KR101563185B1 - 해홍나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물 - Google Patents

해홍나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해홍나물(Suaeda maritima) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물은, 톡소플라즈마에 대한 항원충 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물은, 해홍나물 추출물의 농도를 4×104 cells/well의 헬라 세포에 톡소포자충 배양시 4×105 cells/well 기준으로 100~200 ㎍/㎖ 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

Description

해홍나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물{A COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACT OF SUAEDA MARITIMA SHOWING ANTI-TOXOPLASMA ACTIVITY}
본 발명은 해홍나물(Suaeda maritima) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물은, 톡소플라즈마에 대한 항원충 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물은, 해홍나물 추출물의 농도를 4×104 cells/well의 헬라 세포에 톡소포자충 배양시 4×105 cells/well 기준으로 100~200 ㎍/㎖ 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.
원충(protozoa)은 단세포의 진핵생물로, 원생생물과 동의어이다. 원래는 동물계에 속하는 단세포 생물로 분류되어 왔으나, 현재에는 그것과 다른 영역에 속하는 미생물로 취급되고 있다.
원충에는 편모나 위족을 갖는 편모원충, 포자를 형성하는 시기가 있는 포자원충, 섬모를 갖는 섬모원충 등 다양한 분류가 존재하는데, 이중 포자원충은 모두 다른 생물체 몸속에서 기생하는 기생충이다.
특히 세포내에서 기생하는 세포내 포자원충은 사람을 비롯한 각종 포유동물, 조류 등에 만연한 대표적인 기회감염성 원충이다. 세포내 포자원충에는 콕시디움(coccidium), 톡소플라즈마(toxoplasma) 및 말라리아 원충(Plasmodium)이 있으며, 이들 원충에 의한 질환은 전 세계적으로 유행하고 있다.
이중 톡소플라즈마(톡소포자충; Toxoplasma gondii)는 전 세계적으로 분포하는 인체 및 동물의 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis)의 원인 원충으로써 니콜 및 만시앙(Nicolle and Manceanx(1909))에 의하여 발견되었고 허치슨(Hutchison(1969)), 프랭클(Frenkel(1970))에 의하여 생활사가 밝혀졌으며, 우리나라에서는 1965년 돼지에게서 분리되었다.
톡소플라즈마는 전 세계적으로 10~30%의 감염률을 보이며, 우리나라에서도 전인구의 5~10%가 혈청학적 양성 반응을 나타내어 공중보건학적으로도 중요하다.
톡소플라즈마에 대한 일반적인 감염 경로는 감염된 고양이 분변 중에 존재하는 오시스트(oocyst)에 노출되는 것이다.
또한 톡소플라즈마는 가축 및 야생동물 조직에 감염될 수 있어 날고기 또는 조리가 덜된 육류를 먹었을 때 이 기생충에 감염될 수 있다. 미국 시장 내 판매 대상 돼지의 약 3%가 톡소플라즈마 포낭을 가지고 있으며, 최근 진단이 불가능한 식품 매개 질환의 86% 정도는 포낭 형성 기생충 의한 것으로 추정하고 있다.
또한 톡소플라즈마증(toxoplasmosis)의 경우 말기가 되면 치료법도 없으며 이에 따른 급성 질병과 합병증으로 인한 연간 손실액은 33~79억 달러로 추산하고 있다.
건강한 사람이 톡소플라즈마에 감염되었을 때에는 대부분은 무증상으로 지나거나 경미한 증상을 일으키는 것이 보통이다.
그러나 임산부가 감염되었을 경우 태반 감염에 의한 신생아의 기형 또는 유산이 일어날 수 있다.
또한 장기이식 환자, 암환자, 그리고 후천성 면역결핍증(AIDS) 환자 등이 감염되었을 때에는 뇌염질환을 일으켜 환자의 생존율을 감소시킴이 밝혀졌다(Dedicoat M et al., Cochrane Database Syst Rev.,19;3:CD005420, 2006 ).
이와 같이 톡소플라즈마는 기회감염성이기 때문에 인체 면역 기능이 정상일 때는 발병이 제한적이나 숙주의 면역기능이 저하된 경우 위험하며 주로 중추 신경계를 침범한다.
이러한 임상적인 중요성이 있음에도 지금까지 항톡소플라즈마 용도로 사용되는 약물인 설파제나 피리메타민(Pyrimethamine) 등은 수년간 지속적으로 투여함으로써 내성은 계속 증가하고 있고, 감염형 원충(bradyzoite) 단계의 톡소플라즈마에 대한 효과도 별로 없다.
그러므로 톡소플라즈마의 내성을 일으키지 않는 구조의 신종 항톡소플라즈마제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 또한 살충 효과뿐만 아니라 사람과 동물의 세포에 독성 및 내성 등의 부작용이 없는 안전한 약물의 개발이 요구되고 있다.
항생제는 효능이 우수하여도 약물의 오남용과 병원균의 빠른 변이 등으로 인해 시간이 지날수록 내성이 생기는데, 이러한 내성은 치료를 어렵게 하므로 큰 사회적 문제로 대두되고 있다.
특히 많은 치료용 의약품은 특정질환에 대한 치료효과는 있으나 부작용에 대한 우려도 크다. 또한 만성질환환자가 증가하면서 장기간 약물을 복용하는 경우도 증가하고 있다.
천연물은 오랜 기간 임상적으로 약효와 부작용이 검증된 약물이기 때문에 천연물을 이용한다면 충분히 이런 문제를 해결할 수 있으리라 예상된다.
천연물은 현재까지 알려지지 않은 새로운 성분이며, 개개의 작용이 다양한 단일성분의 혼합물이므로 복합물 상호 간의 약리 작용으로 내성 등의 부작용을 삼고 할 것이라고 사료된다.
따라서 천연물을 이용하여 감염질환 치료제를 개발한다면 화학적 치료 의약품의 부작용을 경감하는 보조제로서도 큰 역할을 할 수 있다.
한편, 톡소플라즈마증 치료용 조성물에 관련되어 공개된 특허문헌을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0017971호에 생강 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라증의 예방 및 치료용 조성물에 관하여 기재되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-0830202호에는 물푸레나무로부터 분리된 프락시딘을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 조성물에 관하여 기재되어 있다.
천연물을 이용하여 연구된 항톡소플라즈마에 관련한 또 다른 문헌으로 한약제 진피의 항톡소포자충 효과가 확인되었고(비특허 문헌 1), 개똥쑥에서 분리 확인된 화합물로부터 항톡소포자충 효과가 확인되었다(비특허 문헌 2).
한편, 해홍나물(Suaeda maritima)은 명아주과(Chenopodiaceae)에 속하는 1년생 초본으로서, 바닷가 근처 염분이 풍부한 토양에서 자라는 염생식물(halophyte)이다.
염생식물은 염분이 있는 땅에 서식하는 식물을 일컬어 염생식물이라 하는데, 이 염생식물은 주로 해변이나 해안사구, 내륙의 염지 등에서 서식하는 육상 고등식물을 가리키는 경우가 많다. 우리나라에서 생육하는 염생식물은 총 16과 40여종이 보고되고 있으며 , 특히 서남해안 갯벌의 상부 지역에 그 군락이 잘 발달되어 있다. 염생식물의 예로는 퉁퉁마디(함초, Salicornia herbacea), 나문재(Suaeda asparagoides), 칠면초(Suaeda japonica), 해홍나물(Suaeda maritima), 갯개미취(Aster tripolium) 등이 일반적으로 많이 알려져 있다.
염생식물은 현재 퉁퉁마디를 이용하여 DPPH 라디컬 소거활성, 약리효과, 항산화능에 관한 연구 그리고 해당화 꽃을 이용한 화학성분, 항산화 효과, 생리활성 연구 등 일부 식물에 대한 연구가 이루어졌을 뿐이다.
해홍나물은 일반 육상 식물보다 극한 환경에서 서식하므로 다른 생물종보다 생물학적으로 이용가능한 2차 대사 산물이 풍부할 것으로 생각되고 있으며, 오래전부터 고혈압과 간 해독, 비만증 치료와 신장 및 방광에 효능이 있는 식물로 알려져 왔다.
그러나 약학적 용도로는 뿌리 추출물에서 B. cereus, B. subtilis와 같은 그람 양성균, V. parahamolyticus , V. alginolyticus , V. cholerae와 같은 그람 음성균에 대한 항균활성이 발견되었을 뿐이며, 기타 생물학적 및 약학적 활성은 알려진 바 없다.
본 발명자들은 천연약품자원으부터 톡소플라즈마 억제효과를 갖는 물질을 확인하던 중 해홍나물 추출물이 톡소플라즈마 억제 효과가 뛰어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허공보 제10-2012-0017971호 (2012.02.29) 대한민국 등록특허공보 제10-0830202호 (2008.05.09)
(비특허 문헌 1) 김혜경, 강경화, 이동환, 김혜숙, 박현. 한약제 진피의 항 톡소포자충 효과 확인. 동의생리병리학회지. 2008. 22(1): 96~99. (비특허 문헌 2) 강경화, 김화경, 김혜숙, 카마타, 와타야, 박현. 개똥쑥에서 분리 확인된 endoperoxie ring 구조를 갖는 1,5-bis(4-methoxyphenyl)-6,7-dioxa-bicyclo[3,2,2]nonane의 항톡소포자충 효과. 동의생리병리학회지. 2007. 21(1): 82~85.
본 발명의 목적은, 세포 독성이 적고 안전한 천연물 유래 소재를 이용한 항톡소플라즈마 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 기존의 항톡소포자충 약물보다 높은 선택성을 갖는 해홍나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 톡소플라즈마의 오시스트를 감소시키고 정상적인 발육을 유지하도록 함으로써 톡소플라즈마증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 항톡소플라즈마 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 톡소포자충에 감염된 세포의 생존을 억제하는 효과가 있는 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 세포 독성이 적고 부작용이 없는 천연물 유래 소재를 이용한 항톡소플라즈마 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 기존의 항톡소포자충제보다 높은 선택성을 갖는 해홍나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 톡소포자충에 감염된 세포의 생존을 억제하는 효과가 있는 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은, 톡소플라즈마증 예방, 개선 또는 치료 조성물로 제공될 수 있으며, 각각의 조성물은 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명이 약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형체, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 처리제가 추가될 수 있음은 물론이다.
본 발명인 해홍나물 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항톡소플라즈마 조성물은 세포 독성이 없는 효능과, 기존의 항톡소포자충제보다 높은 선택성을 갖는 효능, 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 효능 및 톡소포자충에 감염된 세포의 생존을 억제하는 효능을 보유하고 있다.
도 1은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 생존도를 MTT분석으로 측정한 그래프이다.
도 2는 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 형태학적 변화를 나타낸 사진이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1. 해홍나물 추출물의 제조
1-1. 해홍나물을 추출한다.
해홍나물은 전북 군산 새만금 방조제 간척지 지역에서 채집하여 사용하였다. 해홍나물은 어떠한 전처리도 가하지 않은 것을 사용할 수 있으며, 건조, 절단 또는 분쇄 등의 전처리를 가한 것을 사용할 수도 있다. 건조, 절단 등의 전처리 방법 또한 여러 가지 방법 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 이물질을 제거한 후 바람이 통하는 음지에서 7일 이상 자연 건조한 후 세절한 해홍나물을 사용할 수 있다.
해홍나물의 추출 부위는 설계 조건에 따라 전초, 꽃, 줄기, 뿌리, 열매 등에서 다양하게 이용될 수 있으며, 각 부위의 세부 부위까지도 추출 부위의 범주에 포함될 수 있다. 바람직하게는 해홍나물의 줄기를 추출 부위로 이용할 수 있다.
추출 방법에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 환류추출법을 이용할 수 있다.
추출 용매도 다양하게 선택될 수 있다. 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 플로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올 및 이소프로판올 등이 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 추출 용매의 농도도 다양하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 70% 농도의 용매를 사용할 수 있다.
설계 조건에 따라 해홍나물과 용매의 중량비가 다르게 설정될 수 있으며, 바람직하게는 해홍나물 10 g에 70% 에탄올 300 ml를 가하여 추출될 수 있다.
추출 진행시의 시간 및 온도 역시 설계 조건에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 105℃에서 4시간 추출할 수 있다.
1-2. 해홍나물 추출물을 여과한다.
1-1의 과정에서 추출된 해홍나물 추출물을 여과한다.
여과 방법에는 침강법, 막 분리법, 원심분리법, 분별증류법, 분배법 등이 있으며, 이외에도 다양한 방법이 사용될 수 있다. 여과 진행시의 시간 및 온도는 설계 조건에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 거름종이를 이용하여 3번 거르는 과정을 수행할 수 있다.
1-3. 여과된 해홍나물 추출물을 농축한다.
1-2의 과정에서 여과된 해홍나물 추출물을 농축한다.
농축 방법에는 증발농축법, 냉동농축법, 막농축법, 건조농축법 등이 있으며, 다양한 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는 rotary evaporator(EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 감압농축법을 사용할 수 있다. 농축 진행시의 시간 및 온도는 설계 조건에 따라 달라질 수 있다.
설계 조건에 따라 상기 기재된 공정 외에도 여과, 농축, 추출 등의 공정이 반복 실행될 수 있으며, 각 공정 전후에 발효, 냉동 등의 기타 공정이 추가로 실행될 수도 있다. 바람직하게는 위 농축액을 Ultra-Low temperature freezer(Nihon freezer, Japan)에서 동결시키고, 동결건조기(Labconco, USA)로 동결 건조하여 추출물 얻었으며, 사용 때까지 -70℃에 보관하였다.
실험예 1. 톡소포자충 선택성(selectivity) 측정
여기에서, 실험예 1을 비록한 이하 모든 실험예는 실시예 1에 기재된 사항과 동일하게 제조된 조성물을 이용하여 수행되었음을 밝혀둔다.
1-1. 톡소포자충( Toxoplasma gondii )의 준비
본 실험에 사용된 톡소포자충(RH strain of Toxoplasma gondii, ATCC, No.50174)의 영양형(tachyzoite)은 ICR mouse 암컷 마우스에서 얻었다.
1) 1×105 cells/well개의 톡소포자충 영양형을 4주령 ICR mouse 암컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 5일 후 마우스를 경추탈골 사망시켰다.
2) 2% FBS(GIBCO, Lot No.1312606, USA)를 함유한 DMEM 배지(GIBCO, Lot No.1300045, USA) 10 ㎖을 복강에 주입하고 1분간 가볍게 마사지해주었다.
3) 다시 복수액을 10 ㎖짜리 주사기로 전부 뽑아내고 500RPM에서 5분 동안 원심분리 후, 침전물은 버리고 상층액은 새로운 50 ㎖ 튜브에 옮겨서 500RPM에서 5분간 원심분리하였다.
4) 상층액은 새로운 50 ㎖ 튜브에 옮겨서 2400RPM에서 10분간 원심분리하여 톡소포자충의 영양형을 얻었다.
5) 4)를 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 재부유시키고, 4℃에서 3 내지 4일간 보관하였다.
6) 이 중 일부는 또다시 새로운 ICR mouse 암컷 마우스에 주입하여 유지하였다.
1-2. 세포 배양
본 실험에 사용된 헬라 세포(Hela cell; 한국세포주은행, 1002)는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
이하 모든 실험예의 실험 준비 과정은 상기 1-1. 및 1-2.과정과 동일한 과정으로 실행되었음을 밝혀둔다.
1-3. 실험 방법
EZ-Cytox(Daeil Lab. Co., Korea)는 WST를 이용하여 살아있는 세포의 양을 측정하는 방법으로 세포 생존능(cell viability), 세포 증식(proliferation)과 세포독성검사(cytotoxicity assay)등에 사용할 수 있다. WST는 물에 잘 녹는 high sensitive water soluble tetrazolium salt로써 살아있는 세포의 탈수소효소(dehydrogenase)와 반응하여 오렌지 색의 수용성 formazan을 생성한다. WST와 반응하는 탈수소효소는 대사적으로 왕성한 활동을 하는 세포의 미토콘드리아 전자전달계에 존재하는 효소로써 살아있는 세포에만 유의하기 때문에, formazan이 검출되는 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포 수를 알 수 있다.
대조군으로는 대표적인 설파제인 설파디아진(sulfadiazine sodium salt, SIGMA, S6387, Germany)를 사용하였다. 설파디아진은 설폰아미드 항생물질로 세균 세포 안에서 폴산의 생산을 중지시킴으로써 감염을 일으키는 세균을 제거하고 요로감염증을 다루는 데 흔히 사용된다.
1) 헬라 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 96 웰 플레이트에 9×103/㎖ 되게 접종하고, 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양한다.
2) 18시간 후, 2%의 FBS가 함유된 배지로 교환 및 톡소포자충 영양형을 헬라 세포주의 5배 되게 처리하였다.
3) 그 후, 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 천연물을 농도별로 처리하였다. 이때 대조군으로 설파다이아진을 사용하였다.
4) 24시간 뒤 EZ-Cytox Kit를 실시하고 흡광광도계로 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 톡소소포충의 증식을 억제하는 농도(EC50: 50% 세포증식억제농도)를 산출하였고, 하기 [수학식 1]을 이용하여 선택성(selectivity)을 구하였다.
Figure 112013117943418-pat00001
1-4. 실험 결과
[표 1]은 해홍나물 추출물과 설파디아진을 헬라 세포에 농도별로 처리했을 때 헬라 세포에서와 톡소포자충에서의 EC50을 나타낸 표이다.
Hela 세포에서의 EC50 (㎍/㎖) 톡소포자충에서의 EC50 (㎍/㎖) 선택성(selectivity)
설파디아진 398.639 193.327 2.06
해홍나물 추출물 27083.26 4082.198 6.63
측정 결과, 해홍나물 추출물을 처리했을 때 헬라 세포에서의 EC50은 27083.26 ㎍/㎖, 톡소포자충에서의 EC50은 4082.198 ㎍/㎖로 [수학식 1]에 의해 선택성이 6.63이 계산되었으며, 설파디아진 처리시 헬라 세포에서의 EC50은 398.639 ㎍/㎖, 톡소포자충에서의 EC50은 193.327 ㎍/㎖로 선택성이 2.06으로 계산되었다.
이로써 본 발명의 해홍나물 추출물은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에서 항톡소포자충 약물인 설파디아진보다 약 3.22배 높은 선택성을 보여 톡소포자충의 증식을 효과적으로 억제하는 효과가 있다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예 2. 톡소포자충 감염 세포의 생존 억제능 측정
2-1. 실험 방법
MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT formazan의 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 상기 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.
즉 살아있는 세포의 수가 많을수록 상기 MTT formazan의 생성도 많아지므로 이러한 방법을 통해 세포의 성장을 쉽게 측정할 수 있다.
따라서 본 발명에서는 해홍나물 추출물이 톡소포자충 감염 세포의 생장을 억제하는지 여부를 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였다. 그 방법은 다음과 같다.
1) 96 웰 플레이트에 헬라 세포를 4×104 cells/well농도로 접종하고, 24시간 후 각각의 웰에 4×105 cells/well의 비율로 톡소포자충을 감염시켰다.
2) 24시간 후, 어떤 처리도 하지 않은 웰을 대조군으로 설정하고 나머지 웰에는 각각 해홍나물 추출물을 1, 10, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.
3) 24시간 후, MTT assay를 실시하고 ELISA 플레이트 리더기를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
4) 헬라 세포의 증식률(proliferation rate: PR)은 하기 [수학식 2]를 이용하여 구하였다.
Figure 112013117943418-pat00002
2-2. 실험 결과
도 1은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 생존도를 MTT분석으로 측정한 그래프이다.
세포의 증식 및 성장에 미치는 해홍나물 추출물의 효과를 확인하기 위하여 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 1~200 ㎍/㎖의 다양한 농도범위로 처리하고 24시간 동안 배양한 결과, 세포의 생존도는 용량과 시간에 의존적으로 현저하게 감소하였다.
해홍나물 추출물의 농도를 1 ㎍/㎖ 처리한 군과 10 ㎍/㎖ 처리한 군의 경우 대조군보다 세포의 생존도가 높았으나, 해홍나물 추출물을 100 ㎍/㎖ 처리한 군과 200 ㎍/㎖ 처리한 군에서는 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 생존도가 유의하게 감소함을 볼 수 있다.
이로써, 해홍나물 추출물이 농도 의존적으로 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 생존과 증식에 억제효과가 있다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예 3. 톡소포자충 감염 헬라 세포의 형태학적 변화
3-1. 실험 방법
해홍나물 추출물이 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 형태학적으로 어떤 효과가 있는지 관찰해 보기 위해, 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 처리하고 광학 현미경으로 관찰하였다.
1) 96 웰 플레이트에 헬라 세포를 4×104 cells/well 농도로 접종하고, 24시간 후 각각의 웰에 4×105 cells/well의 비율로 톡소포자충을 감염시켰다.
2) 24시간 후, 각각의 웰에 해홍나물 추출물을 1, 10, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.
3) 24시간 후, 광학 현미경을 이용하여 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다.
3-2. 실험 결과
도 2는 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 후의 세포 형태학적 변화를 나타낸 사진이다.
해홍나물 추출물이 세포의 형태학적 변화에도 효과가 있는지 관찰하기 위해, 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 해홍나물 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 뒤, 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.
편의상 각 실험군들을 A, B, C, D의 4개 군으로 임의분류하였다. (해홍나물 추출물 1 ㎍/㎖ 처리군: A, 해홍나물 추출물 10 ㎍/㎖ 처리군: B, 해홍나물 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군: C, 해홍나물 추출물 200 ㎍/㎖ 처리군: D)
관찰 결과, A군에서 D군으로 갈수록, 즉 해홍나물 추출물의 처리 농도가 높아질수록 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 세포 수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 특히 D군의 경우, 톡소포자충에 감염된 헬라 세포의 수가 현저하게 감소하였으며 세포의 모양이 정상 헬라 세포에 비해 일정하지 않고 불규칙해 형태학적 변화가 생긴 것을 관찰할 수 있다.
이로써, 해홍나물 추출물은 톡소포자충에 감염된 헬라 세포에 농도 의존적으로 항증식효과가 있으며, 세포의 형태학적 변화를 일으키는 효과가 있다는 결론을 도출할 수 있다.

Claims (6)

  1. 해홍나물 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 내 포자원충인 톡소플라즈마에 대한 항원충 효능을 갖는 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 항톡소플라즈마 약물인 설파디아진보다 3.22배 높은 선택성(selectivity)을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 톡소포자충을 세포주에 배양하였을시 항톡소포자충 작용을 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 해홍나물 추출물의 농도는 4×104 cells/well의 헬라 세포에 톡소포자충 4×105 cells/well 비율로 감염시를 기준으로, 100~200 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물에 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가한 톡소플라즈마 감염증 치료용 제제.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물에 식품학적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가한 톡소플라즈마 감염증 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
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