좋지 않다는 것을 알 수 있다. 결론적으로, 사료에 진피 착즙액을 단독으로 첨가하는 것이 사료효율이 가장 우수하였다.

실험예 3: 넙치에서 항스쿠티카능 분석

실험예 2와 동일한 사료 조건에 따른 각 군의 넙치를 10ℓ 아크릴 수조에 수용한 뒤 스쿠티카충이 2×10³cells/㎖의 농도가 되도록 접종하여 넙치를 48시간 동안 침지 감염시켰다. 침지 감염 후 넙치를 다시 본 수조로 환원한 뒤 다음 날부터 사료를 공급하였다. 공격실험 기간 동안 폐사한 개체는 즉시 폐사원인을 분석하였다. 스쿠티카로 인한 폐사는 스쿠티카 감염증상인 체표괴사, 체색흑화, 새변의 비대, 괴사 부위 및 뇌에서 충의 분리를 통해 판단하였다.

실험예 2의 다양한 형태의 첨가사료를 넙치에게 7일 동안 공급한 후 스쿠티카충을 감염시켰을 때 2주간에 걸친 누적 폐사율을 도 2에 나타내었다.

이에 따르면, 공격 3일째부터 폐사가 나타나기 시작하여 6일째 이후로 폐사한 넙치가 더 이상 나타나지 않았다. 진피 착즙액 첨가사료의 경우 공격실험 기간 동안 0.5%군의 경우 100% 생존 하였으며 5%군의 경우 5일째에 전량 폐사하였다. 대조군과 1%군에서는 6일째에 40%의 생존율을 보였다. 효모 첨가사료에 경우 Y6군과 Y7군 모두 90%의 생존율을 보였다. 하지만 진피 착즙액과 효모를 혼합하여 첨가한 사료는 대조군보다 낮은 10%의 생존율을 보였다. 폐사한 개체는 모두 체표괴사 및 새변의 곤봉화, 빈혈 등의 전형적인 스쿠티카증을 보였으며 병변에서 스쿠티카충이 분리되었다.

실험예 4: 틸라피아의 성장률 측정

실험에 사용된 틸라피아(Oreochromis niloticus)는 군산대학교 부속 양식장에서 분양받아 실험수조에 순치시켰다. 실험에 사용된 수조는 200ℓ 원형수조로 수온은 25±1℃로 유지하였으며 지수식 사육법을 사용하였다. 순치 전 틸라피아는 50 ppm의 oxytetracycline으로 1시간 동안 약욕하였다. 환수는 3일에 한번 80%씩 sodium thiosulfate를 이용하여 염소를 제거한 수돗물을 사용하였다.

실시예 2의 진피 착즙액이 0.1, 0.5, 5%만큼 첨가된 사료를 틸라피아 20 미를 대상으로 급여 후 성장률 측정을 하였다. 첨가사료는 하루에 어체중량의 2%만큼 7일간 급여하였다. 첨가사료를 7일 동안 공급한 후 나타난 틸라피아의 성장률 및 사료계수를 산출하였으며 산출방법은 실험예 2와 동일하다. 성장률 측정 결과를 아래의 표 2에 나타내었다.

측정치	사료형태
	대조군	0.1%	0.5%	5%
최초체중(g)	1429	1387	1372	1368
최종체중(g)	1561	1524	1547	1555
증체량(g)	132	137	175	187
증체율(%)	9.24	9.88	12.76	13.67
일일성장률(%)	0.63	0.67	0.86	0.92
사료계수	2.48	2.48	1.98	1.83

이에 따르면, 0.1%군의 경우 대조군에 비해 증체량, 증체율, 일일 성장률에서 개선되는 것으로 나타났으나 사료계수는 동일한 수치로 나타났다. 하지만 나머지 0.5, 5%군에서는 모든 지표에서 대조군보다 개선되는 것으로 나타났다.

실험예 5: 틸라피아에서 항균능 분석

실험에 사용된 틸라피아는 실험예 4의 20미 중 14미를 항균능 실험에 사용하였다. 또한, 실험에 사용된 병원성 균주는 애드워지엘라 균(Edwardsiella tarda)(KCTC 12267)로 Korean Collection for Type Culture(KCTC)에서 분양받아 -80℃에서 보관 중인 균주를 사용하였다. 실험 전 균주를 해동하여 brain heart infusion (BHI, BD, New Jersey, US) broth에 접종하고 25℃에서 24시간 배양 후 Salmonella Shigella(SS) agar로 계대하였다. 이후 형성된 흑색 집락을 취하여 BHI broth로 계대하고 25℃에서 24시간 배양하였다. 공격접종은 2×10³ CFU/㎖ 균주를 100 ㎕씩 복강 주사하였다. 접종 이후에 실험예 4와 동일한 조건의 사료를 계속해서 급여해주었다.

공격접종 후 7일간의 생존율을 도 3에 나타내었다. 이에 따르면, 0.5%군이 71%로 생존율이 가장 높아 항균능이 가장 높은 것으로 나타났으며, 대조군이 36%로 가장 낮은 생존율을 보였다. 0.1%군과 5%군은 각각 50%와 43%의 생존율을 보였다.

실험예 6: 선천성 면역반응 평가

실험에 사용된 틸라피아는 실험예 4의 20미 중 6미를 대상으로 면역평가에 사용하였다. 사료 급여는 실험예 2와 같이 실시예 2의 진피 착즙액 1%군, 5%군과 효모 첨가사료인 Y6, Y7군 및 진피 착즙액과 효모를 혼합하여 첨가한 사료인 1%+Y6군을 설정하여 하루에 어체중량의 2%만큼 7일간 급여한 후 면역반응을 평가하였다.

상기와 같이 급여한 틸라피아를 대상으로 ROI, phagocytosis, ACH50을 측정하였다.

(1) 실험 방법

백혈구 수집

백혈구 수집 방법은 Santarem et al., (1997)의 방법을 조금 수정하여 사용하였다. 틸라피아를 해부하여 신장을 적출한 뒤 4㎖의 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) + 10% fetal bovine serum (FBS) + 1% penicillin-streptomycin solution (SIGMA, Germany)에 넣었다. 적출한 신장은 104㎛ Spectra/Mesh® Woven Filgers stainless steel mesh (Spectrum Laboratory, Inc., USA)에 올려놓고 짓눌러 백혈구를 방출시킨 후 histopaque-1077 (SIGMA, Germany)을 이용하여 2500×g, 4℃에서 40분간 원심분리 한 후 형성된 buffy-coat층에서 백혈구를 수집하였다. 수집한 백혈구는 DMEM으로 30×g, 4℃에서 5분간 2회 세척한 후 hematocytometer (FORTUNA, Germany)를 이용하여 세포수를 확인하였고 동일한 세포 수 (1×10⁶ cell/㎖)가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다.

혈청 수집

혈청 수집을 위해 틸라피아의 미병부에서 26G needle을 부착한 1 ㎖ 주사기로 채혈하였다. 채취한 혈액은 4℃에서 오버나이트 후 1200×g로 10분간 원심 분리하여 혈청을 수집하였으며 실험에 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

Reactive oxygen intermediates (ROI) 활성 측정

선천성 면역반응의 일종인 활성산소 생성 수준을 비교하기 위해 Nitroblue tetrazolium (NBT)의 환원 능력을 조사하였다 (Secombes et al., 1988). 신장에서 분리한 백혈구 200 ㎕를 96 well plate에 넣고 30×g, 4℃에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 phorbol myristate acetate (PMA, 1 ㎍/㎖)를 첨가한 nitroblue tetrazolium (NBT, 1 ㎍/㎖)를 각각 100 ㎕씩 첨가하여 상온의 암실에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 30×g, 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 PBS로 2회 세척하였다. 120㎕ KOH와 140㎕ Dimethyl sulfoxide (DMSO, SIGMA, St. Louis, US)를 첨가한 후 Sunrise micro plate reader (TECAN, Mδnnedorf, Swiss)로 620nm에서 흡광도를 측정하였다.

식세포(Phagocytosis) 활성

탐식능(Phagocytic activity)(PA)는 Pulsford et al., (2012)의 방법으로 측정하였다. Chamber slide (Thermo scientific, Nunc)에 분리한 백혈구를 200 ㎕씩 분주한 후 R.T.의 암실에서 오버나이트 배양하였다. 배양 후에 Zymosan (1×10⁶ cell/㎖, SIGMA, St. Louis, US)을 well당 10㎕씩 분주한 후 상온의 암실에서 오버나이트 배양하였다. 배양 후 30×g, 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 PBS로 2회 세척하였다. 70% 메탄올로 고정하고 30×g, 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. Chamber slide의 덮개와 well을 분리하여 R.T.에서 건조시킨 후 고무를 제거하여 다시 건조시켰다. 건조 후에 Wright giemsa stain 염색 용액을 첨가하여 2분간 염색하고, Wright giemsa stain 염색액이 있는 상태에서 완충액을 같은 양으로 첨가하여 4분간 처리한 후 D.W.로 세척하고 건조시켰다. 광학현미경(CX-41, Olympus)로 검경하여 무작위로 100마리의 백혈구 숫자를 센 후 Zymosan을 잡아먹은 백혈구의 수를 세어 아래와 같은 공식을 이용하여 PA를 구하였고 식세포 작용을 한 백혈구의 숫자를 Zymosan의 수로 나누어 탐식지수(Phagocytic index)(PI)를 구하였다.

[식]

Phagocytic activity (PA) = 탐식 세포수 / 총세포수 × 100

Phagocytic index (PI) = Zymosan의 수 / 탐식 세포수

라이소자임 활성(Lysozyme activity) 측정

96 well plate에 0.2M citrate phosphate buffer(pH 5.8)에 2mg/㎖의 Micrococcus lysodeikticus (SIGMA, St. Louis, US)를 부유시킨 용액을 well 당 70 ㎕을 넣고 채취한 혈청을 30 ㎕씩 분주한 후 30초부터 4분 30초까지 반응시켜 감소하는 흡광도의 양을 Sunrise micro plate reader (TECAN, Mannedorf, Swiss)로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit은 분당 0.001의 흡광도가 감소하는 양으로 나타내었다.

Alternative pathway complement hemolysis 50(ACH50) 측정

ACH50 측정은 Yano (1992)의 방법을 이용하여 분석하였다. 토끼의 혈액을 채취하기 위해 23G needle을 부착한 5 ㎖ 주사기에 50 IU의 헤파린을 처리하고 이개정맥에서 혈액을 채취하여 histopaque-1077 (SIGMA, St. Louis, US)을 이용하여 적혈구를 분리하였다. 분리된 토끼의 적혈구 (rabbit red blood cell, RaRBC)를 0.01M ethylene glycol tetraacetic acid -Mg-gelatin veronal buffer (EGTA-Mg-GVB)로 2회 washing한 후 1×10⁸ cells/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다. 틸라피아 혈청을 PBS로 1:11의 농도로 희석한 후 96 well plate에 well 당 200, 150, 100, 50 ㎕씩 분주하고 EGTA-Mg-GVB를 각각의 well의 총량이 200 ㎕가 되도록 분주하였다. RaRBC를 각각의 well에 100 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 30×g, 4℃에서 5분간 원심 분리하였다. 형성된 상층액 100 ㎕을 취하여 Sunrise micro plate reader (TECAN, Mannedorf, Swiss)를 이용하여 405 nm에서 측정하였다. 용혈된 적혈구 (Y)는 Y/(1-Y) 공식을 이용하여 50%의 용혈을 계산한 뒤 unit/㎖를 산출하였다.

(2) 실험 결과

도 4에 따르면, ROI 측정 결과 모든 군이 대조군에 비해 유의적으로 높은 수치가 나타났다. 대조군에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었던 1%군과 Y6군을 혼합한 1%+Y6군은 1%군과 Y6군에 비해 상승효과가 있을 것으로 예상하였지만 유의적인 차이가 없었다.

도 5에 따르면, 탐식능(Phagocytic activity)의 경우 모든 군에서 대조군에 비해 유의적인 차이가 없었으며 도 6에 따르면 탐식지수(Phagocytic index)도 마찬가지의 결과가 나타났다

도 7에 따르면, 라이소자임 활성(Lysozyme activity)를 측정한 결과를 보여주고 있다. 효모를 첨가한 사료 및 효모와 진피추출물을 혼합한 사료에서 평균적으로 대조군보다 낮게 나왔지만 유의적인 차이는 없었다. 진피 착즙액을 첨가한 사료에서도 대조군과 비교하였을 때 유의적으로 차이나지 않았다.

도 8에 따르면, ACH50 측정결과 진피 착즙액 첨가사료인 1, 5% 모두 대조군에 비해 유의적인 차이가 나타나지 않았지만 효모 첨가사료인 Y6에서는 유의적으로 높은 수치가 나타났다. 하지만 둘을 혼합한 사료인 1%+Y6에서는 ROI의 결과와 마찬가지로 상승효과 없이 대조군과 유의적 차이가 없었다.

이와 같은 결과들을 살펴볼 때, 진피 착즙액이 틸라피아의 선천성 면역에는 영향을 주지 않은 것이고, 직접적으로 병원균에 작용하는 살균작용으로 질병을 예방하거나 치료하는 것을 알 수 있었다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (22)

1. 진피 착즙액으로부터 분리된 침전물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 진피 착즙액은 미분쇄 진피와 물의 혼합물에 대한 착즙액이고,
   상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 미분쇄 진피와 물의 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 한 것이고,
   상기 침전물은 상기 진피 착즙액을 원심분리한 후 상층액을 제거한 것이고,
   어류 기생충인 스쿠티카 충(Miamiensis avidus)에 대한 살충용인 것을 특징으로 하는 항기생충 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 어류는 넙치, 놀래기, 농어, 부세, 복어, 숭어, 조피볼락, 참돔, 및 농어 중에서 선택된 1종 이상의 해수어인 것을 특징으로 하는 항기생충 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 미분쇄 진피와 물을 혼합한 혼합물을 제조하여 진피 성분이 추출되도록 한 후, 압착하는 방법으로 착즙하는 단계를 포함하고,
    상기 단계는 상기 물은 15 내지 30℃의 물이고, 상기 혼합물은 6 내지 24시간 동안 두어 진피 성분이 추출되도록 하여 진피 착즙액을 수득하는 것이고,
    상기 진피 착즙액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 수득하는 단계;를 추가로 수행하고,
    어류 기생충인 스쿠티카 충(Miamiensis avidus)에 대한 살충용인 항기생충 조성물의 제조방법.
18. 삭제
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