JP6441794B2 - 抗コクシジウム活性を有する植物部分および抽出物 - Google Patents
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Description
[0001]本出願は、どちらも本明細書に援用される、２０１２年６月２７日出願の米国特許出願第６１／６６４，７９５号および２０１３年１月２３日出願のインド出願第１７７／ＤＥＬ／２０１３号に優先権を請求する。
[0002]本発明は、一般的に、コクシジウム症の制御に関し、そしてより具体的には、家禽および他の動物において、コクシジウム症を制御するための植物部分、植物抽出物および化合物の適用に関する。
[0003]コクシジウム症は、家禽産業において主要な疾患であり、そして近年の調査によれば、世界的な影響は、年間、＄３０億ＵＳＤより大きいと概算される（ｗｏｒｌｄｐｏｕｌｔｒｙ．ｎｅｔ／Ｂｒｏｉｌｅｒｓ／Ｈｅａｌｔｈ／２００９／９／Ｉｎ−ｏｖｏ−ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ−ａｇａｉｎｓｔ−ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ−ＷＰ００６９４９Ｗ／、２０１３年６月１８日にアクセス）。コクシジウム症は、原生動物寄生虫、すなわち、アピコンプレックス門（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）、およびアイメリア科（Ｅｉｍｅｒｉｉｄａｅ）に属する、アイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）によって引き起こされる（Ｃｌａｒｅ， Ｒ．ＡおよびＤａｎｆｏｒｔｈ， Ｈ．Ｄ（１９８９）． ニワトリにおいて、遺伝子操作されたアイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）（アピコンプレックス門）抗原が誘発する免疫の主要組織複合体制御。 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ５７（３）：７０１−７０５）。該寄生虫は、腸細胞に侵入し、そして腸において壊死を引き起こし、壊死は、吸収不良、下痢、病的状態、体重増加の減少、劣った食物変換、そして重度の症例では死を導く（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒ．Ｂ（２００５）． 介入性コクシジウム症およびニワトリの壊死性腸炎：腸管完全性の維持による、合理的統合的疾患管理。 Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ３４（３）， １５９−１８０）。アイメリア属の７つの異なる種、Ｅ．アセルブリナ（Ｅ． ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ．ブルネッティ（Ｅ． ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、Ｅ．マキシマ（Ｅ． ｍａｘｉｍａ）、Ｅ．ミティス（Ｅ． ｍｉｔｉｓ）、Ｅ．ネカトリックス（Ｅ． ｎｅｃａｔｒｉｘ）、Ｅ．プラエコックス（Ｅ． ｐｒａｅｃｏｘ）、およびＥ．テネラ（Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａ）は、家禽においてコクシジウム症を引き起こすことが知られており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００５）、そしてこれらの種は非常に宿主特異的および部位特異的である。Ｅ．テネラは、家禽においてコクシジウム症を引き起こす主要な種の１つであり、そして感染部位は盲腸である（Ｋｈａｚａｎｄｉ， ＭおよびＴｉｖｅｙ， Ｄ（２０１０）． アイメリア・テネラをその好ましい腸部位および好ましくない腸部位に付着させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法の開発。 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， １２５（２）， １３７−１４０）。コクシジウム症は、現在、投薬によって制御されているが、アイメリア属の薬剤耐性株出現が増加しており、このため、別の制御戦略の開発が必要である。植物は、フェノール化合物が存在することから、抗寄生虫および抗コクシジウム活性を所持することが知られる（Ｔｉｐｕ， Ｍ．Ａ．， Ａｋｈｔａｒ， Ｍ．Ｓ．， Ａｎｊｕｍ， Ｍ．ＩおよびＲａｊａ， Ｍ．Ｌ（２００６）． 動物飼料としての薬草の新規局面。 Ｐａｋｉｓｔａｎ ｖｅｔ． Ｊ．， ２６（３）：１４４−１４８）ため、これらは家禽におけるコクシジウム症に対する生物活性分子の潜在的な供給源となりうる。
[0004]他の研究者らは、コクシジウム症を治療する際に植物部分または植物抽出物を使用しようと試みてきている。例えば、ＭｃＣａｎｎらは、コクシジウム生ワクチンをワクチン接種したブロイラー雛の成績に関するスイートチェスナット木タンニンの効果を試験した（Ｍ．Ｅ．Ｅ． ＭｃＣａｎｎ， Ｅ． Ｎｅｗｅｌｌ， Ｃ． ＰｒｅｓｔｏｎおよびＫ． Ｆｏｒｂｅｓ． ブロイラー食餌におけるマンナン−オリゴ糖および／またはタンニンの使用。 Ｉｎｔｌ． Ｊ． ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ． ５（９）：８７３−８７９， ２００６）。ＭｃＣａｎｎは、マンナン−オリゴ糖またはタンニンの補充が、個々にでもまたは組み合わせても、コクシジウム症の影響を減少させないことを報告した。
[0005]Ｗａｎｇらは、コクシジウム症に対するブドウ種子プロアントシアニジン抽出物の使用を解説する（Ｗａｎｇら ブロイラー鶏における、ブドウ種子プロアントシアニジン抽出物の影響：ニワトリ・コクシジウム症および抗酸化状態に対する効果。 Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ８７：２２７３−２２８０， ２００８）。Ｗａｎｇらは、加水分解可能タンニンよりも、縮重型タンニンであるプロアントシアニジンの抗炎症および抗酸化特性に、その活性が起因すると考えた。
[0006]Ｎａｉｄｏｏらは、抗酸化活性に基づいて選択した４つの植物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ研究を解説する（Ｎａｉｄｏｏら ブロイラー鶏において、コクシジウム症を減弱させる際の抗酸化活性を持つ植物抽出物の価値。 Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ． １５３：２１４−２１９； ２００８）。Ｎａｉｄｏｏらは、植物の１つ（ツルバギア・ビオラケア（Ｔｕｌｂａｇｈｉａ ｖｉｏｌａｃｅａ））が、ニワトリ排泄物におけるアイメリア属オーシスト数を減少させることを観察し、そして彼らは、この効果が抗酸化化合物Ｓ（メチルチオメチル）システインスルホキシドのためでありうると推測している。
[0007]ＭｃＤｏｕｇａｌｄらは、ブロイラー鶏において、コクシジウム症に対する耐性を増進させるためのマスカダイン（ｍｕｓｃａｄｉｎｅ）絞りかすの使用を記載する（ＭｃＤｏｕｇａｌｄら 食餌性マスカダイン絞りかすによる、コクシジウム症および壊死性腸炎に対する耐性の増進。 Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． ５２：６４６−６５１； ２００８）。マスカダイン絞りかすは、ワイン産生で用いられるブドウの副産物である。ＭｃＤｏｕｇａｌｄらは、絞りかすにおける何らかの特定の化合物の有効性には言及していない。提唱される抗コクシジウム活性は、ＷａｎｇらおよびＮａｉｄｏｏらによって提唱される活性とは有意に異なる。
Ｃｌａｒｅ， Ｒ．ＡおよびＤａｎｆｏｒｔｈ， Ｈ．Ｄ（１９８９）． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ５７ （３）：７０１−７０５
Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｒ．Ｂ（２００５）． Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ３４（３）， １５９−１８０）
Ｋｈａｚａｎｄｉ， ＭおよびＴｉｖｅｙ， Ｄ（２０１０）． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， １２５（２）， １３７−１４０
Ｔｉｐｕ， Ｍ．Ａ．， Ａｋｈｔａｒ， Ｍ．Ｓ．， Ａｎｊｕｍ， Ｍ．ＩおよびＲａｊａ， Ｍ．Ｌ（２００６）． Ｐａｋｉｓｔａｎ ｖｅｔ． Ｊ．， ２６（３）：１４４−１４８
Ｍ．Ｅ．Ｅ． ＭｃＣａｎｎ， Ｅ． Ｎｅｗｅｌｌ， Ｃ． ＰｒｅｓｔｏｎおよびＫ． Ｆｏｒｂｅｓ． Ｉｎｔｌ． Ｊ． ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ． ５（９）：８７３−８７９， ２００６
Ｗａｎｇら Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ８７：２２７３−２２８０， ２００８
Ｎａｉｄｏｏら Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ． １５３：２１４−２１９； ２００８
ＭｃＤｏｕｇａｌｄら Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． ５２：６４６−６５１； ２００８
[0008]本発明は、動物において、特に家禽において、コクシジウム症の制御に有効な植物部分および植物抽出物の同定および使用からなる。具体的には、クエルクス・インフェクトリア（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｉｎｆｅｃｔｏｒｉａ）、ヌルデ（Ｒｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）没食子およびミロバラン（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）果実の植物部分および天然抽出物は、家禽におけるコクシジウム症、そしてより具体的にはアイメリア属種によって引き起こされるコクシジウム症を制御することが見出されてきている。より具体的には、植物部分または抽出物は、没食子酸、ガロタンニンおよび加水分解可能タンニンからなる群より選択される化合物の有効量を含有する。
[0009]クエルクス・インフェクトリア、ヌルデの没食子およびミロバランの果実の植物部分および天然抽出物は、病変スコア、糞便物質グラムあたりのオーシストおよび死亡率の減少を生じる。植物部分／抽出物はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＴＴアッセイにおいて観察されるような、アイメリア属のスポロゾイトに対する直接阻害効果も有することが見出された。没食子酸、ガロタンニンおよび加水分解可能タンニンより選択される化合物もまた、病変スコア、糞便物質グラムあたりのオーシストおよび死亡率を減少させることが見出された。化合物はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＴＴアッセイにおいて観察されるような、アイメリア属のスポロゾイトに対する直接阻害効果を有することが見出された。
[00010]本発明はまた、クエルクス・インフェクトリア、ヌルデの没食子、ミロバラン果実、ならびに／あるいは没食子酸、ガロタンニンおよび加水分解可能タンニンなどの化合物の有効量を含有する植物部分または植物抽出物を含む組成物を投与することによって、家禽および他の動物において、コクシジウム症を制御する方法からもなる。
[00037]Ｑ．インフェクトリア没食子の未精製（ｃｒｕｄｅ）粉末（１００〜８００ミクロン粒子サイズ、Ｐｏｏｊａ Ｈｅｒｂｓ、インド・ムンバイより調達）が、１００ｇ／餌用量トンで、コクシジウム症を制御する際の、予備的なｉｎ ｖｉｖｏ評価によって、より高い投薬量でのさらなる評価を促す、有望な結果のいくつかの徴候が生じた。アイメリア・テネラのオーシストに曝露したブロイラー鳥で行った３５日間のｉｎ ｖｉｖｏ試験は、Ｑ．インフェクトリア没食子が病変スコアをゼロに、そして死亡率を０％に減少させたことを示し、これは陽性対照（０％）に匹敵し、一方、陰性対照は４のスコアおよび１７％の死亡率を示した。盲腸試料の組織病理学的分析によって、Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥は、寄生虫に感染した領域がより少なく、盲腸の単核球浸潤および出血がより低いことが示された。
[00038]本明細書において、一般的に、植物部分、抽出物または化合物は、未処置の感染対照に比較した際の、鳥の病変スコア、排泄物中に脱落するオーシスト（グラムあたりのオーシスト（ＯＰＧ））または死亡率の統計的に有意な減少を生じうる場合、有効であると称される。一般的に、食餌または水を通じて、あるいは他の経路を通じた同等の補充で、０．１〜５０ｐｐｍ、好ましくは２〜２０ｐｐｍ、そして最も好ましくは３〜１０ｐｐｍの投薬量を提供する配合物での没食子酸および没食子酸含有配合物の投与を記載する。記載する植物、植物部分および／または抽出物は、およそ最低０．１％の没食子酸を含有する。
[00039]ブロイラー鳥においてアイメリア属での混合感染を制御する際のＱ．インフェクトリア未精製粉末の有効性を評価した。結果によって、感染対照およびさらに陽性対照、サリノマイシンに比較した際の、Ｅ．テネラおよびＥ．アセルブリナに関する病変スコアの有意な減少があったことが示された。一方、Ｅ．マキシマの場合、感染対照およびサリノマイシンに比較した際、病変スコアの多くの減少が観察された。処置群グラムあたりのオーシストは、感染対照およびサリノマイシン群よりも有意に低かったが、死亡は、感染対照を含むいかなる処置群でも観察されなかった。これによって、アイメリア属の他の種によって引き起こされたコクシジウム症を制御する際のＱ．インフェクトリアの有効性もまた立証される。さらに、Ｑ．インフェクトリアの作用様式を決定するため、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ法を発展させて、スポロゾイトの生存度の測定値として、植物抽出物の抗スポロゾイト活性を評価した。アイメリア・テネラのスポロゾイトに対してＱ．インフェクトリア没食子を用いた研究によって、スポロゾイト対照に比較したスポロゾイトの生存度の有意な減少が示された。Ｑ．インフェクトリアの異なる投薬量で行った研究において、用量依存性有効性が観察され、そしてこの結果は、独立に数回実験を行うことによって検証された。したがって、Ｑ．インフェクトリアの直接抗スポロゾイト活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでコクシジウム症を制御する際の抽出物の有効性に寄与する作用様式の１つでありうる。
[00040]同様に、宿主細胞株において、アイメリア属を制御する際のＱ．インフェクトリアの作用様式を決定するため、宿主細胞およびアイメリア属寄生虫の同時培養に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを開発した。陽性対照および異なる試験産物を用いたアッセイにおいて、細胞および寄生虫を組み合わせる。リアルタイムＰＣＲを用いて、アイメリア属ＤＮＡを検出することによって、アイメリア属寄生虫の侵入および増殖を測定する。このため、特異的プライマーを選択し、そしてＰＣＲ条件を最適化した。陽性対照および潜在的な抗コクシジウム化合物を３つの異なる方式でｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに添加する：
[00041]産物をアイメリア属スポロゾイトと組み合わせて、そして宿主細胞に添加する。
[00041]産物をアイメリア属スポロゾイトと組み合わせて、そして宿主細胞に添加する。
[00042]産物を特定の時間、スポロゾイトに添加し、次いで取り除き、そしてその後、スポロゾイトを宿主細胞に添加する。
[00043]産物を特定の時間、宿主細胞に添加し、次いで取り除き、そしてその後、スポロゾイトを宿主細胞に添加する。
[00044]クエルクス・インフェクトリアの効果をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで評価した。
実施例１−盲腸コクシジウム症を制御する際のクエルクス・インフェクトリアの有効性
[00045]実験施設および研究設計。スクリーニング試験を、インド・ガミディプンディに位置する家禽飼育場施設で行った。該研究には、性選別していない（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｒｕｎ）商業的ハイブリッド・ブロイラー鶏、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（変種ベンコブ（Ｖｅｎｃｏｂｂ）４００）を用いた。１日齢の雄の雛を調達し、個々に体重測定し、羽をまとめ、そしてランダムに群に分けた。実験設計を表１に詳述する。
[00045]実験施設および研究設計。スクリーニング試験を、インド・ガミディプンディに位置する家禽飼育場施設で行った。該研究には、性選別していない（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｒｕｎ）商業的ハイブリッド・ブロイラー鶏、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（変種ベンコブ（Ｖｅｎｃｏｂｂ）４００）を用いた。１日齢の雄の雛を調達し、個々に体重測定し、羽をまとめ、そしてランダムに群に分けた。実験設計を表１に詳述する。
表１．研究設計
[00046]飼育場管理。試験中、適正飼育場管理規範にしたがった。研究に用いた全飼育場および装備を、雛の到着前に清浄にし、そして消毒した。コンクリートの床上に整理されたケージ中で鳥を飼育し、そしてケージの底にトレーを提供して、糞便試料の収集を容易にした。飼育場の温度および湿度を連続して監視した。
[00047]ワクチン接種スケジュール。鳥に、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）および伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）に関してワクチン接種した。
[00048]餌配合。トウモロコシ・ダイズに基づくすりつぶした食餌を配合した。餌成分を、Ｐｏｎｎｉ ｆｅｅｄｓ、インド・タミル・ナードゥより調達した。研究期間を通じて、すりつぶした餌を鳥に自由に与えた。鳥の生涯の期間に応じて、３つの餌配合物を調製した：プレスターター（第１〜１０日）、スターター（第１１〜２０日）、およびフィニッシャー餌（第２１〜４２日）。抗微生物剤および栄養補助剤は、餌配合物中に用いられなかった。
[00049]処置群の詳細。群および処置を表２に示す。処置した鳥に、第１日から、餌中に取り込まれた植物抽出物を与えた（表２）。Ｑ．インフェクトリア没食子の未精製粉末を、Ｐｏｏｊａ ｈｅｒｂｓ、インド・ムンバイより調達した。
表２．処置群および餌の詳細
＊コクシスタックは、１２％濃度のサリノマイシンを含有するＰｆｉｚｅｒの製品である。したがって、５００ｇ／餌トンの言及した用量でのコクシスタックの添加は、ブロイラーの推奨される予防的用量である、餌中の６０ｐｐｍレベルのサリノマイシンの送達を可能にするであろう。この実験中の用量は、推奨される濃度の倍であった。
[00050]コクシジウム症の誘導。Ｅ．テネラの胞子形成したオーシスト（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ株［Ｃｈａｐｍａｎ， Ｈ．Ｄ．およびＳｈｉｒｌｅｙ， Ｍ．Ｗ． ２００３． アイメリア・テネラのＨｏｕｇｈｔｏｎ株： ゲノム配列決定から選択した基準株の概説。 Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．， ３２：１１５−１２７］−増殖させたもの）を、１ｘ１０５オーシスト／鳥／日の用量で、経口強制投与を通じて、第１４日、第１５日および第１６日齢の各鳥に、経口投与した。接種日、接種前２時間および接種後２時間、給餌を停止した。
[00051]分析したパラメータ。分析のために選択したパラメータは、発病指標、すなわち排泄物出現、死亡率、コクシジウム症に関する盲腸の病変スコアリング、および排泄物グラムあたりのオーシスト（ＯＰＧ）であった。方法を以下に記載する。
[00052]排泄物の検査。鳥の排泄物を、感染１日後から第１０日まで、コンシステンシー、血液の存在、粘液、未消化の餌、および橙色に関して、毎日監視した。血液排出の重度に基づいて、排泄物のスコアリングを行った。
[00053]死亡率。鳥の死亡を毎日記録し、そして死因を確認するために剖検を行った。
[00054]盲腸の病変スコアリング。感染５日後および７日後、各群の２羽の鳥を頸椎脱臼によって屠殺し、そして腸を切開した。コクシジウム症病変に関して、鳥の盲腸をスコアリングした。盲腸における病変の重症度および血液の存在に基づいて、スコアリングを行った（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｊ．Ｋ．，およびＷ．Ｍ． Ｒｅｉｄ．（１９７０）． 抗コクシジウム薬剤：ニワトリを用いたバタリーおよび床飼い実験における病変スコアリング技術。 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ２８：３０−３６）。盲腸コクシジウム症に関するスコアは、０〜４のスケールであった。
[00055]排泄物のＯＰＧ。鳥の排泄物の３つ組試料を、ケージの下に維持したトレーからランダムに収集し、そしてグラムあたりのオーシストを評価した。
結果
[00056]発病指標。鳥の排泄物の観察によって、感染群における血液排出は、感染４日後までに始まり、そして重症度は第５日にピークとなることが示された。排泄物のスコアリングの結果を表３に提供する。感染７日後、排泄物は血液を含まず、正常であることが見出された。第５日の陽性対照（Ｃ３、表３）は、スコアが４である陰性対照（Ｃ２、表３）に比較して３のスコアであった。Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥は、２のより低いスコアを有し、そして陽性対照よりも優れていた。
[00056]発病指標。鳥の排泄物の観察によって、感染群における血液排出は、感染４日後までに始まり、そして重症度は第５日にピークとなることが示された。排泄物のスコアリングの結果を表３に提供する。感染７日後、排泄物は血液を含まず、正常であることが見出された。第５日の陽性対照（Ｃ３、表３）は、スコアが４である陰性対照（Ｃ２、表３）に比較して３のスコアであった。Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥は、２のより低いスコアを有し、そして陽性対照よりも優れていた。
表３．感染５日後の排泄物のスコアリング
＋は、血液損失の重症度および排泄物中の血液量を示す。
[00057]盲腸の病変スコアリング。感染５日後および７日後の盲腸の病変スコアリングによって、病変は第５日に重度であり、そして鳥は感染７日後に回復し始めることが示され、これは盲腸プラグの形成によって示された。これには、盲腸からのオーシストの除去を可能にする感染の通常のパターンが続いた。病変スコアの結果によって、陽性対照（サリノマイシン対照）は、説明の付かない理由から、陰性対照に比較した際、スコアにいかなる相違も示さないことが示された。Ｑ．インフェクトリアでの処置は、陰性対照に比較した際、病変スコアを減少させた（表４）。減少した病変スコアは、排泄物スコアの減少および死亡の非存在と相関した。
表４．感染５日後の盲腸の病変スコア
[00058]感染７日後の鳥の排泄物のＯＰＧ。感染７日後の鳥の排泄物のＯＰＧカウントを表５に示す。予期せぬことに、抗コクシジウム剤、サリノマイシンで処置した鳥（Ｃ３、表５）は、Ｃ２に比較した際、オーシスト減少のいかなる徴候も示さなかった（表５）。提示する値は、３つの複製物の平均である。
表５．感染７日後の排泄物グラムあたりのオーシスト
[00059]死亡率。死亡率は対照２（陰性感染対照）において１７％であった。他の群には死亡はなかった。陽性対照の病変スコアおよびＯＰＧデータは、陰性対照のものといかなる相違も示さなかった。
[00060]陽性対照は、この試験ではよく働かなかったが、Ｑ．インフェクトリアの植物抽出物で処置した鳥の病変スコアは、陰性感染対照のものより低く、これらがさらなる研究の候補でありうることを示す。しかし、これらは、ＯＰＧにいかなる減少も示さなかった。
実施例２−盲腸コクシジウム症を制御する際のクエルクス・インフェクトリアの有効性
[00061]アイメリア・テネラに曝露したブロイラー鳥において３５日間のｉｎ ｖｉｖｏ曝露試験を行った。処置群には、１）対照、非感染正常鳥；２）陰性対照、Ｅ．テネラに感染させ、そしていかなる抗コクシジウム化合物も含まない正常食餌を与えた鳥；３）陽性対照、感染させ、そして推奨される５００ｇ／トンの用量のコクシスタック（抗コクシジウム剤、サリノマイシン）を含有する食餌を与えた鳥；および４）５００ｇ／トン用量のＱ．インフェクトリア没食子を含有する食餌を投与した感染鳥を含む処置群が含まれた。陽性対照群およびクエルクス・インフェクトリア没食子の未精製粉末を補充した処置群には死亡はまったく観察されなかった。盲腸病変は、陰性対照鳥が平均スコア４で高感染しており、一方、陽性対照は０のスコアを有することを示した。クエルクス・インフェクトリアで処置した鳥は、陽性対照と同様の結果を示した（０）。Ｑ．インフェクトリアは、ＯＰＧカウントにおいて陽性対照と匹敵する減少を示した。盲腸試料の組織病理学的分析は、Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥では、アイメリア属によって影響を受ける領域がより少なく、出血がなく、そして粘膜に到る単核球浸潤は最小限であることを示した。
[00061]アイメリア・テネラに曝露したブロイラー鳥において３５日間のｉｎ ｖｉｖｏ曝露試験を行った。処置群には、１）対照、非感染正常鳥；２）陰性対照、Ｅ．テネラに感染させ、そしていかなる抗コクシジウム化合物も含まない正常食餌を与えた鳥；３）陽性対照、感染させ、そして推奨される５００ｇ／トンの用量のコクシスタック（抗コクシジウム剤、サリノマイシン）を含有する食餌を与えた鳥；および４）５００ｇ／トン用量のＱ．インフェクトリア没食子を含有する食餌を投与した感染鳥を含む処置群が含まれた。陽性対照群およびクエルクス・インフェクトリア没食子の未精製粉末を補充した処置群には死亡はまったく観察されなかった。盲腸病変は、陰性対照鳥が平均スコア４で高感染しており、一方、陽性対照は０のスコアを有することを示した。クエルクス・インフェクトリアで処置した鳥は、陽性対照と同様の結果を示した（０）。Ｑ．インフェクトリアは、ＯＰＧカウントにおいて陽性対照と匹敵する減少を示した。盲腸試料の組織病理学的分析は、Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥では、アイメリア属によって影響を受ける領域がより少なく、出血がなく、そして粘膜に到る単核球浸潤は最小限であることを示した。
[00062]第二のｉｎ ｖｉｖｏ実験は、以下の処置群を伴った。
表６．処置群の説明
＊コクシスタックは、１２％濃度でサリノマイシンを含有するＰｆｉｚｅｒの製品である。したがって、５００ｇ／餌トンの言及する用量でコクシスタックを添加すると、ブロイラーに関して推奨される予防用量である、餌中の６０ｐｐｍレベルで、サリノマイシンを送達することが可能である。
結果
[00063]感染５日後の盲腸病変。盲腸コクシジウム症に関する病変スコアリングを、先のようなスコアリング基準に基づいて、感染５日後に行った。スコアリングの結果によって、陽性対照が、陰性感染対照に比較した際、盲腸コクシジウム症の影響を完全に軽減したことが示された。Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥は、盲腸において病変をまったく示さず、そして陽性対照および非感染対照Ｃ１に匹敵した（表７、図１）。
[00063]感染５日後の盲腸病変。盲腸コクシジウム症に関する病変スコアリングを、先のようなスコアリング基準に基づいて、感染５日後に行った。スコアリングの結果によって、陽性対照が、陰性感染対照に比較した際、盲腸コクシジウム症の影響を完全に軽減したことが示された。Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥は、盲腸において病変をまったく示さず、そして陽性対照および非感染対照Ｃ１に匹敵した（表７、図１）。
表７．感染５日後の病変スコアリング。
異なる上付文字のカラムは、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
[00064]排泄物中のオーシスト・カウント。排泄物のＯＰＧを感染７日後に概算して、オーシストの脱落を評価した。研究結果によって、陽性対照、Ｑ．インフェクトリアは、感染した陰性対照に比較した際、排泄物中に有意により低いカウントのオーシストを有することが示された（ｐ＜０．０５）。Ｑ．インフェクトリア処置は、陽性対照と同等に有効であった（図２）。これは、病変スコアの結果と相関する。
[00065]死亡率：実験中、死亡を記録し、そしてデータを表８に提供する。予期されるように、非感染対照群（Ｃ１）および陽性対照群（Ｃ３）では死亡はなかった。Ｑ．インフェクトリア補充群は死亡を示さなかった。
表８． 試験期間中の死亡率
[00066]盲腸試料の組織病理学的分析。Ｑ．インフェクトリアは、病変スコア、ＯＰＧおよび死亡率などの試験したすべてのパラメータにおいて陽性の減少を示し、そしてデータは、陽性対照、サリノマイシンに匹敵した。したがって、非感染対照（Ｃ１）、陰性対照（Ｃ２）および陽性対照（Ｃ３）に比較して、この群由来の鳥の盲腸試料の組織病理学的分析を行った。盲腸における病変の重症度および分布は、表９に提供する等級付けに基づいた。
表９． 異なる群の盲腸における、病変の重症度および分布
表１０． 鳥の盲腸組織の組織病理学的所見
[00067]組織病理学的結果は、Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥では、Ｅ．テネラに感染した盲腸領域がより少なく、そして単核球浸潤が、穏やかな浸潤を示すスコア１で、粘膜層のみに限定されていることを示した（図３）。粘膜下層および筋層には侵入はなかった（表１０）。陰性対照において、単核球浸潤は、粘膜、粘膜下層、およびさらに筋層においても観察された。陰性対照のものに比較した際、Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥の盲腸においては出血はなかった（２）。これは、Ｑ．インフェクトリアで処置した鳥の盲腸が、陽性対照よりもより感染していなかったことを示す。
[00068]植物抽出物のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングによって、クエルクス・インフェクトリアがＥ．テネラによって引き起こされるブロイラー鳥における盲腸コクシジウム症を調節する際の強力な候補であることが明らかになった。抽出物の有効性は、病変スコア、ＯＰＧおよび死亡率減少に関して、陽性対照のものと同等であることが見出された。
実施例３−コクシジウム症の混合感染を制御する際のクエルクス・インフェクトリアの水抽出物の有効性
[00069]ブロイラー鳥におけるコクシジウム症の混合感染を制御する際のＱ．インフェクトリア未精製粉末の有効性を評価した。鳥を、Ｅ．テネラ、Ｅ．アセルブリナおよびＥ．マキシマ種のオーシスト混合培養物の野外株に曝露する、３５日間のｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。オーシストの混合培養物は、タミル・ナードゥ獣医学研究所、寄生虫学部門、インド・ナーマッカルによって提供された。オーシスト培養物は、臨床的コクシジウム症感染を伴う鳥の糞便から単離されたＥ．テネラ、Ｅ．アセルブリナおよびＥ．マキシマの混合物であった。得られたオーシストの病原性をブロイラー鳥で評価し、そしてオーシストの投与量は、試験したすべてのオーシスト、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナに関して、最終的に、病変スコア３およびそれより高いスコアを生じる濃度に基づいて、５ｘ１０５とした。
[00069]ブロイラー鳥におけるコクシジウム症の混合感染を制御する際のＱ．インフェクトリア未精製粉末の有効性を評価した。鳥を、Ｅ．テネラ、Ｅ．アセルブリナおよびＥ．マキシマ種のオーシスト混合培養物の野外株に曝露する、３５日間のｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。オーシストの混合培養物は、タミル・ナードゥ獣医学研究所、寄生虫学部門、インド・ナーマッカルによって提供された。オーシスト培養物は、臨床的コクシジウム症感染を伴う鳥の糞便から単離されたＥ．テネラ、Ｅ．アセルブリナおよびＥ．マキシマの混合物であった。得られたオーシストの病原性をブロイラー鳥で評価し、そしてオーシストの投与量は、試験したすべてのオーシスト、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナに関して、最終的に、病変スコア３およびそれより高いスコアを生じる濃度に基づいて、５ｘ１０５とした。
ａ． インド・ガミディプンディに位置するＫｅｍｉｎの社内Ｒ＆Ｄ家禽飼育場施設で、スクリーニング試験を行った。研究には、性選別していない商業的ハイブリッド・ブロイラー鶏、ニワトリ（変種ベンコブ４００）を用いた。１日齢の雄の雛を調達し、個々に体重測定し、羽をまとめ、そしてランダムに群に分けた。実験設計を表１１に詳述する。実施例１に言及するように、第三のｉｎ ｖｉｖｏ試験中、適正飼育場管理規範およびワクチン接種スケジュールにしたがった。
表１１． 研究設計
[00070]鳥に、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）および伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）に関してワクチン接種した。該研究のため、トウモロコシ・ダイズに基づくすりつぶした食餌を用いた。第１日から、給餌中に取り込まれたＱ．インフェクトリア没食子の抽出物を鳥に与えた。処置群を表１２に提供する。
表１２．試験のための処置群の詳細
[00071]蒸留水中、１：２の比で未精製粉末（１００〜８００ミクロン粒子サイズ）を混合し、次いで８０〜９０℃で１時間半、攪拌しながら抽出することによって、Ｑ．インフェクトリア没食子の抽出物を調製した。抽出物を濾過して、そして再び、残渣を同様の方式で水中で抽出した。これをさらに約２回反復し、そして総液体抽出物を凍結乾燥した。
[00072]結果は、感染対照、およびさらに陽性対照、サリノマイシンと比較した際、Ｅ．テネラおよびＥ．アセルブリナに関する病変スコアの有意な減少があったことを示した。一方、Ｅ．マキシマの場合、感染対照およびサリノマイシンに比較した際、病変スコアにおける数値の減少が観察された（図４）。処置群のグラムあたりのオーシストは、感染対照およびサリノマイシン群よりも有意に低かった（図５）が、感染対照を含めて、処置群のいずれにおいても、死亡は観察されなかった。これはまた、アイメリア属の他の種によって引き起こされるコクシジウム症を制御する際のＱ．インフェクトリアの有効性を証明する。
実施例４−ＭＴＴアッセイによるＱ．インフェクトリアのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗スポロゾイト活性
[00073]さらに、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ法を発展させて、スポロゾイトの生存度の測定値として、植物抽出物の抗スポロゾイト活性を評価した。最適化された方法には、スポロゾイトの調製、滅菌および精製、その後、必要な濃度の植物抽出物とスポロゾイト懸濁物（最小限１０５細胞/ｍｌ）のインキュベーションが含まれた。未精製粉末を既知の体積の蒸留水と混合して、特定のｐｐｍを達成することによって植物試料を調製し、２分間ボルテックスし、そして０．２μシリンジフィルターを通して濾過した。植物抽出物と２４時間インキュベーションした後、スポロゾイトを完全に洗浄し、そして次いで、ＭＴＴアッセイを実行した。ＭＴＴ−ＰＭＳ溶液（各０．２ミリモル）を４１℃で２時間、スポロゾイト懸濁物とインキュベーションした（１：１０の比）。インキュベーション後、内容物を８００ｇで５分間遠心分離し、そして上清を注意深く取り除く。紫の色素、ホルマザンを２００μｌ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして６３０ｎｍの参照波長に対して、５３０ｎｍで、吸光度を測定する。
[00073]さらに、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ法を発展させて、スポロゾイトの生存度の測定値として、植物抽出物の抗スポロゾイト活性を評価した。最適化された方法には、スポロゾイトの調製、滅菌および精製、その後、必要な濃度の植物抽出物とスポロゾイト懸濁物（最小限１０５細胞/ｍｌ）のインキュベーションが含まれた。未精製粉末を既知の体積の蒸留水と混合して、特定のｐｐｍを達成することによって植物試料を調製し、２分間ボルテックスし、そして０．２μシリンジフィルターを通して濾過した。植物抽出物と２４時間インキュベーションした後、スポロゾイトを完全に洗浄し、そして次いで、ＭＴＴアッセイを実行した。ＭＴＴ−ＰＭＳ溶液（各０．２ミリモル）を４１℃で２時間、スポロゾイト懸濁物とインキュベーションした（１：１０の比）。インキュベーション後、内容物を８００ｇで５分間遠心分離し、そして上清を注意深く取り除く。紫の色素、ホルマザンを２００μｌ ＤＭＳＯ中に溶解し、そして６３０ｎｍの参照波長に対して、５３０ｎｍで、吸光度を測定する。
[00074]陽性対照としてのコクシジオスタック（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｃ）（サリノマイシン）とともに、多様な投薬量のＱ．インフェクトリアの評価のため、ＭＴＴアッセイを行った（図６）。対照と比較した際、Ｑ．インフェクトリア処置試料においては、スポロゾイトの生存度に用量依存性の減少があった。
実施例５−宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対するＱ．インフェクトリアのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
[00075]宿主細胞のアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、Ｑ．インフェクトリアのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[00075]宿主細胞のアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、Ｑ．インフェクトリアのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[00076]胞子形成したオーシストから、ガラス・ビーズ粉砕および酵素的脱嚢後、スポロゾイトを得た。宿主細胞として、マディン−ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を選択した。スポロゾイト、ならびに５０および１００ｐｐｍのクエルクス・インフェクトリアをＭＤＢＫ宿主細胞に４時間添加した。その後、培地を取り除き、細胞を洗浄し、そして新鮮な培地を添加した。４時間後（Ｔ４）、２４時間後（Ｔ２４）、４８時間後（Ｔ４８）および７２時間後（Ｔ７２）、培地およびＭＤＢＫ細胞を収集し、そして−２０℃で保存した。
[00077]陰性対照（ｎｅｇ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、細胞培地中でインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。陽性対照（ｐｏｓ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、５μｇ／ｍｌのサリノマイシン溶液とインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。
[00078]異なる収集時点で、感染したＭＤＢＫ細胞からＤＮＡを抽出した。異なる時点および異なる処置に関して、試料に対して、アイメリア属ＤＮＡを検出するリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ結果を図７に提示する。
リアルタイムＰＣＲ分析
[00079]１つの処置内で、Ｔ４に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ４に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[00080]これらの結果を図８に提示する。
[00079]１つの処置内で、Ｔ４に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ４に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[00080]これらの結果を図８に提示する。
[00081]陰性対照は、４時間での開始時点に対して、７２時間で、アイメリア属ＤＮＡにおける１５倍の増加があるため、明らかなアイメリア属増殖を示す。陽性対照は、増殖を完全に阻害可能であった。また、Ｑ．インフェクトリア処置に関して、用量依存方式で、４時間での開始時点に対して、明らかな増殖阻害が観察された。
実施例６−宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対するＱ．インフェクトリアのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
[00082]宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、Ｑ．インフェクトリアのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[00082]宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、Ｑ．インフェクトリアのｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[00083]胞子形成したオーシストから、ガラス・ビーズ粉砕および酵素的脱嚢後、スポロゾイトを得た。宿主細胞として、マディン−ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を選択した。スポロゾイトを、５０、１００および２５０ｐｐｍのクエルクス・インフェクトリアで３時間、前処理した。その後、スポロゾイト懸濁物を洗浄し、そしてＭＤＢＫ細胞培養上に２０時間置いた。インキュベーション後、培地を取り除き、細胞を洗浄し、そして新鮮な培地を添加した。２０時間後、７２時間後、および９６時間後、培地およびＭＤＢＫ細胞を収集し、そして−２０℃で保存した。
[00084]陰性対照（ｎｅｇ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、細胞培地中でインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。陽性対照（ｐｏｓ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、５μｇ／ｍｌのサリノマイシン溶液とインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。
[00085]異なる収集時点で、ＭＤＢＫ細胞からＤＮＡを抽出した。異なる時点および異なる処置に関して、試料に対して、アイメリア・テネラＤＮＡを検出するリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ結果を図９に提示する。
リアルタイムＰＣＲ分析
[00086]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[00087]Ｑ．インフェクトリアに関するこれらの結果を図１０に提示する。
[00086]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[00087]Ｑ．インフェクトリアに関するこれらの結果を図１０に提示する。
[00088]陰性対照は、２０時間での開始時点に対して、９６時間で、アイメリア属ＤＮＡにおける２０倍の増加があるため、明らかなアイメリア属増殖を示す。陽性対照は、増殖を完全に阻害可能であった。また、Ｑ．インフェクトリアの異なる投薬量はすべて、アイメリア属増殖を阻害した。５０ｐｐｍのＱ．インフェクトリアに関しては、わずかにより低い効果が見られた。しかし、これは、陰性対照における増加と比較して、無視できるものである。
実施例７−Ｑ．インフェクトリアの活性成分（単数または複数）の同定
[00089]これに加えて、本発明者らは、未精製抽出物が抗スポロゾイト活性を所持し、そしてこれは、コクシジウム症を制御可能である作用様式の１つでありうることを同定したため、バイオアッセイとして修飾ＭＴＴ還元アッセイを用いて、Ｑ．インフェクトリア没食子のバイオアッセイ誘導分画アッセイ（ＢＧＦＡ）を行った。カラムクロマトグラフィによって、異なる溶媒を用いて、Ｑ．インフェクトリア没食子未精製粉末を分画した。抗スポロゾイト活性に関して、各分画由来の試料を評価した。Ｑ．インフェクトリアのメタノールおよび水分画は、他の分画と比較した際、スポロゾイトの生存度のより優れた減少を示し、そしてこれは、サリノマイシン対照に匹敵した（図１１）。
[00089]これに加えて、本発明者らは、未精製抽出物が抗スポロゾイト活性を所持し、そしてこれは、コクシジウム症を制御可能である作用様式の１つでありうることを同定したため、バイオアッセイとして修飾ＭＴＴ還元アッセイを用いて、Ｑ．インフェクトリア没食子のバイオアッセイ誘導分画アッセイ（ＢＧＦＡ）を行った。カラムクロマトグラフィによって、異なる溶媒を用いて、Ｑ．インフェクトリア没食子未精製粉末を分画した。抗スポロゾイト活性に関して、各分画由来の試料を評価した。Ｑ．インフェクトリアのメタノールおよび水分画は、他の分画と比較した際、スポロゾイトの生存度のより優れた減少を示し、そしてこれは、サリノマイシン対照に匹敵した（図１１）。
[00090]高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって、活性分画の植物化学分析を行って、抗スポロゾイト活性に関与する活性成分（単数または複数）を同定した。メタノールおよび水分画の両方のＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、４つの主要なピークが観察され、１つのピークは、没食子酸標準の保持時間に対応した（図１２）。Ｑ．インフェクトリア没食子は、６０〜７０％の加水分解可能タンニンを所持することが知られ、これは加水分解されて、存在する約７％の遊離没食子酸に加えて、没食子酸を放出しうる。
[00091]これらの４つの化合物を、半分取ＨＰＬＣによって分離し、そして同等の濃度の未精製粉末に比較して、抗スポロゾイト活性を評価した。化合物の抗スポロゾイト活性は、ピーク１の化合物が、最適な抗スポロゾイト活性を有することを示した。他の化合物は、スポロゾイトに対して最小限の活性を示した。しかし、未精製粉末は、ピーク１よりも優れた活性を示し、抽出物由来の化合物の相乗的活性があることが示された（図１３）。
[00092]ＨＰＬＣクロマトグラムの異なるピークのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって、ピーク１が没食子酸であり（図１４）、そして他のピークは高分子量化合物であり、加水分解可能タンニンの分解産物でありうることが確認された。これらの化合物は、さらに分解されて没食子酸を放出しうると仮定された。
[00093]さらに、没食子酸％および抗スポロゾイト活性の間の相関に到達するため、Ｑ．インフェクトリアを水中で５分間、２時間および１２時間抽出し、そしてその抗スポロゾイト活性を評価した。該研究によって、没食子酸濃度および抗スポロゾイト活性の間に、明確な相関がある（相関係数＝−０．９８２２２６）ことが示された（図１５）。これらの結果によって、没食子酸がＱ．インフェクトリアの抗スポロゾイト活性に関与する活性成分であることが示される。
実施例８−没食子酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ防御効果
[00094]アイメリア・テネラ・スポロゾイトに曝露した宿主細胞に対する、没食子酸一水和物のｉｎ ｖｉｔｒｏ防御効果を評価する実験を行った。
[00094]アイメリア・テネラ・スポロゾイトに曝露した宿主細胞に対する、没食子酸一水和物のｉｎ ｖｉｔｒｏ防御効果を評価する実験を行った。
[00095]胞子形成したオーシストから、ガラス・ビーズ粉砕および酵素的脱嚢後、スポロゾイトを得た。宿主細胞として、マディン−ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を選択した。ＭＤＢＫ細胞を、１０ｐｐｍの没食子酸と、７時間インキュベーションした。その後、培地を取り除き、そしてスポロゾイト懸濁物をＭＤＢＫ細胞に２０時間添加した。インキュベーション後、培地を取り除き、細胞を洗浄し、そして新鮮な培地を添加した。２０時間後、７２時間後、および９６時間後、培地およびＭＤＢＫ細胞を収集し、そして−２０℃で保存した。
[00096]陰性対照（ｎｅｇ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、細胞培地中でインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。陽性対照（ｐｏｓ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、５μｇ／ｍｌのサリノマイシン溶液とインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。
[00097]異なる収集時点で、ＭＤＢＫ細胞からＤＮＡを抽出した。異なる時点および異なる処置に関して、試料に対して、アイメリア属ＤＮＡを検出するリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ結果を図１６に提示する。
リアルタイムＰＣＲ分析
[00098]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[00099]これらの結果を図１７に提示する。
[00098]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[00099]これらの結果を図１７に提示する。
[000100]陰性対照は、２０時間の開始時点に対して、９６時間で、アイメリア属ＤＮＡにおける６０倍の増加があるため、明らかなアイメリア属増殖を示す。陽性対照は、増殖をほぼ完全に阻害可能であった。また、１０ｐｐｍ没食子酸処置に関しても、用量依存方式で、増殖の明らかな阻害が観察された。これによって、没食子酸は、１０ｐｐｍの低用量で、アイメリア属増殖に対して、ある程度まで宿主細胞を防御可能であることを示す。
実施例９−宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する没食子酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
[00101]宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、没食子酸一水和物のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[00101]宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、没食子酸一水和物のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[00102]胞子形成したオーシストから、ガラス・ビーズ粉砕および酵素的脱嚢後、スポロゾイトを得た。宿主細胞として、マディン−ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を選択した。スポロゾイトを、１０、２５および５０ｐｐｍの没食子酸一水和物で３時間、前処理した。その後、スポロゾイト懸濁物を洗浄し、そしてＭＤＢＫ細胞培養上に２０時間置いた。インキュベーション後、培地を取り除き、細胞を洗浄し、そして新鮮な培地を添加した。２０時間後、７２時間後、および９６時間後、培地およびＭＤＢＫ細胞を収集し、そして−２０℃で保存した。
[000103]陰性対照（ｎｅｇ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、細胞培地中でインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。陽性対照（ｐｏｓ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、５μｇ／ｍｌのサリノマイシン溶液とインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。
[000104]異なる収集時点で、ＭＤＢＫ細胞からＤＮＡを抽出した。異なる時点および異なる処置に関して、試料に対して、アイメリア属ＤＮＡを検出するリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ結果を図１８に提示する。
リアルタイムＰＣＲ分析
[000105]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[000106]これらの結果を図１９に提示する。
[000105]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[000106]これらの結果を図１９に提示する。
[000107]陰性対照は、２０時間での開始時点に対して、９６時間で、アイメリア属ＤＮＡにおける２０倍の増加があるため、明らかなアイメリア属増殖を示す。陽性対照、ならびに異なる投薬量の没食子酸は、アイメリア属増殖を阻害した。１０ｐｐｍ没食子酸に関しては、わずかにより低い効果が見られた。しかし、これは、陰性対照における増加と比較して、無視できるものである。
実施例１０−コクシジウム症を制御する際の没食子酸の有効性
[000108]ブロイラー鳥において、コクシジウム症を制御する際の１１、２２および３３ｐｐｍの３つの異なる投薬量での没食子酸の有効性を、ｉｎ ｖｉｖｏ曝露試験によって評価した。Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナのオーシストを用いて、鳥に、アイメリア属の混合感染を誘導した。これらのオーシストは、臨床的コクシジウム症と確認された鳥から単離された。試験設計、オーシスト投与量、ワクチン接種スケジュール、飼育場維持は、実施例３のものと同様であった。病変スコアリングは、感染対照およびさらに陽性対照、サリノマイシンに比較した際、アイメリア属の３つの試験した種すべてに関して、スコアの有意な減少があることを示した（図２０）。グラムあたりのオーシストによって、同様の傾向が示された（図２１）が、感染対照を含めて処置群のいずれにおいても死亡は観察されなかった。用量依存性反応を観察し、２２および５５ｐｐｍの没食子酸の間には有意な相違がなかった。これによって、没食子酸が、ブロイラー鳥において、コクシジウム症の混合感染を制御可能であることが示される。没食子酸が、Ｑ．インフェクトリアの抗コクシジウム活性に関与する活性成分であることもまた明らかである。
[000108]ブロイラー鳥において、コクシジウム症を制御する際の１１、２２および３３ｐｐｍの３つの異なる投薬量での没食子酸の有効性を、ｉｎ ｖｉｖｏ曝露試験によって評価した。Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナのオーシストを用いて、鳥に、アイメリア属の混合感染を誘導した。これらのオーシストは、臨床的コクシジウム症と確認された鳥から単離された。試験設計、オーシスト投与量、ワクチン接種スケジュール、飼育場維持は、実施例３のものと同様であった。病変スコアリングは、感染対照およびさらに陽性対照、サリノマイシンに比較した際、アイメリア属の３つの試験した種すべてに関して、スコアの有意な減少があることを示した（図２０）。グラムあたりのオーシストによって、同様の傾向が示された（図２１）が、感染対照を含めて処置群のいずれにおいても死亡は観察されなかった。用量依存性反応を観察し、２２および５５ｐｐｍの没食子酸の間には有意な相違がなかった。これによって、没食子酸が、ブロイラー鳥において、コクシジウム症の混合感染を制御可能であることが示される。没食子酸が、Ｑ．インフェクトリアの抗コクシジウム活性に関与する活性成分であることもまた明らかである。
実施例１１−没食子酸を含有する植物の抗スポロゾイト活性
[000109]さらに、ブロイラー鳥における抗スポロゾイト活性および抗コクシジウム活性に関して、没食子酸を含有する他の植物もまた評価した。選択した植物は、ヌルデ（Ｒｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（中国産没食子）およびミロバラン（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）（インド産没食子）であった。ヌルデは、約７０％の加水分解可能タンニンを含有し、そしてミロバランはほぼ０．２８％の遊離没食子酸を含有する。しかし、ミロバランは、２５〜４０％の加水分解可能タンニンを含有し、これが分解されて没食子酸を遊離させうる。これらの植物は、その酸化防止、抗炎症、抗細菌、抗真菌、抗突然変異および抗癌活性に関して報告されてきている。
[000109]さらに、ブロイラー鳥における抗スポロゾイト活性および抗コクシジウム活性に関して、没食子酸を含有する他の植物もまた評価した。選択した植物は、ヌルデ（Ｒｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（中国産没食子）およびミロバラン（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）（インド産没食子）であった。ヌルデは、約７０％の加水分解可能タンニンを含有し、そしてミロバランはほぼ０．２８％の遊離没食子酸を含有する。しかし、ミロバランは、２５〜４０％の加水分解可能タンニンを含有し、これが分解されて没食子酸を遊離させうる。これらの植物は、その酸化防止、抗炎症、抗細菌、抗真菌、抗突然変異および抗癌活性に関して報告されてきている。
[000110]ミロバランの果実およびヌルデの没食子の未精製粉末を、それぞれ、Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｍｅｄｉｅｓ、インド・バンガロール、および中国・新疆より得た。ＭＴＴアッセイによる抗スポロゾイト・アッセイによって、試験した植物はどちらも、対照に比較してスポロゾイトの生存度を減少させることが可能であり、そして陽性対照、サリノマイシンよりも優れていることが示された（図２２）。
実施例１２−宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する没食子酸含有植物のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果
[000111]宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、他の供給源の没食子酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[000111]宿主細胞におけるアイメリア・テネラ・スポロゾイト侵入および増殖に対する、他の供給源の没食子酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を評価する実験を行った。
[000112]胞子形成したオーシストから、ガラス・ビーズ粉砕および酵素的脱嚢後、スポロゾイトを得た。宿主細胞として、マディン−ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を選択した。スポロゾイトを、５０、１００および２５０ｐｐｍのミロバランで３時間、前処置した。その後、スポロゾイト懸濁物を洗浄し、そしてＭＤＢＫ細胞培養上に２０時間置いた。インキュベーション後、培地を取り除き、細胞を洗浄し、そして新鮮な培地を添加した。２０時間後、７２時間後、および９６時間後、培地およびＭＤＢＫ細胞を収集し、そして−２０℃で保存した。
[000113]陰性対照（ｎｅｇ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、細胞培地中でインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。陽性対照（ｐｏｓ ｃｔｒｌ）は、アイメリア属スポロゾイトに感染させ、５μｇ／ｍｌのサリノマイシン溶液とインキュベーションしたＭＤＢＫ細胞であった。
[000114]異なる収集時点で、ＭＤＢＫ細胞からＤＮＡを抽出した。異なる時点および異なる処置に関して、試料に対して、アイメリア・テネラＤＮＡを検出するリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ結果を図２３に提示する。
リアルタイムＰＣＲ分析
[000115]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[000116]ミロバランに関するこれらの結果を図２４に提示する。
[000115]１つの処置内で、Ｔ２０に対する各時点のＣｔ値の相違を計算した（ΔＣｔ）。以下の等式を用いて、Ｔ２０に対する各時点の倍変化を計算した：
倍変化＝２−ΔＣｔ
[000116]ミロバランに関するこれらの結果を図２４に提示する。
[000117]陰性対照は、２０時間での開始時点に対して、９６時間で、アイメリア属ＤＮＡにおける２０倍の増加があるため、明らかなアイメリア属増殖を示す。陽性対照ならびに２５０ｐｐｍのミロバランは、アイメリア属増殖を完全に阻害可能であった。用量反応効果が見られたが、１００ｐｐｍのミロバランに関する、より低い効果は、陰性対照における増加と比較して、無視できるものである。
実施例１３−コクシジウム症を制御する際の没食子酸含有植物の有効性
[000118]没食子酸含有植物、すなわちミロバランおよびヌルデが、ブロイラー鳥において、コクシジウム症を制御する際の有効性を、ｉｎ ｖｉｖｏ曝露試験によって評価した。臨床的コクシジウム症と確認された鳥から単離されたＥ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナのオーシストを用いて、鳥に、アイメリア属の混合感染を誘導した。試験設計、オーシスト投与量、ワクチン接種スケジュール、飼育場維持は、実施例３のものと同様であった。病変スコアリングは、感染対照およびさらに陽性対照、サリノマイシンに比較した際、アイメリア属の３つの試験した種すべてに関して、２００および５００ｐｐｍのヌルデ、ならびに１０００ｐｐｍのミロバランが、スコアを減少させうることを示した（図２５）。グラムあたりのオーシストによって、同様の傾向が示された（図２６）が、感染対照を含めて処置群のいずれにおいても死亡は観察されなかった。用量依存性反応は、ヌルデで観察された。
[000118]没食子酸含有植物、すなわちミロバランおよびヌルデが、ブロイラー鳥において、コクシジウム症を制御する際の有効性を、ｉｎ ｖｉｖｏ曝露試験によって評価した。臨床的コクシジウム症と確認された鳥から単離されたＥ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナのオーシストを用いて、鳥に、アイメリア属の混合感染を誘導した。試験設計、オーシスト投与量、ワクチン接種スケジュール、飼育場維持は、実施例３のものと同様であった。病変スコアリングは、感染対照およびさらに陽性対照、サリノマイシンに比較した際、アイメリア属の３つの試験した種すべてに関して、２００および５００ｐｐｍのヌルデ、ならびに１０００ｐｐｍのミロバランが、スコアを減少させうることを示した（図２５）。グラムあたりのオーシストによって、同様の傾向が示された（図２６）が、感染対照を含めて処置群のいずれにおいても死亡は観察されなかった。用量依存性反応は、ヌルデで観察された。
[000119]前述の説明および図は、本発明の例示的な態様を含む。本明細書に記載する前述の態様および方法は、当業者の能力、経験および好みに基づいて、多様であることも可能である。特定の順序の方法工程の単なる列挙は、方法工程の順序にいかなる限定も構成しない。前述の説明および図は、本発明を単に説明し、そして例示し、そして本発明は、請求項がそのように限定する場合を除いて、それに限定されない。当業者は、本開示を前にして、本発明の範囲から逸脱することなく、これに修飾および変形を行うことが可能であろう。
Claims (14)
- 動物において、コクシジウム症を制御するための組成物であって、没食子酸の有効量を含有する植物部分または植物抽出物を含み、前記植物がクエルクス・インフェクトリア（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｉｎｆｅｃｔｏｒｉａ）、ヌルデ（Ｒｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）およびミロバラン（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）からなる群より選択される、前記組成物。
- 抽出物が天然抽出物である、請求項１の組成物。
- コクシジウム症がアイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）種によって引き起こされる、請求項１の組成物。
- アイメリア属種が、Ｅ．テネラ（Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａ）、Ｅ．マキシマ（Ｅ． ｍａｘｉｍａ）およびＥ．アセルブリナ（Ｅ． ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）からなる群より選択される、請求項３の組成物。
- コクシジウム症制御が、家禽における盲腸病変スコア、糞便物質グラムあたりのオーシストおよび死亡率の減少を含む、請求項１の組成物。
- 動物（ヒトを除く）においてコクシジウム症を制御する方法であって、クエルクス・インフェクトリアおよびヌルデからなる群より選択される植物部分または植物抽出物のいずれかを０．１〜５０ｐｐｍの量で投与する工程を含む、前記方法。
- 抽出物が天然抽出物である、請求項６の方法。
- コクシジウム症がアイメリア属種によって引き起こされる、請求項６の方法。
- アイメリア属種が、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナからなる群より選択される、請求項８の方法。
- コクシジウム症制御が、病変スコア、糞便物質グラムあたりのオーシストおよび死亡率の減少を含む、請求項６の方法。
- アイメリア属種に感染した動物（ヒトを除く）において、スポロゾイトの活性を減少させる方法であって、没食子酸の有効量を含有する、植物部分または植物抽出物を動物に投与する工程を含む、前記方法。
- 抽出物が天然抽出物である、請求項１１の方法。
- アイメリア属種が、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマおよびＥ．アセルブリナからなる群より選択される、請求項１１の方法。
- スポロゾイト活性の減少が、家禽における盲腸病変スコア、糞便物質グラムあたりのオーシストおよび死亡率の減少を生じる、請求項１１の方法。
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