KR101346255B1 - 오쟈와디어 레테스투이 추출물을 포함하고 황색포도상구균에 대해 항균 활성을 갖는 항균제 조성물 - Google Patents
오쟈와디어 레테스투이 추출물을 포함하고 황색포도상구균에 대해 항균 활성을 갖는 항균제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 황색포도상구균에 대한 항균 조성물 및 그 제조방법에 관한 발명으로서, 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 각 부위별 추출물이 황색포도상구균에 대하여 항균 활성이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 각 부위별 추출물은 물과 유기용매를 사용하여 추출하는 방법으로 수득할 수 있다. 또한 상기 추출물과 함께 기존의 항생제인 암피실린(ampicillin), 노플록삭신(norfloxacin), 시프로플록삭신(ciproloxacin), 에리스로마이신(erythromycin), 니신(nisin)을 혼합하여 사용하게 되면 상기 추출물만 사용한 경우에 비해 보다 우수한 항균 활성이 달성 됨을 확인한 발명이다.
Description
본 발명은 황색포도상구균에 대하여 항균활성이 우수한 항균 조성물에 관한 것이다.
포도상구균은 자연계에 널리 분포하고 있는 세균의 하나이며, 피부의 화농, 중이염, 방광염 등 화농성 질환을 일으키는 원인균이다. 이중 황색의 색소를 생산하는 황색포도상구균은 식중독을 일으킨다. 이러한 황색포도상구균은 우리나라에서 살모넬라균 및 장염비브리오균 다음으로 식중독을 많이 일으키는 세균으로 알려져 있다.
이러한 황색포도상구균에 효과적으로 대처할 수 있는 다양한 화학 구조를 가진 항균제가 개발되었음에도 불구하고 오?남용 등으로 황색포도상구균은 기존 항균제에 대하여 높은 내성을 갖게 되었다.
또한, 화합물로 이루어진 항균제를 식품에 첨가하게 되는 경우, 그로 인한 또 다른 부작용이 우려되고 있는 바, 사람이 섭취해도 문제가 없는 천연물 유래의 항균제가 오늘날 시급히 요구되고 있다.
그리하여 각종 식물의 추출물을 이용한 새로운 항균제의 개발에 관심을 가지게 되었다. 특히 이러한 식물의 추출물로부터 얻어진 항균제는 화합물로 이루어진 합성항균제에 비해 독성이 적고, 부식성이 없어 인체에 안전하다는 장점을 가진다.
한편 실거리나무과 (Caesalpiniaceae)에 속하는 오쟈와디어 레테스투이 (Augouardia letestui)는 아프리카 중서부의 가봉공화국에 자생하는 수목이다. 이러한 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)는 아프리카에서 천연 치료제로 이용이 되고 있으나, 아직 항균작용과 천연 항균제로서의 효과에 대해서는 확인되고 있지 않다.
상기 살펴본 바와 같이 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 천연 식물인 오쟈와디어 레테스투이 (Augouardia letestui)의 추출물을 사용하여 황색포도상구균에 대해 항균활성이 우수한 항균제를 제공하고자 한다. 그리하여 식중독을 유발하고 피부의 화농, 중이염, 방광염 등을 일으키는 황색포도상구균에 대하여 특이적 효과가 있는 신규한 항균제를 제공하고자 한다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 항균 조성물은 오쟈와디어 레테스투이 (Augouardia letestui) 추출물을 유효성분으로 포함한다.
또한 상기 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물은 뿌리, 줄기, 잎에서 각각의 부위별로 추출되어 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물은 물과 유기용매에 의해 추출되는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 유기용매는 메탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 항균 조성물에 암피실린(ampicillin), 노플록삭신(norfloxacin), 시프로플록삭신(ciproloxacin), 에리스로마이신(erythromycin) 또는 니신(nisin)으로 이루어지는 군 중에서 1종 이상의 항생제를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 오쟈와디어 레테스투이 추출물과 항생제는 16:1 ~ 1:2의 중량비로 혼합되어 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 의료제품, 약품, 화장품, 식품 또는 동물성 사료 등은 상기 항균 조성물을 포함한다.
본 발명의 항균제는 천연 식물인 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 추출물을 포함하여 항균제를 제조함으로써 인체에 독성이 없고 부작용이 적은 항균제를 제공할 수 있다. 그리고 본 발명의 항균제는 화학적 방법이 아닌 천연 식물을 이용한 신규 항균제로서 기존에 존재하는 황색포도상구균에 대해 특이적으로 항균 효과가 있는 항균 조성물을 제공할 수 있게 된다.
이에 본 발명자들은 기존의 황색포도상구균에 비해 내성이 적은 항균제를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 천연 식물인 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 추출물을 포함하는 신규한 황색포도상구균에 대한 항균 조성물을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따른 항균제는 천연 식물인 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 각 부위별 추출물을 포함한다.
또한, 본 발명의 항균제는 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 각 부위별 추출물에 종래의 항생제인 암피실린(ampicillin), 노플록삭신(norfloxacin), 시프로플록삭신(ciproloxacin), 에리스로마이신(erythromycin), 니신(nisin)을 더 포함할 수 있다.
이 때 상기 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 추출물은 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리, 줄기, 잎에서 각 부위별로 추출하며, 또한 상기 각 부위별 추출물의 혼합물일 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시 예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
<
실시예
1:
오쟈와디어
레테스투이(Augouardia letestui)시료의
준비>
오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)을 뿌리, 줄기, 잎으로 나누어 깨끗이 세척한 다음, 음지에서 건조시켰다. 후에 건조물을 부위별로 마쇄하여 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 시료를 준비하였다.
<
실시예
2: 메탄올 분획추출물의 수득>
실시예 1에서 준비한 뿌리, 줄기, 잎의 각 부위별 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 시료 100g을 정량하여 각각의 비커에 넣고, 메탄올 900ml를 첨가하여 3회 환류 추출하여, 메탄올 층을 분리하였다. 분리된 메탄올층을 감압 농축하여, 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 각 부위별 메탄올 분획추출물을 얻었다.
<
실시예
3:
헥산
분획추출물의 수득>
상기 실시예 2에 의한 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 각 부위별 메탄올 분획추출액을 분액 깔대기에 1 v/v(용량/용량)을 넣고, 헥산 10 v/v(용량/용량)과 물 9 v/v(용량/용량)의 비율 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 메탄올 추출물 : 물 : 헥산 = 1 : 9 :10)로 가하였다. 각각의 용매가 잘 섞이도록 반복적으로 흔들어 준 다음, 헥산층과 물층이 분리되도록 정제하였다. 그 결과, 상층에는 헥산층이 형성되고, 하층에는 물층이 형성되었다. 하층에 형성된 물층은 잘 분리하여 다른 분액 깔대기에 보관하였다. 헥산을 가하여 헥산층을 분리하는 과정을 3회 반복하였다. 분리된 헥산층은 35℃에서 감압 농축하여 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 의 각 부위별 헥산 분획추출물을 얻었다.
<
실시예
4: 에틸아세테이트 분획추출물의 수득>
상기 실시예3에서 헥산층과 분리된 하층에, 에틸아세테이트를 1:1(v/v)의 비율로 가하여 혼합한 후, 분액깔대기를 이용하여 에틸아세테이트 층을 분리하였다. 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트층을 분리하는 과정을 3회 반복하였다. 분리된 에틸아세테이트층은 35℃에서 감압농축하여 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 의 각 부위별 에틸아세테이트 분획추출물을 얻었다.
<
실시예
5:
부탄올
분획추출물의 수득>
상기 실시예 4에서 에틸아세테이트층과 분리된 하층에, 부탄올을 1:1(v/v)의 비율로 가하여 혼합한 후, 분액깔대기를 이용하여 부탄올 층을 분리하였다. 상기 부탄올을 가하여 부탄올 층을 분리하는 과정을 3회 반복하였다. 분리된 부탄올 층은 35℃에서 감압농축하여 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 의 각 부위별 부탄올 분획추출물을 얻었다.
<
실시예
6: 물 분획추출물의 수득>
상기 실시예 5에서 부탄올 층과 분리된 물 층을, 동결건조하여 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 의 각 부위별 물 분획추출물을 얻었다.
<
실시예
7: 각 추출물과 기존 항생제와의 혼합>
상기 실시예 2 내지 실시예6에 따라 수득한 각 부위별 추출물과 기존의 항생제인 암피실린(ampicillin), 노플록삭신(norfloxacin), 시프로플록삭신(ciproloxacin), 에리스로마이신(erythromycin), 니신(nisin) 각각을 혼합하였다.
비교예
기존의 항생제인 암피실린(ampicillin), 노플록삭신(norfloxacin), 시프로플록삭신(ciproloxacin), 에리스로마이신(erythromycin), 니신(nisin) 각각을 비교예로 하였다.
실험예
<
실험예
1: 황색포도상구균 균주의 선별 및 배양조건>
황색포도상구균은 총 14개 균주를 선별하였다. 선택된 균주는 하기 표 1과 같다. 아래에서 1번 균주인 ATCC 33591은 메티실린 내성 황색포도상구균이며, 2번 균주인 ATCC 25923은 메티실린 감수성 황색포도상구균이다. 또한 3번 내지 14번 균주인 DPS-1 내지 DPS-12는 원광대학교 성형외과로부터 제공받은 황색포도상구균이다.
사용한 배지와 모든 기구는 오토클레이브(autoclave)(온도 121℃, 1.3 기압에서 15분)을 사용하여 멸균시켜 사용하였으며, 균주는 ?70℃에서 보관할 수 있도록 처리하여 보관되었다.
<
실험예
2: 액체 배지 희석법에 의한 항균력의 측정 및 그 결과>
최소억제농도(MIC, Minimum Inhibitory Concentration)는 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)의 기준에 따라 실시하였다. 상기 14개 균주 중 1번과 2번 균주를 선택하였다. 이러한 2개의 균주를 뮬러 힌톤 브로드(Muller-Hinton Broth)에 현탁한 후 표준탁도액(0.5 Mcfarland standard)과 같은 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 약 1 x 108 CFU/ml 가 되도록 만들었으며, 이를 액체 배지 희석법에 의한 항균력 실험에 사용하였다.
실시예 2에 따른 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 의 뿌리, 줄기, 잎의 각 부위별 추출물을 DMSO (Dimethylsulfoxide)을 용매로 하여 최고 농도 1 mg/ml에서 최저농도 0.031mg/ml 에 이르도록 단계적으로 희석하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 주입 후 균액을 10㎕씩 첨가하였다. 이것을 배양기(incubator)에서 37 ℃ 조건으로 24시간 배양한 후, 육안으로 최소억제농도를 관찰하였다. 이 때 최소억제농도(MIC, minimum Inhibition Concentration)란 균의 생장이 억제된 최저농도를 말한다.
비교예에 따른 기존의 항생제 중 암피실린을 사용하여 본 실험의 비교예로 삼았다. 본 실험에 사용된 비교예의 암피실린 (Ampicillin)은 최고농도는 1mg/ml에서 최저농도는 0.0006 mg/ml에 이르도록 단계적으로 희석하여 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리, 줄기, 잎의 각 부위별 추출물을 배양기에서 37℃ 조건으로 24시간 배양한 후, 육안으로 최소억제농도를 관찰하였다. 이 때 사용한 용매와 DMSO는 시료의 항균력에 영향을 미치지 않는 것이다.
본 실험에 따른 항균력의 측정 결과, 실시예 2에 따른 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리, 줄기, 잎의 각 부위별 메탄올 추출물의 최소억제농도를 측정하였다. 이 중 잎에서의 실시예 2에 따른 추출물은 1번 균주인 ATCC 33591에서는 > 0.5 mg/ml, 2번 균주인 ATCC 25923에서는 >0.5 mg/ml 로 측정되었다. 또한 줄기에서의 실시예 2에 따른 메탄올 추출물은 ATCC 33591 에서 0.5 mg/ml, ATCC 25923에서 0.5 mg/ml 로 측정되었다. 또한 뿌리에서의 실시예 2에 따른 메탄올 추출물은 ATCC 33591에서 0.25 mg/ml, ATCC 25923에서 0.25 mg/ml 로 측정되었다.
반면에 비교예에 따른 암피실린(Ampicillin)은 1번 균주인 ATCC 33591에서 0.5mg/ml, 2번 균주인 ATCC 25923에서 0.00006mg/ml 로 측정되었다. 상기의 결과로 보아 본 발명에 따른 실시예 2를 암피실린을 사용한 비교예와 비교하였을 때 1번 균주에서는 본 발명에 따른 실시예 2가 우수한 항균 활성을 나타내었으며, 또한 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 잎, 뿌리, 줄기의 실시예 2에 따른 메탄올 추출물 중, 실시예 2의 뿌리 메탄올 추출물이 0.25 mg/ml 로 가장 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 이에 대한 결과는 아래 표 2에 나타냈다.
상기 실험과 동일한 방법으로 실시예 3 내지 실시예 6에 따른 1번 균주에 대한 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리 추출물의 최소억제농도를 측정하여 보았다. 측정한 결과는 아래 표 3과 같았으며, 실시예 3에 따른 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리에 대한 헥산 추출물의 항균활성이 0.125mg/ml 내지 0.25 mg/ml로 상대적으로 높은 항균활성을 보이는 것으로 확인되었다.
<
실험예
3:
체커보드(Checkerboard)법에
따른 항생제와 혼합효과 측정 및 그 결과>
상기 실험예 1에 의하여 분리된 균주 중 1번 균주와 3번 내지 6번 균주를 뮬러 힌톤 브로드(Muller-Hinton Broth)에 현탁한 후 표준탁도액(0.5 Mcfarland standard)과 같은 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 약 1 x 108 CFU/ml 가 되도록 만들었으며, 이를 액체 배지 희석법에 의한 항균력 실험에 사용하였다. 또한 상기 실험예 2에 의하여 가장 좋은 항균 활성을 보인 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리에 대한 헥산 추출물을 가지고 본 실험을 진행하였다.
균주 1번에서의 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리에 대한 헥산 추출물과 암피실린의 혼합 효과를 측정하기 위해 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리에 대한 헥산 추출물을 0.25mg/ml에서부터 최저 농도인 0.003mg/ml에 이르기까지 단계적으로 희석한 후 각각의 웰 플레이트에 가로방향으로 주입하였다. 그리고 암피실린을 1mg/ml에서 0.01mg/ml에 이르기까지 단계적으로 희석한 후 각각의 웰 플레이트에 세로방향으로 주입하였다. 그 후 1번 균주로 제작된 상기 균액을 표준탁도액(0.5 Mcfarland standard)에 맞추어 10㎕씩 첨가하였다. 이렇게 처리된 각각의 웰 플레이트를 아래 표 4에 정리하였다.
또한 3번 균주에서의 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리에 대한 헥산 추출물과 암피실린의 혼합 효과를 측정하기 위해 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리에 대한 헥산 추출물을 최고농도 0.5mg/ml에서 최저농도 0.01mg/ml에 이르도록 단계적으로 희석한 후 가로방향으로 주입하였다. 그 후 암피실린을 최고농도 0.5mg/ml에서 최저농도 0.01mg/ml에 이르도록 단계적으로 희석하여 웰 플레이트의 세로방향으로 주입하였다. 그 후 여기에 3번 균주로 제작된 상기 균액을 표준탁도액(0.5 Mcfarland standard)에 맞추어 10㎕씩 첨가하였다. 나머지 4번 내지 6번 균주에서의 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 뿌리에 대한 헥산 추출물과 암피실린의 혼합 효과에 대한 측정도 상기 3번 균주에서의 혼합 효과 측정 방법과 같은 방법으로 측정하였다.
본 실험에 따른 혼합 효과는 체커보드 딜루션(checkerboard dilution) 법을 통해 확인하고, 플랙셔널 인히비터리 콘센트레이션 인덱스(fractional inhibitory concentration (FIC) index)를 이용하여 평가하였다. 가장 효율적으로 나타난 배합농도의 결과를 하기의 수학식에 대입하여 FIC 지수(index)를 산출하여 FIC 지수(index)가 0.5보다 작거나 같을 때 상승효과 (Synergy)가 있는 것으로, 0.5~1 사이면 부분적인 상승효과(Partial Synergy)로, 1보다 클때 길항효과 (Indifferent) 로 판정하였다.
<수학식>
FIC index = FIC A + FIC B
상기 수학식에서 FIC A는 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui)의 헥산 분획추출물 및 항생제 혼합시 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 추출물의 최소억제농도 / 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 추출물의 최소억제농도로 구한다.
또한 상기 수학식에서 FIC B는 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 추출물 및 항생제 혼합시 항생제의 최소억제농도 / 항생제의 사용시 최소억제농도로 구한다.
상기 수학식에 의해 균주 1에 대하여 암피실린과 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 분획추출물을 혼합하여 사용한 경우의 항균 활성의 계산 결과는 아래와 같다.
0.248 (FIC A) = 0.031 (하기 표 5의 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 분획추출물 및 항생제 병용시 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 분획추출물의 최소억제농도) / 0.125 (상기 표 4의 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 분획추출물의 최소억제농도)
0.124 (FIC B) = 0.062 (하기 표 5의 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 뿌리의 헥산 분획추출물 및 항생제 혼합시 항생제의 최소억제농도) / 0.5 (상기 표 4의 항생제의 사용시 최소억제농도)
0.372 (FIC 지수(index)) = 0.248 (FIC A) + 0.124 (FIC B)
상기와 같은 방법으로 나머지 경우에 대하여도 혼합 사용시의 항균활성을 조사하였다. 이의 결과는 아래 표 4와 같다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
Claims (11)
- 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 항균제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물은 뿌리, 줄기, 잎에서 각각의 부위별로 추출되어 이루어진, 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 항균제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물은 물 또는 유기용매에 의해 추출된 것이고, 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 항균제 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중 1종 이상인, 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 항균제 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 오쟈와디어 레테스투이 추출물을 포함하는 항균제 조성물은 암피실린(ampicillin), 노플록삭신(norfloxacin), 시프로플록삭신(ciproloxacin), 에리스로마이신(erythromycin) 또는 니신(nisin)으로 이루어진 군 중 1종 이상의 항생제를 더 포함하고, 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 항균제 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 오쟈와디어 레테스투이 추출물과 항생제가 16:1 ~ 1:2의 중량비로 혼합되어 이루어진, 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 항균제 조성물.
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- 삭제
- 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물을 포함하는, 황색포도상구균에 대해 항균활성을 갖는 화장품.
- 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물을 포함하는, 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 오쟈와디어 레테스투이(Augouardia letestui) 추출물을 포함하는, 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 개선용 동물성 사료.
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