KR102010724B1 - 천연추출물을 포함하는 점액포자충 감염 예방 또는 치료를 위한 수산 동물 양식용 약학적조성물. - Google Patents

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Abstract

본 발명은 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화의 열수추출물, 에탄올추출물, 탄소수 1 내지 4 중 어느 하나의 유기용매 추출물 또는 이들의 조합을 조성물로 포함하는 쿠도아 예방 및 치료용 수산 사료첨가 조성물을 제공함으로써, 쿠도아충 감염에 대한 쿠도아충 사멸 활성 효과를 나타내고 이를 이용하여 어종의 생존율 향상 및 어업 생산성 향상으로 인한 어업 안정성 증대에 널리 활용될 수 있다.

Description

천연추출물을 포함하는 점액포자충 감염 예방 또는 치료를 위한 수산 동물 양식용 약학적조성물.{Natural feed additive composition and its preventive and therapeutic effect on Myxozoa}
본 발명은 넙치 양식의 기생충성 감염 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 천연추출물을 포함하는 수산 동물 양식용 약학적조성물에 관한 것이다.
점액포자충은 점액포자동물 (Myxozoa)문 점액포자충강 다각목 (Multivalvulido) 쿠도아속(Genus Kudoa) 기생충으로 주로 해산물에 기생하며 넙치, 멸치, 정어리, 고등어, 연어, 송어 등 다양한 어종에 감염되는 매우 광범위한 숙주 특이성을 가지고 있다. 발생 해역 또한 북미, 오스트레일리아, 남아프리카, 일본, 영국 등으로 광범위하며 어류의 다양한 장기부위(아가미, 근육, 뇌, 장관 등)에 감염된다.
최근 점액포자충의 일종인 쿠도아는 어류를 감염시킨 후 어류 근육을 용해시켜 젤리화 현상을 일으킴으로써 어족 자원의 상품 가치를 떨어뜨려 경제적으로 피해를 일으키는 어병 기생충으로 알려져 있다.
쿠도아충 가운데 넙치에서는 4개의 극낭을 가진 Kudoa thyrsites가 근육 용해를 일으키는 것으로 2004년 일본 Yokoyama 등 연구자들에 의하여 최초로 보고되었으며, 최근 한국의 양식 넙치의 근육에서 신종 쿠도아충인 Kudoa septempunctata의 기생이 보고되었다(Matsukane et al., 2010).
쿠도아충의 인체 감염경로는 정확히 밝혀져 있지 않지만, 환형동물을 중간숙주로 넙치류가 쿠도아충에 감염되고, 감염된 넙치류를 사람이 날 것으로 섭취하여 감염되는 것으로 추정하고 있다.
최근 일본에서는 2003년부터 회를 섭취 한 이후 2-20시간 이내에 구토와 설사를 일으키는 것을 주 증상으로 하며 증상이 나타난 후 24시간 이내에 자연치유되는 것을 특징으로 하는 원인불명의 식중독이 해마다 100건 이상 발생하여, 2010년에는 158건이 발생되었다. 158건의 식중독 중 130건이 넙치 회를 섭취한 환자에서 발생되어, 이를 역학조사 한 결과, 넙치 회에서 K. septempunctata이 검출되었다.
또한 실험동물을 이용한 식중독 유발 실험 결과, 쿠도아충에 의해 설사와 구토의 식중독 증상이 유발되어, 새로운 식중독 원인체로 보고되었다. 넙치 1 g 당 106 이상의 포자가 확인되어, 이 수치를 양성 기준으로 정하였다(Kawai et al., 2012).
또한 알러지성 위장관증후군을 가진 환자에 대한 알러지 원인으로 알려지면서 일본 정부에서는 자국의 넙치는 물론 수입되는 넙치로부터 쿠도아충 기생 여부 검사를 강화하고 있다.
현재 쿠도아충 감염 예방 또는 치료는 외부기생충 구제제의 반복적인 약욕에 의존하고 있으나, 구제효과가 거의 없어 치료 효율이 극히 낮은 실정이어서, 보다 안전하고 효과적인 약물 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1096314호에서는 약물 중독의 지표로 사용되는 행동적 민감화(Behavioral sensitization) 반응인 보행성 활동량의 감소효과 뿐만 아니라, 뇌의 측핵과 선조체에서의 신경활성 지표인 c-Fos 발현을 급격히 감소시킴을 확인함으로써, 상기 조성물은 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있는 건지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료용 조성물을 개시하고 있다. 대한민국 공개특허 제10-2017-0090396호에서는 점액 합성 및 분비 촉진, 궤양병소 보호, 조직재생촉진, 위점막 혈류 증가, 내인성 프로스타글란딘 증가, 조직재생 촉진, 위점막 손상 억제, 산화 스트레스 억제, 염증 억제 등을 통해 위염 및 위궤양 예방 및 치료에 효과적인 호장근 추출물을 유효성분으로 포함하는 위염 및 위궤양 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있다. 대한민국 공개특허 제10-2004-0065376호에서는 인체 피부질환을 발병시키는 각종 세균, 곰팡이에 우수한 항균력을 나타내며, 광범위한 항균 스팩트럼을 나타내는 천연 항균제로 생활용품, 화장품등의 인체 위생용품 및 주거위생 항균 제품에 천연의 항균제 원료로 제공될 수 있는 계지 추출물을 함유하는 천연 항균제를을 개시하고 있다. 대한민국 등록특허 제10-1628407호에서는 양식장 근방에 전해식 오존 발생장치를 설치하여, 상기 전해식 오존 발생장치에 의해 원료수를 전해하여 전해 오존수를 생성하고, 생성한 전해 오존수를 전해 오존수 탱크 내에 저장하고, 상기 전해 오존수 탱크내에 양식어를 투입하여, 양식어에 기생하는 외부 기생충을 구제하는 것을 특징으로 하는 양식어에 기생하는 외부 기생충의 구제 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 발명들은 건지황, 호장근, 계지 관동화의 열수 및 에탄올추출물을 포함하는 천연추출물을 이용하여 어류양식에서 쿠도아충의 감염예방 및 치료에 효과가 있는 본 발명과는 그 구성 및 효과에서 차이를 보인다.
본 발명은 종래 어류의 수산양식에서 넙치를 포함하는 다양한 어종을 쉽게 감염시켜 양식어의 상품성을 떨어뜨리고 감염된 어류를 회의 형태로 날것으로 섭취한 소비자에게 복통을 일으켜 문제가 되고 있는 기생충인 점액포자충을 안전하게 감염 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있는 천연추출물을 이용한 수산 동물 양식용 약학적조성물을 제공하는 데에 목적이 있다.
상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 각각의 열수추출물, 에탄올추출물, 탄소수 1 내지 4 중 어느 하나의 유기용매 추출물 또는 이들의 조합을 조성물로 포함하는 점액포자충 예방 및 치료용 수산 동물용 약학적조성물을 제공한다.
또한 쿠도아 감염 예방 또는 치료용 수산 양식사료는 가) 건조된 건지황, 호장근, 계지, 가자, 관동화 각각 1 kg 또는 건조된 건지황, 호장근, 계지, 가자, 관동화 중에서 선택되는 복수개의 조합으로 이루어지는 1 kg에 정제수 20 L를 각각 혼합하여 열수추출 장비에 넣고 80-100℃에서 12시간 동안 추출한 후, 여과지로 여과하여 열수 추출액을 제조하는 단계; 나) 건조된 건지황, 호장근, 계지, 가자, 관동화 각각 1 kg 또는 건조된 건지황, 호장근, 계지, 가자, 관동화 중에서 선택되는 복수개의 조합으로 이루어지는 1 kg에 95 %의 에탄올 (ethanol) 20 L를 각각 혼합하여 실온에서 7일 동안 방치하여 추출한 후, 여과지로 여과하여 액상성분을 수득한 후, 이를 농축 건조하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계; 및 양식용 EP 사료와 상기 가) 또는 나) 단계의 추출물을 EP 사료 1kg : 10g의 비로 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 쿠도아 감염 예방 또는 치료용 수산 동물용 약학적조성물을 제공한다.
본 발명의 천연 약용식물 추출물을 포함하는 조성물은 점액포자충 감염에 대한 점액포자충 사멸 활성 효과를 나타내고 이를 이용하여 어종의 생존율 향상 및 어업 생산성 향상으로 인한 어업 안정성 증대에 널리 활용될 수 있다.
최근 국내 국내 활넙치 수출이 활발한 제주지역을 중심으로 한 제주 양식 넙치 및 자연산 어류의 점액포자충인 쿠도충 감염조사 연구에서 제주지역 넙치 양식장 4개소 7마리(4.9%)에서 감염이 확인 되었다. 2010년 수입한 양식넙치가 쿠도아충에 감염되 것을 확인하였고, 장관 감염증 환자 중 양식넙치가 감염원으로 추정되는 환례수는 다음과 같다.
년도 2010 2011 2012 2013 2014
발생건 113 473 407 244 382
발생 월별로는 11건 중 4건(36.4%)이 5월에 발생하였고 수온이 높을수록 쿠도아충 서식하기 좋은 환경임을 시사하여 준다.
최근 점액포자충인 쿠도아충 감염 사례 및 인체 감염 사례가 증가함에 따라 기생충 감염에 대한 예방 및 치료에 대한 관심이 높아지고 있다. 현재 사용하고 있는 포르말린, 담수, 황토 등의 외부기생충 구제제의 반복적인 약욕에 의존하고 있을 뿐이다.
그러나 이 또한 구제효과가 거의 없어 치료 효율이 극히 낮으며, 반복적인 약욕으로 양식어와 소비자의 안전에도 영향을 끼칠 소지가 많다. 따라서 안전하고 효과적인 약물 개발 및 사료첨가제 개발이 필요한 실정이다. 점액포자충인 쿠도아충에 대한 감염 치료제는 개발되어 있지 않고 일부 몇몇 연구자들에 의해 항콕시튬제(amprolium hydrochloride, toltrazuril)에 대한 치료효과를 검증하고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 천연소재 추출물을 이용하여 점액포자충인 쿠도차충 감염 질병을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 몇 가지 한약재 추출물이 점액포자충인 쿠도아충 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하고 특히 이들의 조합을 통하여 기생충성 질병인 쿠도아충 감염 질병에 상승적인 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
자세하게는, 본 발명의 천연소재는 건지황(Rehmannia glutinosa), 호장근(Polygonum cuspidatum), 계지(Cinnamomum cassia), 가자(Terminalia chebula), 및 관동화(Tussilago farfara) 와 같은 약용식물로서 이들의 추출물을 제조하여 점액포자충인 쿠도아충에 대한 구제효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 천연약용소재들에 대한 추출물 제조
지황(Rehmanniae glutinosa)은 현삼과(Scrophulariaceae)에 속하는 다년생 초본으로 채약한 후 모래에 저장한 신선한 지황을 생지황(生地黃), 그 뿌리를 건조한 것을 건지황(乾地黃, Rehmanniae Radix), 건지황을 9번 쪄서 말린 것을 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata)라 한다(박종희, 이정규. (상용) 약용식물도감. pp.385-388, 2000). 맛은 달고 쓰며, 독이 없으며, 성질이 차서 열을 내리고 혈액을 식히며 진액을 생성하여 갈증을 멈추게 하는 작용이 있고(서부일, 김봉현. 쉽게 읽는 본초학, 대구한의대학교출판부, pp.42-43, 2005), streptozotocin으로 유발된 고혈당 생쥐의 혈당저하(김정상. 생지황(Rhemanniae Radix)이 streptozotocin으로 유발된 고혈당 생쥐에 미치는 영향. J Korean Soc Food Sci Nutr. 33(7), pp.1133-1138, 2004), 간기능 개선(Kim YS et al., Effects of Rehmanniae Radix on the rat Liver Damaged with CCl4. Kor. J. Herbology.15(1), pp.45-47, 2000), 면역증강효과(Sasaki H et al., Immunosuppressive principles of Rehmanniaglutinosa var. Hueichongensis. Planta Med. 55(5), pp.458-462, 1989) 등의 효과가 있다는 연구보고가 있다.
호장근(Reynoutria elliptica)은 우리나라 전국에서 자생하는 마디풀과의 여러해살이풀로, 잎을 호장엽(虎杖葉), 뿌리를 호장근(虎杖根)이라 하며, 관상용·밀원·식용·약용으로 이용된다. 주로 종독과 통증을 다스리며, 간경에 효험이 있는 것으로 알려져 있으며, 간염(급성간염), 감기, 건위, 골수염, 동통, 변비, 부인병, 부종, 빈뇨증, 악창, 암(암 예방/항암/악성종양 예방), 야뇨증, 위장염, 종독, 치질, 타박상, 통경, 풍, 풍습, 해수, 황달에 효과가 있는 것으로 알려졌다.
계지는 녹나무과의 신나모뮴 카시아(Cinnamomum cassia)의 어린가지를 말하며 한방에서 알려진 효능으로는 풍한을 발산하고, 기와 피를 통하게 한다. 그리고 주로 땀이 나는 표허증에 쓰며 감기와 월경이 없고 배가 아픈 데 쓰인다.
가자는 인도, 미얀마, 말레이시아, 중국 사천성 등에 자생하는 여?A상 큰키나무로, 과즙에서는 미로발란(myrovalan)이라는 노란 색소가 추출되기도 하며, 가구용 목재로도 쓰인다. 한방에서는 기(氣)를 내리고 오래된 담과 기침을 삭히고 숨이 차는 것, 오래된 설사, 이질, 대하, 탈항에 효험이 있는 것으로 알려져 있으며, 소화를 돕고 입맛을 돋우며, 뱃속의 태아를 편안하게 하는 작용도 한다.
관동화는 특이한 향이 있으며 맛은 맵고 달며 성질은 따뜻하며 한의학에서는 진해, 거담, 가래 및 폐결핵, 폐농양에 사용하며 천식 상기도감염증에 사용한다. 약리작용은 호흡기 분비물 증가로 진해작용, 호흡흥분과 광조불안, 혈관수축작용, 소아의 급성기관지염, 기관지천식, 인후통에 효과가 있다는 보고가 있다.
본 발명에서 사용한 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화는 일반적으로 국내의 자연에서 쉽게 채집 또는 한약재에서 구입할 수 있는 것으로, 추출물을 효율적으로 얻기 위하여 절편 또는 세절 형태로 분쇄하여 사용하였다.
건조된 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 각각 1 Kg을 정제수(20 L)와 혼합하여 열수추출 장비에 넣고 80-100℃에서 12시간 동안 추출하고, 이를 여과지로 여과하여 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 각각의 열수 추출액을 제조하였다.
또한, 건조된 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 각각 1 Kg에 95 %의 에탄올 (ethanol) 20 L를 각각의 재료에 가하여 실온에서 7일 동안 방치하여 추출하고, 이를 여과지로 여과하여 액상성분을 수득한 후, 이를 농축 및 건조시켜서 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 에탄올 추출물 8.2g, 12.6g, 9.4g, 11.8g 및 8.7 g을 제조하였다.
본 실시예의 용매는 에탄올을 한정하지 않고 유기용매로서 탄소수 1~4를 갖는 용매로서 추출되어질 수 있다.
<실시예 2> 제조된 추출물에 대한 살쿠도아 활성 시험
건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 각각의 추출물을 DMSO에 용해한 후에, PBS로 희석하여 순수 분리한 쿠도아 포자액의 표면에 건지황, 호장근, 계지, 가자 및 관동화를 추출방법(열, 에탄올)에 따라 각각의 농도가 되도록 첨가하였다.
첨가 후에 25℃에서 6시간 및 24시간 배양하여 불활화된 쿠도아 포자를 계수하여 불활화 비율을 20% 이하는 -, 21~40%는 +, 41~60%는 ++, 61~80%는 +++, 81~100%는 ++++로 나타내었다.
상기 실시예 1에서 제조된 시료에 대하여 실시예 2에 대한 결과는 하기 표 2와 같이 활성결과를 보여주었다.
시료 농도 incubation time
6 h 12 h
건지황
열수추출물		 1000 νg/mL ++ +++
200 νg/mL + +++
100 νg/mL - +
건지황
에탄올추출물		 50 νg/mL +++ +++
20 νg/mL ++ +++
10 νg/mL + ++
호장근
열수추출물		 1000 νg/mL ++ +++
200 νg/mL + ++
100 νg/mL - +
호장근
에탄올추출물		 50 νg/mL +++ ++++
20 νg/mL +++ +++
10 νg/mL ++ ++
계지
열수추출물		 1000 νg/mL +++ +++
200 νg/mL ++ +++
100 νg/mL ++ +++
계지
에탄올추출물		 50 νg/mL +++ +++
20 νg/mL ++ +++
10 νg/mL ++ ++
가자
열수추출물		 1000 νg/mL ++ ++++
500 νg/mL ++ +++
100 νg/mL - ++
가자
에탄올추출물		 50 νg/mL ++++ ++++
10 νg/mL +++ +++
1 νg/mL + ++
관동화
열수추출물		 50 νg/mL ++++ ++++
10 νg/mL +++ +++
1 νg/mL + ++
관동화
에탄올추출물		 50 νg/mL ++++ ++++
5 νg/mL + ++++
1 νg/mL + +++
기호표시 20% 이하: -, 21~40% : +, 41~60% : ++, 61~80% : +++, 81~100% : ++++
상기 결과에서 보는 바와 같이, 각 추출물의 6시간 처리 시, 관동화 열수 및 에탄올추출물, 가자 에탄올추출물이 쿠도아충 불활화에 효과가 가장 뛰어났으며, 건지황, 호장근, 계지의 에탄올추출물 및 건지황, 가자, 호장근의 열수추출물 순으로 점액포자충인 쿠도아충 불활화 효과를 나타내었다. 12시간 처리 시에는 적정 농도에서 건지황, 호장근, 계지, 가자 및 관동화의 열수 및 에탄올 추출물이 대부분 고른 점액포자충인 쿠도아충 불활화 효과를 나타내었다.
또한, 건지황 10%, 호장근 30%, 계지 10%, 가자 30%, 관동화 20%의 비율로 복합 추출물을 상기와 동일한 방법으로 실험한 결과, 점액포자충인 쿠도아충 불활화 효과는 30% 이상 상승하였다.
본 발명에서 사용한 각각의 추출물, 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화열수 및 에탄올 추출물은 유효농도에서 점액포자충인 쿠도아충에 대한 구제효과를 나타내어 이들 추출물을 사용한 수산 양식 쿠도아 기생충에 대한 예방 및 치료 효능을 기대할 수 있음을 확인하였다. 즉, 건지황, 호장근, 계지, 가자 및 관동화의 열수 또는 에탄올 추출물을 단독 또는 이들의 조합을 유효성분으로 하여 양식어류의 사료첨가제를 제조함으로써 쿠도아충의 감염예방 또는 치료 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 3> 수산 동물용 약학적조성물의 투여를 위한 사료 제조 및 사육실험
본 발명에 사용된 수산 동물용 약학적조성물의 투여를 위한 실험사료의 조성 및 일반성분은 사육수 평균수온 17.0±1.0℃을 기준으로 단백질 함량 53~56 중량%, 지질 함량 10~16 중량%의 시판되는 EP 사료를 사용하였다. 사료크기는 9~11mm로 부상형으로 구매 후 상온에서 보관하며 실험하였다. 상기 시판 사료에 본 발명에서 실험 제조된 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 열수 및 에탄올 추출물과 건지황 10중량%, 호장근 30중량%, 계지 10중량%, 가자 30중량%, 관동화 20중량%의 비율의 복합 추출물을 1중량% 비율로 혼합하여 사료에 흡착시켜 쿠도아충이 감염된 양식넙치 체중에 비례하게 1일 1회 오전에 공급하였다.
본 발명의 실험 실시예에서는 상기 추출물을 PCR검사를 통해 쿠도아충이 87% 이상 감염된 평균체중 500g인 양식넙치를 대상으로 급이 실험을 실시하였다. 급이는 상기 감염된 양식넙치에 사료 1kg당 상기 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 각각의 열수 및 에탄올 추출물과 건지황 10중량%, 호장근 30중량%, 계지 10중량%, 가자 30중량%, 관동화 20중량%의 비율의 복합 추출물 각각을 10ml의 비율로 시판 구매한 EP사료에 흡착시켜 2주간 급이하였다. 급이 결과 쿠도아충의 감염율이 50%로 저하된 것을 확인할 수 있었다.
이로부터 본발명의 건지황, 호장근, 계지, 가자, 및 관동화 각각의 열수 및 에탄올 추출물과 건지황 10중량%, 호장근 30중량%, 계지 10중량%, 가자 30중량%, 관동화 20중량%의 비율의 복합 추출물을 유효성분으로 하여 양식어류에 사료첨가제로서 투여함으로써 쿠도아충의 감염예방 또는 치료 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 천연 약용식물 추출물을 포함하는 조성물은 쿠도아충 감염에 대한 쿠도아충 사멸 활성 효과를 나타내고 이를 이용하여 어종의 생존율 향상 및 어업 생산성 향상으로 인한 어업 안정성 증대에 널리 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (3)

  1. 건지황, 호장근, 계지, 관동화의 열수추출물 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어지는 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 쿠도아충 감염 예방 또는 치료를 위한 수산동물 양식용 약학적조성물.
  2. 건지황, 호장근, 계지, 관동화의 에탄올 추출물 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어지는 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 쿠도아충 감염 예방 또는 치료를 위한 수산동물 양식용 약학적조성물.
  3. 가) 건조된 건지황, 호장근, 계지, 관동화 각각 1 kg 또는 건조된 건지황, 호장근, 계지, 관동화 중에서 선택되는 복수개의 조합으로 이루어지는 1 kg에 정제수 20 L를 각각 혼합하여 열수추출 장비에 넣고 80-100℃에서 12시간 동안 추출한 후, 여과지로 여과하여 열수 추출액을 제조하는 단계
    나) 건조된 건지황, 호장근, 계지, 관동화 각각 1 kg 또는 건조된 건지황, 호장근, 계지, 관동화 중에서 선택되는 복수개의 조합으로 이루어지는 1 kg에 95%의 에탄올 (ethanol) 20L를 각각 혼합하여 실온에서 7일 동안 방치하여 추출한 후, 여과지로 여과하여 액상성분을 수득한 후, 이를 농축 건조하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계
    양식용 EP사료와 상기 가) 또는 나) 단계의 추출물을 EP사료 1kg : 10g의 비로 혼합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 수산동물의 쿠도아충 감염 예방 또는 치료 방법
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