KR100987800B1

KR100987800B1 - 개똥쑥 정유를 함유하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR100987800B1
Application number: KR1020080007969A
Authority: KR
Inventors: 신승원
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2010-10-13
Also published as: KR20090081854A

Abstract

본원 발명은 항생제 내성 및 감수성 균주에 대해 항균 효과를 나타내고, 기존 항생제와 병용시 항균 효과가 상승하는 개똥쑥 정유에 대한 것이다. 본원 발명의 개똥쑥 정유는 항생제에 내성 또는 감수성이 있는 살모넬라 균주 모두에 대해 항균 작용을 나타내었고, 기존의 항생제인 카나마이신과 병용하였을 때 항균 효과의 상승 작용을 나타내었다. 따라서, 개똥쑥 정유는 항생제 감수성 균주뿐만 아니라 내성 균주에 대한 억제제로 사용될 수 있다.

개똥쑥, 정유, 항균

Description

개똥쑥 정유를 함유하는 항균 조성물{Antibacterial composition comprising the essential oil from Artemisia annua L.}

본원 발명은 항균 효과를 갖는 개똥쑥 정유에 대한 것이다. 보다 구체적으로, 본원 발명은 항생제 내성 또는 감수성 균주에 대해 항균 효과를 나타내고, 또한 기존 항생제와 병용시 항균 효과가 상승하는 개똥쑥 정유에 대한 것이다.

전 세계적으로 급속히 증가하는 내성균의 출현은 인류의 미래를 위협하고 있으며, 새로운 치료제 개발의 필요성을 가중시키고 있다. 이 중 장관 계통의 감염균의 주류를 이루며, 동, 식물성 식품이나 감염된 동물을 통하여 사람에게로 이차적으로 전파되어 여러 가지 질병을 유발시키는 살모넬라 속 다제 내성균의 빠른 증가 속도는 큰 문제로 부각되고 있다.

또한, 항생제의 과용으로 인하여 항생제를 처리하여도 항균 효과를 나타내지 못하는 경우가 많아, 항생제 내성 균주에 대해 항균 효과를 나타내도록 하는 항균제의 개발이 시급한 실정이다.

식물에는 강력한 항균 작용이 있는 성분들이 다수 함유되어 있어 천연 항균제를 개발하는 중요한 자원으로 여겨지고 있다. 예를 들면, 살모넬라 파라타파이 A.에 대해 항균 효과를 갖는 조작자나무로부터 추출한 생약 성분을 포함하는 항균제(대한민국 특허 공개번호 제1997-235호), 대장균, 살모넬라 또는 비브리오 균에 대해 항균 효과를 갖는 부추 착즙액 또는 부추 착즙액의 에틸 아세테이트 추출물(대한민국 특허 공개번호 제2002-48347호), 살모넬라 파라타파이 균에 대해 항균 효과를 나타내는 괭생이 모자반의 에탄올 추출물을 포함하는 식품 첨가제(대한민국 공개 특허 제2006-88169호) 등이 있다.

한편, 개똥숙(Artemisia annua L.)은 국화과에 속하는 일년생 초본으로 열대 아시아 원산으로 세계적으로 분포하고 있으며, 우리나라에서는 전구 각지의 길가나 들판에서 야생하고 있다. 한방에서는 개똥쑥의 지상부를 해열제, 지혈제, 피부병 치료제, 살충제 등으로 사용하고 있다. 또한, 개똥쑥은 항말라리아제인 아르테미시닌(artemisinin)의 공급원으로 잘 알려져 있다.

본원 발명자는 개똥쑥을 수증기 증류-추출하여 얻은 개똥쑥 정유가 장관계통 감염균의 주류를 이루는 살모넬라 속 균주 특히 항생제 내성 및 감수성 균주에 대해 항균 효과가 있고, 기존 항생제인 카나마이신과 병용시 항균 효과가 현저히 상승하였음을 확인하여 본원 발명을 완성하였다.

본원 발명은 항균 효과를 갖는 천연 식물로부터 유래하는 정유를 제공하는 것이다.

본원 발명은 항생제 내성 또는 감수성 균주에 대한 항균 효과를 갖는 천연 식물로부터 유래하는 정유를 제공하는 것이다.

본원 발명은 기존 항생제와 병용하였을 때 항균 효과의 상승 작용을 갖는, 천연 식물로부터 유래하는 정유를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본원 발명은 개똥쑥으로부터 제조한 정유를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.

또한, 본원 발명은 개똥쑥으로부터 제조한 정유와 항생제의 배합을 유효 성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.

이하, 본원 발명을 상세히 설명한다.

상기 정유는 통상적인 추출 방법을 사용하여 개똥쑥으로부터 제조할 수 있다. 바람직하게는 수증기 증류(steam distillation) 방법 또는 수증기 증류-추출을 동시에 하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

상기 개똥쑥으로부터 제조된 정유는 약제 내성 또는 감수성을 갖는 살모넬라 균주에 대해 강한 항균 활성을 나타내었다. 특히, 개똥쑥으로부터 제조된 정유는 살모넬라 균주 중에서도 감염된 동물을 통하여 사람에게로 이차적으로 전파되어 여러 가지 질병을 유발시키는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)과 살모 넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 내성균에 대해 항균 효과를 나타내었다. 또한, 살모넬라 균주 중 항생제 내성 균주와 감수성 균주 모두에 대해 낮은 최소 억제 농도(MIC)를 나타내었다.

또한, 개똥쑥으로부터 제조된 정유는 기존 항생제와 병용하였을 때에는, 항생제 내성 균주 및 감수성 균주 모두에 대해서 정유를 단독으로 사용하였을 때보다 MIC가 감소하여, 기존 항생제와 병용시 항균 효과의 상승 작용을 나타내었다. 보다 구체적으로는, 살모넬라 티피무리움 균주 중 항생제 내성 균주인 R8007과 R8009 및 감수성 균주인 S11862에 대해 카나마이신과 병용하였을 때, 개똥쑥 정유를 단독으로 사용하였을 때보다 MIC가 저하되었다.

본원 발명에서 개똥쑥으로부터 제조된 정유와 배합 가능한 항생제로는 노르플록사신(norfloxacin), 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin) 등이 있고, 바람직하게는 카나마이신이 항생제로서 배합될 수 있다.

개똥쑥으로부터 제조된 정유와 항생제는 1: 0.00001 내지 0.00002의 중량비로 배합하는 것이 바람직하다.

본원 발명의 항균 조성물은 약제 내성 또는 감수성이 있는 살모넬라 균주에 대해 항균 활성을 나타내었으므로, 살모넬라 균주로 인해 발생되는 다수의 질병의 치료를 위한 항균제의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 항균 조성물은 닭이나 오리 등의 가금류와 달걀 또는 이들의 가공 식품을 통한 오염 또는 애완 동물 또는 보균자로부터 감염되어 발생되며, 설사, 복통 및 발열, 수양성변, 혈변 혹은 점 혈변 배설을 유발하고 심하면 사망에까지 이르게 하는 장티푸 스 또는 식중독의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본원 발명의 항균 조성물의 주성분인 개똥쑥은 한방에서는 해열제, 지혈제, 피부병 치료제 등으로 사용되고 있으므로, 이들로부터 추출된 정유는 독성이나 부작용이 없다.

본원 발명의 항균 조성물은 조성물 전체 중량에 대해 상기 개똥쑥으로부터 제조한 정유 또는 개똥쑥으로부터 제조한 정유와 항생제의 배합을 0.00001 내지 0.00002 중량%로 포함한다.

상기 항균 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본원 발명의 개똥쑥 정유에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순히 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비서성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제, 좌제 등이 포함된다. 비수성 용제, 현탁용 제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤제라틴 등이 사용될 수 있다.

본원 발명의 항균 조성물은 하루 1.5 내지 3.5 mg/kg의 투여량으로 하루 1-3회 투여될 수 있다.

본원 발명의 개똥쑥 정유 또는 개똥쑥 정유와 항생제의 배합을 포함하는 항균 조성물은 살모넬라 균주 감염의 예방 또는 치료를 위한 항균 보조제로 사용될 수 있다.

본원 발명의 개똥쑥 정유는 항생제 내성 및 감수성인 살모넬라 균주 모두에 대해 항균 작용을 나타내었다. 또한, 본원 발명의 개똥쑥 정유는 기존의 항생제인 카나마이신과 병용하였을 때 항균 효과의 상승 작용을 나타내었다. 따라서, 개똥쑥 정유는 항생제 감수성 균주뿐만 아니라 내성 균주에 대한 억제제로 사용될 수 있다.

본원 발명을 하기 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 그러나, 본원 발명이 하기 실시예에 의해 보다 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 개똥쑥의 정유

(1) 개똥쑥 정유의 제조

개똥숙의 지상 부분(7.2 Kg)을 채취하여 건조시킨 분말 6.2 Kg을 얻었다. 수증기 증류-추출을 동시에 수행하는 장치(simultaneous steam distillation-extraction apparatus, SDE)(덕산 과학)와 용매로 에테르를 사용하여, 5 시간 동안 수증기 증류하고, 수집된 에테르층과, 물 층을 에테르로 다시 추출한 것을 합하였고, 감압 농축하여 개똥쑥의 정유 7.04 g(수득률 0.11%(w/w)를 제조하였다.

(2) 개똥쑥 정유의 성분 분석

상기에서 제조한 개똥쑥 정유를 에테르 용액에 녹여 2% 용액을 제조하였고, 그 중 1 ㎕를 Hewlett-Packard 6890 GC와 Hewlett-Packard 5973 MSD 분석기기에 주입하고, 하기의 조건에서 분석하였다. 측정된 각 피크의 질량 스펙트럼은 컴퓨터에 저장된 질량 데이타(PBM Search of Library file: Data: Wiley L.)와 비교하여 구조를 동정하였다. 운반 기체: He(0.8 및 1.6 ml/분), 컬럼: HP-5MS(50 m x 0.2 mm x 0.11 ㎛) capillary column, 오븐 온도: 50℃(10분), 3℃/분(50~220℃), 스프릿(10:1). GC-MS 분석 결과, 개똥쑥 정유에는 1,8-시네올(1,8-cineole), 캠포(camphor), 캐리오필렌(caryophyllene), 캐리오필렌 옥시드(caryophyllene oxide) 등의 화합물이 주로 포함되어 있는 것으로 확인되었다.

실험예 : 개똥쑥 정유의 항균 활성

(1) 사용 균주의 배양

에스 엔테리티디스(S. enterititis) KCCM12201, 에스 엔테리티디스 CCARM8010, 에스 엔테리티디스 CCARM8011, 에스 티피무리움(S. typhimurium) KCCM11862, 에스 티피무리움 CCARM8007, 에스 티피무리움 CCARM8009(한국 미생물 보존 센터(KCCM)와 항생제 내성 균주 은행(CCARM)에서 분양 받음)을 Muller-Hinton I 액체 배지(BD)(배지 1 리터 당 소고기 추출물 분말 2.0 g, 카세인 산 분해물 17.5 g, 용성 전분 1.5 g, 제조사: Becton Dickinson, 미국)에 현탁시키고, McFarland 0.5 Standard와 동일한 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 1 x 10⁴~10⁵ CFU/ml가 되도록 만들었다.

(2) MIC 측정

상기 실시예 1에서 제조한 개똥쑥 지상부의 정유 64 mg에 에탄올 934 ㎕와 2㎕의 Tween 80(Duksan Pure Chemical, 한국)을 첨가하여 현탁시켰고, 시린지 필터(syringe filter)로 무균 여과하여, 최고 농도 50 mg/ml에서 최저 농도 0.78 mg/ml에 이르도록 단계적으로 희석시켜 시료 용액을 제조하였다. 그런 다음, 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 농도별로 시료 용액 100 ㎕씩 주입하였다. 그런 다음, 상기 균주 액 100 ㎕와 배지(Muller-Hinton I 액체 배지, 조성: 배지 1 리터 당 소고기 추출물 분말 2.0 g, 카세인 산 분해물 17.5 g, 용성 전분 1.5 g, 제조사: Becton Dicknson, 미국) 95 ㎕를 첨가하였다. 그런 다음, 교반 배양기(shaking incubator)(100 rpm)에 넣고 36℃에서 24시간 동안 배양하였다. 육안으로 관찰하여, 균의 성장이 억제되는 최저 억제 농도(MIC)를 판별하였다.

개똥쑥 정유의 주성분인 캠포, 캐리오필렌, 캐리오필렌 옥시드 및 1,8-시네올(모두 Sigma-Korea Chemical CO.)에 대해서도, 개똥숙 정유와 동일한 방법으로 처리하여 균주를 배양하였고, 균의 성장이 억제되는 최저 억제 농도를 판별하였다.

카나마이신과 노르플록사신(모두 Sigma-Korea Chemical CO.)은 디메틸술폭시드(DMSO)를 용매로 사용하였고, 앰피실린(Sigma-Korea Chemical CO.)은 증류수를 용매로 사용하여, 최고 농도 2 mg/ml에서부터 최저 농도 15 ㎍/ml까지 8 단계로 시료 용액을 제조하였다. 제조한 각각의 농도의 시료 용액을 각 웰마다 5 ㎕씩 주입하였고, 상기 균주 액 100 ㎕와 배지 95 ㎕을 첨가하였다. 그런 다음, 개똥쑥 정유를 첨가하였을 때와 동일한 조건에서 균주를 배양하였다. 육안으로 관찰하여, 균의 성장이 억제되는 최저 억제 농도(MIC)를 판별하였다.

대조군으로는, 사용한 용매인 에탄올과 Tween 80, 디메틸술폭시드와 Tween 80을 각각의 웰 첨가하였고, 시료를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에서 균주를 배양하였다.

그 결과를 표 1에 나타내었다.

<표 1> 살모넬라 균에 대한 항균 효과

	에스 엔테리티디스			에스 티피무리움
	S12021	R8010	R8011	S11862	R8007	R8009
개똥쑥 정유	4	4	8	2	4	4
캐리오필렌	>16	>16	>16	>16	>16	>16
캐리오필렌 옥시드	>16	>16	>16	>16	>16	>16
시네올	8	16	16	4	16	16
캠포	4	4	4	2	4	4
앰피실린	>64	>64	>64	>64	>64	>64
카나마이신	1	16	8	4	2	2048
노르플록사신	>0.5	>0.5	1	>0.5	>0.5	>0.5

대조군 실험 결과, Tween 80이 균주의 성장에 영향을 주지 않았음이 확인되었다. 기존의 항생제에 대한 내성 감수성에 대한 MIC 판정 기준인 NCCLS 2007년도 판에 따르면, 본원 실험에 사용한 6종의 살모넬라 균주는 모두 노르플록사신에 대하여 감수성을 나타내었고(≤4), 앰피실린에 대해서는 내성을 나타내었다(≥32). 카나마이신에 대해서는 에스 티피무리움 CCARM8009 만이 내성을 나타내었고(≥64), 나머지 5종은 감수성을 나타내었다(≤16). 상기 표 1에서 나타난 바와 같이, 개똥숙 정유는 모든 항생제에 대한 감수성 및 내성 살모넬라 균주에 대해 억제 효과를 나타내었고, 균주에 따른 MIC는 현저하게 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 개똥쑥 정유는 항생제 감수성 균주뿐만 아니라 내성 균주에 대한 억제제로 사용될 수 있다.

(3) 체커보드 마이크로티터 테스트(checkerboard mocrotiter test)에 의한 병용 효과

균주로는 에스 티피무리움 카나마이신-감수성 균주 S11862와 카나마이신-내성 균주 R8007과 R8009를 사용하였다.

2% Tween 80을 포함하는 배지(Muller-Hinton I 액체 배지, 조성: 배지 1 리터 당 소고기 추출물 분말 2.0 g, 카세인 산 분해물 17.5g, 용성 전분 1.5 g, 제조사: Becton Dicknson, 미국)를 사용하여 최고 농도 50 mg/ml에서 최저 농도 0.78 mg/ml가 되도록(50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78 mg/ml) 상기 실시예 1에서 제조한 개똥쑥 정유 분획, 캠포 또는 1,8-시네올을 희석하여 각각의 시료액을 제조하였다. 각각 제조한 시료액 50 ㎕를 96 웰 플레이트의 각 웰의 가로 방향에 농도별로 넣었다. DMSO(99%)를 사용하여 4.096 mg/ml가 되도록 항생제 카나마이신을 녹여 카나마이신 시료액을 제조하였다. 각각의 농도별 시료액 5 ㎕를 96 웰 플레이트의 웰의 세로 방향으로 첨가하였다. 그런 다음 Mcfarland 0.5의 탁도로 조절한 에스. 티피무리움 각각의 균주의 현탁액 145 ㎕를 첨가하였다. 그런 다음, 교반 배양기 (100 rpm)에 넣고 36℃에서 24시간 동안 배양하였다. 육안으로 관찰하여, 균의 성장이 억제되는 최저 농도(MIC)의 배합 비율을 판별하였다. 가장 효율적으로 나타난 배합 농도의 결과를 하기 식에 대입하여 부분 억제 농도(fractional inhibiting concentration, FIC)를 계산하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다Whiter, R. L., Burgess, D. S., Manduru, M. and Bosso, Comparison of three different in vitro methods of detecting synergy: time-kill, checkerboard, and E test. Antimic Agents Chemother. 40. 1914 (1996)). FIC 지수가 0.5 보다 작거나 같으면 상승 효과(synergistic effect)가 있는 것으로 판단하였고, 0.5와 4 사이이면 무관하거나(indifferent) 또는 부가(additive) 효과가 있는 것으로 판단하였고, 4보다 클 때에는 상쇄 효과(antagonistic effect)가 있는 것으로 판단하였 다.

정유의 FIC = (카나마이신에 배합된 정유의 MIC)/(정유를 단독으로 사용하였을 때의 MIC)

카나마이신의 FIC = (정유에 배합된 카나마이신의 MIC)/(카나마이신을 단독으로 사용하였을 때의 MIC)

FICI = 정유의 FIC + 카나마이신의 FIC

<표 2> 카나마이신과 병용시 항균 효과의 변화

배합	S11862		R8007		R8009
	FIC	FICI	FIC	FICI	FIC	FICI
개똥쑥 정유와 카나마이신	0.250	0.312	1.000	2.000	0.125	0.375
	0.062		1.000		0.250
캠포와 카나마이신	0.070	0.085	0.500	0.562	0.125	0.375
	0.015		0.062		0.250
1.8-시네올과 카나마이신	0.015	0.140	0.250	0.281	0.125	00.187
	0.125		0.031		0.062

상기 표 2에서 나타난 바와 같이, 개똥쑥 정유와 카나마이신의 병용은 에스 티피무리움 CCARM 8007 균주를 제외한 대부분의 균주에 대해 FIC가 0.250 이하로 MIC가 현저하게 저하되었다. 또한, 에스 티피무리움 KCCM 11862와 에스 티피무리움 CCARM 8009는 FICI가 0.185~0.375로 나타나, 개똥쑥 정유와 카나마이신을 병용하였을 때, 항균 작용의 상승이 나타났음을 알 수 있다.

Claims

개똥쑥(Artemisia annua L.)으로부터 제조한 정유(essential oil) 및 항생제를 유효 성분으로 함유하며, 상기 항생제는 카나마이신으로 이루어지고, 상기 정유와 상기 항생제는 1: 0.00001 내지 0.00002의 중량비로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 균주에 대한 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항균 조성물은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)와 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주에 대해 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 정유는 수증기 증류(steam distillation)-추출을 동시에 하는 방법에 의하여 개똥쑥으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항균 조성물은 카나마이신(kanamacyin) 내성 또는 감수성인 살모넬라 균에 대해 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
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삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 살모넬라 균주 감염의 예방 또는 치료용 항균 보조제.