KR101107034B1 - 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제 및 이를 함유하는 어류용 사료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제 및 이를 함유하는 어류용 사료에 관한 것이다. 본 발명은 해산 양식어류에 대해 세균성 질병, 기생충, 물곰팡이 등으로 인한 피해를 줄일 수 있는 천연 어류용 사료첨가제 및 이를 함유한 어류용 사료를 제공함으로써 항생제 등을 사용하지 않아 부작용을 감소시킬 수 있으며, 환경오염에 대한 우려가 없고 육질이 좋은 고품질 어류를 생산할 수 있다.

Description

고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제 및 이를 함유하는 어류용 사료{Feed additives for cultivated fish consisting herbal mixture water extracts of Sophorae flavescens Aition, Citrus unshiu Markovich, Lonicera japonica Thunberg, Benincasa hispida Cogniaux, Perilla frutescens var. acuta Kudo and Scutellaria Baicalensis Georgi as an active ingredient and feed for cultivated fish therewith}

본 발명은 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제 및 이를 함유하는 어류용 사료에 관한 것이다.

국내 어류 양식 생산량은 해마다 지속적으로 증가하여 1990년도 2,656톤에서 2009년도 109,516톤이며 생산금액은 981,609 백만원으로 1990년도 대비 2009년도는 약 41배에 가까운 높은 생산량을 나타내었다. 이중 넙치 양식 생산량은 2009년도의 경우 54,674톤으로 전체 양식 생산량의 약 49.9%를 차지하고 있으며, 생산 금액은 545,700 백만원으로 전체 어류 양식 생산금액의 55.6%를 차지하여 우리나라 단일 양식 품종으로는 가장 높은 생산량, 생산금액을 내고 있는 중요한 품종이다.

그러나 양식 과정에서 태풍, 고수온, 적조와 같은 자연 재해 또는 질병 발생 등으로 폐사가 발생하여 2009년도의 경우 전체 입식한 양식 어류에서 198,250천마리, 이중 넙치는 49,299천마리가 폐사하여 입식량의 약 40%가 폐사하는 경제적으로 큰 손실을 일으키고 있다(어류양식현황조사, 통계청). 이는 양식산업이 발전함에 따라 시설규모도 소규모에서 대규모로 전환되고 사육방법 또한 고밀도로 사육하는 경우가 많아 사육관리 부주의 등으로 각종 질병이 발생되고 있으며, 고수온기 기생충 및 세균에 의한 단독 감염이 주를 이룬 양식 초기와는 달리 수온과 상관없이 연중 다양한 병원체가 혼합감염의 형태로 질병을 일으켜 큰 피해를 나타내고 있다.

해산 양식어류에 피해를 주는 세균성 질병으로는 어종에 따라 약간의 차이는 있으나, 연쇄구균증, 비브리오병, 에드와드병, 활주세균증 등이 보고되고 있다. 이 중에서 연쇄구균증과 에드와드병은 가장 오래전부터 넙치에 만성적이고 고질적으로 감염되어 누적폐사율의 심화로 많은 경제적 손실을 야기하는 것으로 널리 알려져 왔다.

더욱 안전하고 위생적인 웰빙 수산식품을 선호하는 소비자들의 선진요구에 따라 식품 안전성, 고급화가 고려된 수산식품의 인증제도, 예를 들어, 수산물품질인증제도, 친환경수산물인증 제도, HACCP 등이 실행되고 있다. 이에 따라 식품의 안전성과 관련하여 양식 수산물에 안전하게 사용할 수 있는 친환경적인 치료 약제의 개발이 절실하게 요구되고 있다. 양식장에서 질병치료를 위해 사용하는 항생제는 휴약 기간을 잘 준수하면 어류 체내에서 완전히 배설되어 식품위생법상 잔류허용기준치를 초과하지 않는다. 그렇지만 과학적인 항생제 잔류분석의 수치가 아무리 안전하다고 강조하여도 소비자들의 안심에 대한 심리적인 속마음까지 충족시키지는 못하는 실정이다.

천연식물자원을 이용한 치료약제 개발은 녹색성장과 연계된 시대적인 대안을 제시해 줄 수 있는 좋은 대상물질로 생각되고 있다. 또한 인체에 사용되고 있는 한약재와 같은 천연식물자원을 찾아내어 이를 유효적절하게 사용한다면, 환경오염에 대한 우려가 없고 육질이 좋은 고품질 어류를 생산할 수 있게 되므로 양식 어업인들에게 경제적인 측면에서 높은 수익을 유도할 수 있게 될 것으로 기대된다. 나아가서는 항생제의 사용저감을 유도할 수 있는 현실적인 방안이기도 하다.

한편, 고삼은 쌍떡잎식물 장미목 콩과에 속하는 여러해살이 풀이며 전국의 산지에 자생하는 야생화로 꽃은 층상꽃차례로 핀다. 고삼의 학명은 Sophorae flavescens Aiton이며, 고삼이라는 이름은 맛이 써서 고(苦)라는 글자를 사용하고 효능이 삼과 유사하다하여 삼(參) 이라는 글자를 사용한다. 주로 뿌리를 약재로 사용하며 거풍살충(祛風殺蟲), 청열이노(淸熱利尿), 청열조습(淸熱燥濕) 작용이 있다고 하여 백혈구감소증 치료 및 항방사능 작용, 혈당을 낮추는 작용, 항종양, 항균, 면역기능 억제 등에 시용되고 있으며 민간에서는 줄기나 잎을 달여서 살충제로 쓰기도 하며 여드름 치료에도 효과가 있다.

귤의 껍질을 말린 것을 귤피 또는 진피라 하며, 푸른 열매의 껍질은 청귤피라 한다. 귤피의 학명은 Citrus unshiu MARKOVICH이며 이기건비(理氣健脾), 조습화담(燥濕化痰) 등의 효능이 있으며 정유, 비타민C, B₁ 플라보노이드 배당체가 주성분으로 건위, 거담작용이 있어 본경(本經)에서는 풍한습(風寒濕)의 사기(邪氣)로 인하여 저리거나 오싹오싹 추운 증상을 치료하고 열을 제거한다고 하였다.

금은화의 학명은 Lonicera japonica Thunberg이며 인동과(Caprifoliaceae)에 속하는 반상록 덩굴성 관목인 인동의 꽃으로 인동은 한겨울에도 엷은 잎 몇 개로 겨울을 난다고 인동초라 부르기도 하며 인동은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 모두가 약재로 쓰인다. 5월∼6월경에 흰색의 꽃이 피었다가 시간이 지나면 노란색으로 변한다 하여 금은화라 하는데, 양혈(凉血), 소산풍열(疏散風熱), 지리(止痢), 청열(淸熱), 해독(解毒) 작용이 있어 예로부터 종양(肉腫)의 약으로 몸에 난 부스럼 및 종기를 치료하고 피부질환을 치료하는데 사용되었다.

쌍떡잎식물 박목 박과의 한해살이 덩굴식물로 ‘동아‘라 하며 이수(利水), 소옹배농(消癰排膿), 청폐화담(淸肺化痰)의 효능이 있어 거담, 해열, 이뇨, 소염 등에 효과가 있으며 폐렴, 폐농양, 부종, 각기병 등에 효과가 있다. 과육, 껍질, 속, 씨, 잎 모두 약리작용이 있어 민간요법으로도 많이 사용되는데 동과의 씨를 동과자라하며 유효성분으로는 사포닌, 지방, 히스타민 등을 함유하고 있다. 동과자의 학명은 Benincasa hispida Cogniaux이다.

꿀풀과에 속하는 일년생 초본으로 특수한 향기가 있으며 잎을 소엽, 줄기를 소경, 씨앗을 소자라 하며 모두 약재로 이용한다. 소엽은 특유의 향을 가지며 비타민 B와 C, 칼슘, 철분 등이 풍부하며 특히 암예방에 효과가 있는 베타카로틴의 함유량이 당근이나 파슬리보다 높다. 자소엽의 학명은 Perilla frutescens var. acuta Kudo이며, 자소엽은 해어해독(解魚蟹毒), 해표산한(解表散寒), 행기관중(行氣寬中), 행기안태(行氣安胎)의 효능이 있어 해산물의 독을 풀어 주고 뱀이나 개에게 물린 상처를 치료하며 가래를 삭혀 폐를 편안하게 한다. 식용하는 청엽은 방부작용이 있어 요리에 사용하면 식중독 예방에 효과가 있다.

황금의 학명은 Scutellaria baicalensis Georgi이며 꿀풀과에 속하는 여러해살이 풀이며, 꽃은 7∼8월에 피고 자주빛이 돌며 층상꽃차례로 한쪽으로 치우쳐서 달린다. 식물의 뿌리를 약용으로 사용하는데 해열, 이뇨, 진정, 해독, 소염, 항진균 작용이 있으며 습열(濕熱)을 제거하는 효과가 있으며 지혈작용이 있어 한방에서 해열, 이뇨, 지사, 이담 및 소염제로 이용한다.

본 발명자들은 해산 양식어류에 대해 세균성 질병, 기생충 또는 물곰팡이에 의한 질환 등으로 인한 피해를 줄일 수 있는 천연 사료첨가제에 대해 예의 연구를 거듭하였고, 그 결과 상술한 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제를 열수추출하여 얻은 추출물을 사료첨가제로서 사용하는 경우, 항생제 등을 사용하여 발생되는 부작용을 감소시킬 수 있으며, 환경오염에 대한 우려가 없고 육질이 좋은 고품질 어류를 생산할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 해산 양식어류에 발생하는 세균성 질환에 대한 항균활성효과, 기생충 살충효과 및 항곰팡이효과를 가지는 천연 사료첨가제 및 이를 포함한 어류용 사료를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 해산 양식어류에 피해를 주는 질환들을 치료 및 예방하기 위해 항생제 등을 사용하지 않아 부작용을 감소시킬 수 있으며, 환경오염에 대한 우려가 없고 육질이 좋은 고품질 어류를 생산할 수 있는 사료첨가제 및 이를 포함한 어류용 사료를 제공하는 데 있다.

전술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 복합생약제의 열수추출물은 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금의 6종류의 생약제를 증류수와 함께 농축기에 넣은 후, 90∼120℃에서 0.2 kgf/cm²의 압력으로 2시간 동안 가열하고 여과하여 수득될 수 있으며, 이에 제한되지 않고 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금의 6종류의 복합생약제에 대해 일반적인 열수추출법을 사용하여 수득된 것을 사용할 수 있음은 물론이다.

상기 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금의 생약제는 일반 시중에서 시판되거나 재배된 것을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제는 넙치 등과 같은 어류의 사료에 첨가되어 경구투여되는 경우, 세균성 질환, 기생충성 질환 및 진균성 질환에 대해 예방 및 치료 효과를 나타낸다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제는 에드와드병, 비브리오병, 장관백탁증, 유결절증, 연쇄구균증 등과 같은 세균성 질환에 대해 항균활성효과를 나타내어, 어류의 세균성 질환에 대해 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다(하기 시험예 1 참조).

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제는 스쿠티카충과 같은 기생충에 대해 기생충 살충효과를 나타내어, 어류의 기생충성 질환에 대해 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다(하기 시험예 2 참조).

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제는 물곰팡이 등에 대해 항곰팡이 효과를 나타내어, 어류의 진균성 질환에 대해 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다(하기 시험예 3 참조).

본 발명에 따른 상술한 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제는 사료의 전체 중량에 대하여 0.01 중량%로 첨가되어 4주 내지 8주 동안 투여되는 것이 에드와드병을 예방 효과에 있어서 가장 바람직하다(하기 시험예 5 참조).

본 발명은 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제 및 이를 함유하는 어류용 사료를 제공함으로써, 해산 양식어류에 대해 세균성 질병, 기생충, 물곰팡이 등으로 인한 피해를 줄일 수 있는 천연 어류용 사료첨가제 및 이를 포함한 어류용 사료를 제공하여 항생제 등을 사용하지 않아 부작용을 감소시킬 수 있으며, 환경오염에 대한 우려가 없고 육질이 좋은 고품질 어류를 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 시험예 4에서 복합생약제 열수추출물을 각기 다른 농도로 첨가한 사료를 넙치에 경구투여한 후 2주, 4주, 8주 및 12주에서의 간의 병리조직학적 상태를 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 시험예 4에서 복합생약제 열수추출물을 각기 다른 농도로 첨가한 사료를 넙치에 경구투여한 후 2주, 4주, 8주 및 12주에서의 비장의 병리조직학적 상태를 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 시험예 4에서 복합생약제 열수추출물을 각기 다른 농도로 첨가한 사료를 넙치에 경구투여한 후 2주, 4주, 8주 및 12주에서의 신장의 병리조직학적 상태를 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 시험예 5에서 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료를 4주동안 투여한 후 넙치의 누적폐사율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 시험예 5에서 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료를 8주동안 투여한 후 넙치의 누적폐사율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 어류용 사료첨가제의 제조

시중에서 구입한 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금의 6종류의 생약제를 증류수 5L에 각각 500g씩 넣은 후, 동남자동농축기(동남산업, DJ001)를 이용하여 90∼120℃에서 0.2 kgf/cm²의 압력으로 2시간 동안 가열한 다음, 여과하여 복합생약제 열수추출물을 수득하였다.

시험예 1: 복합생약제 열수추출물의 세균에 대한 시험관내 항균활성 효과 시험

상기 실시예 1에서 수득된 복합생약제 열수추출물을 사용하여 어류 질병의 원인세균으로 그람음성 4종 및 그람양성 4종 총 8종, 14 균주(Edwardsiella tarda GY-01 및 FP5060, Vibrio ichthyoenteri FP4004, V. harveyi KCCM40866 및 FP4208, Photobacterium damselae ATCC33539 및 FP3325, Streptococcus iniae FP5228 및 KCTC3657, S. parauberis FP4123 및 KCTC3651, Lactococcus garvieae FP4066 및 ATCC49156, L. raffinose KCTC3509)에 대해 하기의 방법에 따라 항균활성을 측정하였다. 96웰 세포배양 플레이트(96 well tissue culture plate)에 상술한 어병세균의 현탁액과 농도별 복합생약제 열수추출물을 각각 100㎕ 씩 혼합(1:1)하여 25℃에서 배양하였다. 그리고 0.2㎎의 p-요오드니트로 테트라졸리움 바이올렛(p-iodonitrotetazolium violet)을 40㎕ 씩을 웰(well) 마다 첨가하여, INT 포르마잔(formazan)의 생성에 의한 붉은색이 발색되지 않는 항균활성 농도를 조사하였다. 이 때 어병세균은 Brain Heart Infusion 액체배지(이하 BHI, Difco)를 이용하여 10⁸ CFU/㎖가 되도록 조절하였으며, 복합생약제 열수추출물 원액에다 BHI로서 최종농도가 10배, 100배, 1,000배가 되도록 희석한 시료를 이용하였으며 상기 항균효과에 대한 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

표 1을 참조하면, 상기 어병세균 14종류 모두에 대한 항균활성은 복합생약제 열수추출물 원액에서만 효능이 나타났다. 그러나, E. tarda, V. ichthyoenteri, V. harveyi, S. paruberius, L. garvieae가 포함된 총 9개 세균은 10배 희석액에서도 항균효능이 나타났다. 물론 이러한 항균효능이 질병 치료를 위해 사용하는 항생제의 약제감수성 시험 결과와 직접 비교할 수는 없었다.

시험예 2: 복합생약제 열수추출물의 기생충에 대한 시험관내 살충효과 시험

상기 실시예 1에서 수득된 복합생약제 열수추출물을 사용하여 넙치에서 분리한 스쿠티카충(Miamiensis avidus)에 대한 살충효과 시험을 수행하였다. 보다 상세하게는 넙치 세포주(15℃)에서 계대배양하면서 기생충을 분리하여 시험관 내에 넣고 기생충 시료와 동량(1:1 중량비)으로 상기 복합생약제 열수추출물을 넣은 후, 20℃ 배양기에서 10분, 20분, 40분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간이 경과할 때마다 살충여부를 관찰하였다. 복합생약제 열수추출물은 원액에다 BHI로서 최종농도가 10배, 100배, 1,000배가 되도록 희석한 시료를 이용하였다. 살충여부의 확인에는 기생충의 사멸정도, 충체의 움직임, 세포질 파괴정도가 포함되었고 그 결과를 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.

표 2를 참조하면, 스쿠티카충에 대한 살충효과는 복합생약제 열수추출물 원액을 사용한 경우 기생충이 모두 사멸된 것을 알 수 있다. 복합생약제 열수추출물의 10배 희석액에서는 10분부터 40분이 경과하였을 때, 생존율이 20%로 나타났으며, 1시간 경과부터 3시간까지 생존율이 10∼0%를 보였다가, 4시간 이후에 모두 사멸하였다.

시험예 3: 복합생약제 열수추출물의 물곰팡이에 대한 시험관내 살충효과 시험

상기 실시예 1에서 수득된 복합생약제 열수추출물을 사용하여 뱀장어로부터 분리한 물곰팡이(Saprolegenia sp.)에 대한 항곰팡이 효과를 시험하였다. 보다 상세하게는 물곰팡이를 배양하기 위한 SDB(Sabouraud dextrose broth) 배지에 복합생약제 열수추출물을 최종농도가 10배, 100배, 1,000배가 되도록 희석하고 첨가한 후, 15㎖ 용량의 테스트 튜브의 배지 바닥에 미리 배양해 둔 약 8㎜ 정도의 물곰팡이 한천조각을 접종하여 15℃에서 일주일 동안 배양하면서 물곰팡이의 발육도를 조사하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

하기 표 3을 참조하면, 물곰팡이에 대한 복합생약제 열수추출물의 항곰팡이 활성은 복합생약제 열수추출물 원액과 100배 희석액까지 균사의 발육이 저지되어 억제활성이 나타났다.

시험예 4: 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료를 넙치 경구투여한 후 그에 따른 면역증강 및 질병예방 효과 측정시험

넙치(126± 26g)를 2.5톤 원형수조 당 160마리씩 수용하여 원형수조를 설치하였고, 실험기간 동안 수온은 18∼24℃를 유지하였다. 실험구는 모두 4개 그룹으로 설정하였는데 이는 실시예 1에서 수득한 복합생약제 열수추출물의 농도에 따라서 결정하였다. 즉, 시판 배합사료(EP)에 복합생약제 열수추출물을 사료 무게에 대하여 최종 0.01중량%, 0.05중량% 및 0.1중량%의 농도가 되도록 흡습시킨 뒤 그늘에서 충분히 건조시켜 복합생약제 열수추출물이 첨가된 어류용 사료를 만들었다. 대조구로는 복합생약제 열수추출물을 흡습시키지 않은 EP사료만 공급하였으며, 복합생약제 열수추출물이 첨가된 어류용 사료는 하루에 한번 오전 중 넙치가 포만감을 느끼도록 여분의 사료가 바닥에 떨어지지 않게 눈으로 확인하면서 공급하였다. 투여기간은 모두 12주 동안이었으며 투여기간별(2주, 4주, 8주 및 12주)로 면역학적, 혈액학적 및 병리조직학적 실험을 하기의 방법에 따라 실시하였다. 이후 각기 다른 함량으로 복합생약제 열수추출물이 첨가된 어류용 사료를 투여한 후 기간에 따라 넙치의 체중, 간중지수, 헤모글로빈량(Hb), 헤마토크릿치(Ht) 및 평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC)를 측정하여 표 4에 나타내었고, 넙치의 혈액생화학적 생리변화를 측정하여 표 5에 나타내었다. 또한, 넙치의 혈장 및 조직의 라이소자임 활성을 측정하여 표 6 및 표 7에 나타내었다.

* 면역학적, 혈액학적 및 병리조직학적 실험 방법

투여기간별로 실험구와 대조구로부터 각 10마리씩 무작위로 선택하여 아래의 분석을 실시하였다. 넙치의 성장도와 관련이 있는 조사항목으로 어체중과 간중지수(Hepatosomatic index, HSI; 간중량/체중× 100)를 측정하였다. 면역증강 효과를 나타내는 라이소자임 활성은 혈액과 조직으로 나누어서 실시하였다. 혈중 라이소자임 활성은 Ellis(1990)의 방법을 약간 변형한 비탁 시험법(turbidimetric assay)으로 분석하였는데, 96 웰 플레이트에서 흡광도 600nm 파장에서 37℃, 0분, 5분, 10분 간격으로 Micrococcus lysodeikticus(Sigma)를 분해하는 양을 측정하였다. 라이소자임 1 유닛(Unit)은 흡광도 0.001/min을 감소시키는 시료의 양으로 정의였다. 간, 비장 및 신장의 조직별 라이소자임 활성은 조직(0.1g)을 PBS(pH 6.2)로 균질화한 후 원심 분리(12,000 rpm, 10min)하여 상층액을 흡광도 595nm에서 O.D 1.0으로 보정하여 상법에 따라서 측정하였다.

혈액학적 검사에는 적혈구와 관련된 항목의 분석으로 헤모글로빈량(Hb)과 헤마토크릿치(Ht)를 분석하여 평균적 혈구헤모글로빈농도(MCHC)를 계산하였다. 삼투압 측정기(WESCOR, USA, VAPRO VAPOR Pressure Osmometer 5520)로서 혈장 삼투압을 분석하였다. 그리고 혈장화학성분은 글루코즈(㎎/㎗), 총콜레스테롤(㎎/㎗), 요소질소(㎎/㎗), 젖산탈수소효소(U/L), 트란스아미나제인 GOT(U/L) 및 GPT(U/L), 총단백(g/㎗), 알칼리성포스파타제(U/L) 등 8개 항목을 측정하였다. 헤파린이 처리된 일회용 주사기로 실험어의 미부혈관에서 채혈하여 혈액을 원심(12,000rpm, 10분, 4℃)한 뒤 혈장을 얻고, Hb, Ht 및 혈장삼투압은 곧바로 분석하였으며, 나머지는 냉동보관(-80℃)하였다가 3일 이내에 동물용 생화학분석 장치인 FUJI DRI-CHEM 3000(FUJI PHOTO FILM Co., Japan)을 이용하여 혈장화학성분을 측정하였다.

병리조직학적 검사를 위하여 각 기간별로 간 조직을 채취하여 10% 중성완충포르말린에 고정하고 상법에 따라 조직절편을 만들고, Hematoxyline and Eosin (H&E) 염색을 하여 광학현미경하에서 조직학적 관찰을 실시하였다.

상기 표 4를 참조하면, 이들의 결과는 대조구와 비교하여 유의적인 차이가 없었다. 상기 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료를 넙치에 경구 투여한 결과, 넙치의 성장은 대조구와 비교하여 크게 차이가 없어 복합생약제 열수추출물이 성장에 나쁜 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다. 적혈구와 관련된 혈액지수(Ht, Hb, MCHC)는 대조구와 차이가 없어 복합생약제 열수추출물은 적혈구의 생성에 나쁜 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

상기 표 5를 참조하면, 영양 상태의 지표인 포도당(GLU)은 2주째에 모든 투여구가 대조구에 비해 높은 값을 나타내어 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료 투여에 따른 일반적인 초기 증상을 보였으며, 4주부터 복합생약제 열수추출물이 0.01 중량%로 첨가된 사료와 복합생약제 열수추출물이 0.05 중량%로 첨가된 사료를 투여한 투여구는 대조구와 비슷한 값으로 안정되었으나 복합생약제 열수추출물이 0.1 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 12주째에도 유의적인 높은 값을 나타내었다. 영양 상태의 지표인 총단백(TP)은 12주째에서는 모든 농도별 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료의 투여구가 대조구와 비교하여 유의적인 높은 값을 나타내었다. 간 기능의 지표인 총 콜레스테롤(TCHO), 트란스아미나제 GOT와 GPT는 4주 이상 투여시 복합생약제 열수추출물이 0.1 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 대조구와 비교하여 유의적인 높은 값을 나타내었다. 신장 기능의 지표인 젖산탈수소효소(LDH)는 4주 이상 투여할 때 복합생약제 열수추출물이 0.05 중량%로 첨가된 사료는 대조구와 비교하여 유의적인 높은 값을 나타내었다. 이로써 복합생약제 열수추출물이 0.01 중량%로 첨가된 사료의 투여구가 다른 농도의 사료에 비하여 8주 동안의 투여에서 대조구와 비교하여 매우 안정적이었으며 혈액생화학적 특성에 나쁜 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

상기 표 6 및 표 7을 참조하면, 복합생약제 열수추출물이 0.01 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 8주째에 혈장라이소자임 활성이 대조구에 비해 크게 유의적으로 증가하였다. 복합생약제 열수추출물이 0.01 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 2주와 4주째에 신장, 비장 및 간 조직 내의 라이소자임활성이 대조구에 비하여 증가하였다. 따라서 복합생약제 열수추출물이 0.01 중량%로 첨가된 사료의 투여구에 있어서 투여 2주부터 8주째까지 혈액과 조직에서 면역력이 증강되는 효과를 확인하였다. 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료의 투여구에 대해 장기 투여에 따른 조직내 독성 유무를 알아보고자 병리조직학적 관찰을 실시하였다. 그 결과 각기 농도별 복합생약제 추출물이 첨가된 사료를 2주, 4주, 8주 및 12주째 경구투여하여도 간, 비장, 신장 조직에서 특이적인 조직 변성이 전혀 관찰되지 않았다. 그러므로 병리조직학적 소견으로 볼 때 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료의 경구투여에 의해서 간독성으로 판단되는 조직 변성은 출현하지 않는 것으로 판단되었다(도 1, 도 2 및 도 3 참조).

시험예 5: 어병세균의 인위감염 시험

넙치(126± 26g)를 2.5톤 원형수조 당 160마리씩 수용하여 원형수조를 설치하였고, 실험기간 동안 수온은 18∼24℃를 유지하였다. 실험구는 모두 4개 그룹으로 설정하였는데 이는 실시예 1에서 수득한 복합생약제 열수추출물의 농도에 따라서 결정하였다. 즉, 시판 배합사료(EP)에 복합생약제 열수추출물을 사료 무게에 대하여 최종 0.01중량%, 0.05중량% 및 0.1중량%의 농도가 되도록 흡습시킨 뒤에 그늘에서 충분히 건조시켜 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료를 만들었다. 대조구는 복합생약제 열수추출물을 흡습시키지 않은 EP사료만 공급하였으며, 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료는 하루에 한번 오전 중 넙치가 포만감을 느끼도록 여분의 사료가 바닥에 떨어지지 않게 눈으로 확인하면서 공급하였다. 투여기간은 모두 12주 동안이었으며 4주, 8주, 12주 동안 투여가 종료된 시점에서 각 실험구별로 10마리씩에 대하여 주요 어병세균 E. tarda GY-01 strain(0.99×10⁶∼2.8×10⁶CFU/fish)과 S. iniae FT5228 strain(1.15×10⁶∼12.7×10⁶ CFU/fish)을 넙치 복강에 주사하여 대조구와의 4주, 8주, 12주 후의 생존율을 조사함으로서 상대생존율을 계산하여 표 8에 나타내었고, 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료를 4주 동안 경구투여한 후, 상대생존율과 반대되는 개념인 넙치의 누적폐사율을 도 4에 나타내었고, 복합생약제 열수추출물이 첨가된 사료를 8주 동안 경구투여한 후 넙치의 누적폐사율을 도 5에 나타내었다.

표 8을 참조하여 에드와드균(E. tarda GY-0)에 대한 상대생존율을 살펴보면, 복합생약제 열수추출물이 0.01 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 4주째 상대생존율(RPS)이 75%로 매우 높았으며 8주째에도 50%를 나타내어 에드와드병에 대해 질병예방 효과가 매우 높았음을 확인하였다. 복합생약제 열수추출물이 0.05 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 4주째 37.5%의 상대생존율을 보였으나, 8주째는 10%, 12주째는 0%로서 거의 질병예방 효과가 없었다. 복합생약제 열수추출물이 0.1 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 투여기간에 따른 질병예방 효과를 거의 확인할 수 없었다. 이로서 복합생약제 열수추출물의 농도를 0.1 중량%로 첨가된 사료는 질병예방 효과가 오히려 감소하였다.

연쇄구균(S. iniae FT5228)에 대한 상대생존율을 살펴보면, 복합생약제 열수추출물이 0.01 중량%로 첨가된 사료의 투여구에서 4주째와 8주째 20∼22%로 매우 낮게 나타났으며, 12주째는 33%를 나타내었다. 복합생약제 열수추출물이 0.05 중량%로 첨가된 사료의 투여구는 4주째 상대생존율이 20%, 0.1% 투여구는 8주째 33%에 불과하여, 에드와드균의 상대생존율과 비교하면 질병예방 효과는 나타나지 않았다. 이로부터 본 발명에 따른 복합생약제 열수추출물이 유효성분인 어류용 사료첨가제는 배합사료에 대해 0.01 중량%의 농도로 8주 동안 투여할 경우 만성적이고 고질적인 에드와드병의 질병예방에 탁월한 효능이 나타남을 알 수 있다.

Claims (9)

1. 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금을 포함하는 복합생약제의 열수추출물을 포함하며, 어류용 사료의 전체 중량에 대하여 0.01 중량%가 첨가되어 어류에게 4주부터 8주 동안 투여됨으로써 에드와드병에 대해 예방 효과를 가지는 어류용 사료첨가제.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 복합생약제의 열수추출물은 고삼, 귤피, 금은화, 동과자, 자소엽 및 황금의 6종류의 생약제를 증류수 5L와 함께 넣은 후, 90∼120℃에서 0.2 kgf/cm²의 압력으로 2시간 동안 가열하고 여과하여 수득되는 것을 특징으로 하는 어류용 사료첨가제.
   
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8. 제1항 또는 제2항의 어류용 사료첨가제가 첨가된 어류용 사료.
9. 삭제

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