KR100758550B1

KR100758550B1 - 참당귀에 유도물질을 처리하여 데커신 또는 데커시놀안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR100758550B1
Application number: KR1020060076805A
Authority: KR
Inventors: 박종문; 이홍순; 조화영; 박정진; 손석영
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2006-08-14
Filing date: 2006-08-14
Publication date: 2007-09-13

Abstract

본 발명은 참당귀에 유도물질을 처리하여 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 참당귀에 유도물질인 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 처리하는 단계를 포함하는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법은 유도물질인 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 참당귀에 처리함으로써 참당귀로부터 폐암, 간암 세포 등 여러 가지 암세포에 대한 항암활성, 배뇨작용, 항부종 작용, 당뇨성 고혈압의 경감 및 신장독성 경감 등 여러 가지 질병의 치료에 효과가 있다고 알려진 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 높이는 효과가 있다.

참당귀, 데커신, 데커시놀 안젤레이트, 유도물질

Description

참당귀에 유도물질을 처리하여 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법{Method for increasing productivity of decursin or decursinol angelate by treatment with elicitor in Angelica gigas Nakai}

도 1a는 본 발명의 참당귀의 종자로부터 유도된 캘러스를 나타낸 사진이고, 도 1b는 참당귀의 엽병으로부터 유도된 캘러스를 나타낸 사진이며,

도 1c는 참당귀의 줄기로부터 유도된 캘러스를 나타낸 사진이다.

도 2는 참당귀 소식물체로부터 유도된 뿌리 조직을 배양하는 사진이다.

도 3은 온실 재배에 의해 재배된 참당귀의 성체(온전한 식물체)를 나타낸 사진이다.

도 4a는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 혼합 표준물질을 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 및 정제한 그래프이고,

도 4b는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 혼합 표준물질의 흡광도를 330nm의 자외선 파장으로 측정한 결과이다.

도 5a는 참당귀로부터 유도된 캘러스에 이스트 추출물(YE), 정제된 이스트 추출물(PYE) 또는 키틴(CH)을 처리하였을 경우, 각각의 캘러스로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양을 나타낸 그래프이다.

도 5b는 참당귀의 뿌리조직에 이스트 추출물(YE), 정제된 이스트 추출물(PYE), 키틴(CH), 메틸자스몬산(MJ) 또는 살리실산(SA)을 처리하였을 경우, 각각의 참당귀 뿌리조직으로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양을 나타낸 그래프이다.

도 5c는 참당귀의 뿌리조직에 20mg/g의 이스트 추출물 및 0mM, 1mM, 5mM, 또는 10mM의 구리이온을 각각 처리하였을 경우, 각각의 참당귀 뿌리조직으로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양을 나타낸 그래프이다.

도 6a는 온실에서 재배된 참당귀의 성체로부터 유도물질을 첨가하지 않았을 경우 생산된 데커시놀 안젤레이트를 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 및 정제한 그래프이고,

도 6b는 온실에서 재배된 참당귀의 성체로부터 유도물질인 정제된 이스트 추출물(PYE)을 처리한 후, 생산된 데커시놀 안젤레이트를 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 및 정제한 그래프이다.

도 7은 온실에서 재배된 월령 2개월과 월령 4개월의 참당귀에 정제된 이스트 추출물(PYE)을 처리함으로써 데커시놀 안젤레이트의 생산량이 증가된 것을 나타낸 그래프이다.

도 8은 정제된 이스트 추출물을 처리한 후, 참당귀 뿌리의 중량이 증가한 것을 나타낸 사진이다.

도 9는 정제된 이스트 추출물을 처리한 후, 참당귀 뿌리에서 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 비교한 그래프이다.

본 발명은 참당귀에 유도물질을 처리하여 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 참당귀에 유도물질인 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 처리하는 단계를 포함하는 참당귀로부터 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

당귀는 우리나라의 강원도와 경상도의 고랭지대에서 주로 재배되는 약용식물로서, 보혈강장 및 진통 작용을 목적으로 냉증, 빈혈, 혈행장애 및 정신증상 등의 부인과 질환에 주로 보혈청혈약으로 널리 사용되어 왔다. 당귀는 산형과(미나리과, Umbelliferae)에 속하는 2~3년생 초본식물로서, 현재 국내에서 재배되는 당귀는 참당귀(Angelica gigas Nakai)와 일본수출을 목적으로 재배되는 일당귀(Angelica acutiloba (S. et Z.) Kitagawa)가 있으며, 중국에서는 중국당귀(Angelica sinensis (Oliv.) Diels)가 주로 재배되고 있다. 이들 당귀는 그 종류에 따라 유효성분의 종류가 다른 것으로 알려져 있다. 참당귀의 주요성분은 쿠마린(coumarine)계 물질인 데커신(decursin), 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate), 데커시놀(decursinol), 노다케네틴(nodakenetin), 움벨리페론(umbelliferon), 노다케닌 (nodakenin), 베타-시토스테롤(β-sitosterol) 및 베타-유데스몰(β-Eudesmol)이 있으며, 일당귀의 주요성분은 버갑텐(bergapten), 히드로프탈리드(hydropthalid), 발레로페놈(valerophenome)이 있다. 중국당귀의 주요성분으로는 부틸이데네프탈리드(butylidenephthalide), 페룰산(ferulic acid), Z-리구스틸리드(Z-ligustillide), 히드로프탈리드(hydropthalid), 발레로페놈(valerophenome)등이 알려져 있다.

또한, 상기 당귀들 중에서 참당귀의 추출물에 대한 다양한 약리학적 연구 결과들이 알려져 있는데, 참당귀의 에테르 추출물은 토끼의 적출 장관 및 자궁에 대하여 흥분작용을 나타내며, 혈압강하 및 호흡억제 작용이 있는 것으로 보고된 바 있고(생약회지 제1권 제1호 25-32, 1970), 분리 및 정제된 데커신과 데커시놀은 토끼의 적출 장관을 마비시키고 호흡억제와 혈압을 강하하며 신장 독성 억제제 성분으로서 데커신을 포함하는 의약조성물이 대표적인 항암제인 시스플라틴의 신장독성을 효과적으로 억제할 수 있다는 내용이 보고된 바 있다(대한민국 등록특허 제98-44339호). 또한, 당뇨병 유발물질로 알려진 알로산에 의한 신장독성도 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트는 한국산 참당귀에만 존재하는 성분으로서 중국당귀와 일당귀에서는 전혀 검출되지 않았고, 그 밖의 다른 식물로부터도 추출한 예가 없다. 특히 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트는 폐암 및 간암세포 등 다양한 암세포주에 대하여 항암활성을 나타내고 암세포주에 대하여 세포독성을 가질 뿐 아니라, 단백질 키나아제 C (protein kinase C, PKC)의 효소활성을 증진시키는 작용이 밝혀져 이를 유효성분으로 함유하는 항암제의 개발 및 이를 이용한 여러 가지 질병에 대한 치료제의 개발에 관심이 대두되고 있다.

그러나 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 현재까지 시그마 등의 대규모 시약공급회사에서 판매되지 않고 있으며, 참당귀로부터의 추출이 용이하지 않아 다량의 순수한 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 확보에 어려움이 있다. 따라서 최근들어 여러 가지 약리 효과가 있다고 알려진 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 분리 및 대량 생산을 위한 여러 가지 기술들이 개발되고 있는데, 이와 관련된 종래 기술들로는 대한민국 등록특허 제0509843호에 참당귀에 에탄올을 첨가한 후 온도 차이, 용해도 차이, 초음파기 또는 냉침 방법을 이용하여 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제0385092호에는 참당귀의 뿌리를 식물생장조절제와 유도물질인 메틸자스몬산을 이용하여 배양한 후, 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 열수 추출하는 방법이 개시되어 있을 뿐이다.

이러한 상기 종래기술은 참당귀로부터 유도된 캘러스나 조직 배양을 이용하였을 뿐, 식물 자체, 즉 식물 전체를 대상으로 한 예가 없으며, 유도물질로는 메틸자스몬산을 이용한 예 밖에 없으며, 상기 메틸자스몬산은 가격이 매우 고가인 단점이 있다. 따라서 여러 가지 약리 효과를 가지고 있는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 높이기 위한 다른 방법 및 다른 유도물질의 개발이 시급한 실정이 다.

이에 본 발명자들은 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키기 위한 방법을 연구하던 중, 참당귀로부터 유도된 캘러스 및 뿌리조직을 배양하는 과정 및 식물 자체를 재배하는 과정 중에 유도물질인 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 처리한 결과, 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산량이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 참당귀에 유도물질을 처리하는 단계를 포함하는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 참당귀에 이스트 추출물(yeast extract), 정제된 이스트 추출물(purified yeast extract) 및 키틴(chitin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 유도물질을 처리하는 단계를 포함하는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 참당귀에 유도물질을 처리하는 단계를 포함하는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기 참당귀는 참당귀로부터 유도된 캘러스, 뿌리 조직 또는 식물 전체의 형태일 수 있다. 상기 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리를 말하며 대부분 유세포로 되어있다. 캘러스를 유도하기 위한 식물의 조직은 식물의 어느 부위라도 상관이 없으나 유용성분이 다량으로 축적된 부위의 조직인 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 조직은 잎, 줄기, 뿌리, 종자, 꽃잎, 근경 및 열매일 수 있다.

캘러스의 유도는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 식물의 조직 또는 이의 절편체를 조직배양용 배지에서 배양한다. 상기 배지로는 MS(Murashige & Skoog) 배지, 화이트(WHITE) 배지, B5 배지, R2 배지 등을 사용할 수 있다. 이 때 식물의 종, 식물체의 나이, 배양기관의 종류와 그의 숙도 등을 고려하여 배양하고자 하는 식물에 적합한 배지를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 배지에 생장조절제를 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 생장조절제는, 이에 제한되는 것은 아니나, IAA(3-indoleacetic acid), IAld(3-indoleacetaldehyde), IPA(3-indolepyruvic acid), IAN(3-indoleacetonitrile), IAE(ethyl ester of indoleacetic acid)와 같은 옥신(auxin) 및 그의 유도체(예: 2,4-D (2,4-dichlorphenoxy acidic acid, NAA(naphthaleneacetic acid)); 및 키네틴(kinetin), BA(benzoic acid), CPPU(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea)와 같은 사이토키닌(cytokinin) 및 그의 유도체를 포함한다.

바람직한 캘러스의 유도 및 배양방법은 먼저, 식물체의 조직 일부를 분리하여 소독한 후 탄수화물이나 아미노산과 같은 유기 성분, 질소, 인산, 칼륨과 같은 무기 양분 및 옥신과 같은 식물 호르몬을 함유한 한천 배지에서 배양한다. 얼마 후에 이 조직의 세포가 세포 분열을 하여 세포의 덩어리인 캘러스가 생기면, 배지로부터 캘러스를 분리하여 반고체 배지 위에 치상한다. 이후, 일정기간 간격으로 계대 배양한다. 이 후, 대량 생산을 위해 상기 배양된 캘러스를 아가만 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 배양한다.

본 발명의 일실시예에서는 참당귀의 종자, 엽병, 줄기 및 뿌리를 멸균처리한 후, 조직을 절단하여 식물생장조절제인 키네틴(kinetin) 및 옥신의 유도체인 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-D)이 첨가된 MS 배지 위에 각각 치상하였다. 이 후, 각 식물의 절편체로부터 생산된 캘러스를 반고체 배지에서 계대배양한 후, 액체 배지에서 현탁 배양함으로써 참당귀로부터 캘러스를 유도 및 배양하였다(도 1a, 1b 및 1c 참조).

상기 뿌리 조직은 참당귀의 소식물체로부터 유도된 뿌리 조직을 사용할 수 있으며, 뿌리의 조직배양은 당업계에 공지된 통상의 방법을 통하여 수행될 수 있다. 상기 조직배양이란 식물체를 구성하는 기관, 조직 및 세포를 식물체로부터 분리하여 적당한 배양 환경 조건을 갖춘 배지에서 무균적으로 배양하여 식물체로서의 완전한 기능을 가진 개체로 재생시키는 방법을 말한다.

본 발명의 일실시예에서는 MS 배지에 뿌리 생장을 유도하는 호르몬인 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-D; 2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 및 1-나프탈렌아세트산(NAA; 1-naphtalene acetic acid)을 첨가하여 암조건에서 배양하였다(도 2 참조).

상기 식물 전체는 참당귀 성체의 형태일 수 있으며, 종자를 파종하여 온실 재배 또는 노지 재배에 의해 수득한 것일 수 있다. 바람직하게는 참당귀의 종자를 물에 침종한 후, 파종하여 온실 내에서 재배하여 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 유도물질이란 식물체내에서 이차대사산물의 생산을 촉진하기 위하여 첨가되는 미생물의 키틴, 글루칸 또는 세포벽으로부터 얻어지는 다당체(펙틴 또는 셀룰로스) 및 당단백질 등의 다양한 생물학적 유도물질(biotic elicitor) 또는 무기물염이나 높은 pH등의 비생물학적 유도물질(abiotic elicitor)을 말한다.

상기 유도물질로는 이스트 추출물(YE; yeast extract), 정제된 이스트 추출물(PYE; purified yeast extract) 및 키틴(CH; chitin)일 수 있으며, 바람직하게는 이스트추출물 및 정제된 이스트추출물일 수 있다.

상기 이스트 추출물은 생물학적 유도제 중 복합 조성물에 해당하는 유도물질이며, 정제된 이스트 추출물은 이스트 추출물에서 유도물질로서 작용할 것으로 예상되는 다당류(polysaccharide)를 정제한 것이다. 상기 키틴은 정제된 이스트 추출물과 같이 다당류에 해당하는 생물학적 유도물질이라고 알려져 있다.

상기 유도물질은 천연으로부터 분리 및 정제된 추출물 또는 추출물을 분말화한 것을 사용할 수 있다. 즉, 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 천연으로부터 수득된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 천연으로부터 분리 및 정제한 것을 고온고압에서 멸균하여 분말화 한 것을 사용하거나 또는 상기 분말의 용액을 사용할 수 있다.

또한, 상기 유도물질은 식물체내에서 이차대사산물의 생산량을 증가시킬 수 있는 농도로 처리하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 유도물질을 참당귀의 생체중량(FCW:fresh cell weight)에 대하여 1mg/g ~ 100mg/g로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1mg/g ~ 20mg/g로 처리할 수 있고, 상기의 농도를 한번에 또는 수차례 나누어서 처리할 수 있다. 상기 유도물질의 처리 농도가 1mg/g미만일 경우, 상기 유도물질이 너무 소량 처리되어 식물체 내에 영향을 끼치지 않을 수 있고, 상기 유도물질의 처리 농도가 100mg/g을 초과할 경우에는 너무 많은 양으로 처리되어 식물체 내의 바이오매스(biomass)가 감소되거나 활성산소가 생산되어 식물체에 해로운 영향을 줄 수 있다(Margaret A. C. et al., Phytochemistry, 28, 1101-1104, 1989).

본 발명의 일실시예에서는 참당귀로부터 유도된 캘러스에 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 처리한 실험군이 유도물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 상기 캘러스로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 증가한 것으로 나타났고, 특히 이스트 추출물을 처리하였을 경우 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 대조군에 비해 월등하게 증가하는 것으로 나타났다(도 5a 참조). 또한 참당귀의 뿌리조직에 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 처리한 실험군이 유도물질을 처리하지 않은 대조군 및 기존에 유도물질로 알려진 살리실산을 처리한 것에 비해 참당귀의 뿌리조직으로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 증가한 것으로 나타났고, 특히 정제된 이스트 추출물 또는 이스트 추출물을 처리하였을 경우, 참당귀의 뿌리조직으로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 생산량이 대조군에 비해 월등하게 증가한 것으로 나타났으며, 유도물질로 잘 알려진 고가의 메틸자스몬산을 처리한 경우와 거의 유사한 양의 데커시놀 안젤레이트가 생산되는 것을 확인할 수 있었다(도 5b 참조).

본 발명은 상기 유도물질이 처리된 참당귀에 구리이온을 추가로 처리할 수 있으며, 상기 구리이온은 염화구리(CuCl₂) 또는 황산구리(CuSO₄)의 형태로 첨가할 수 있다. 바람직하게는 염화구리(CuCl₂)를 물에 녹여 이온화된 구리이온의 형태로 참당귀의 배양 배지에 첨가하여 처리할 수 있다.

상기 구리이온은 잘 알려진 비생물학적 유도물질(abiotic elicitor)로서 쿠마린계 화합물의 생합성을 유도하는데 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 특히, 채송화(Portulaca)의 세포 배양 시 상기 구리이온의 처리에 의해 베타시아닌(betacyanin)의 생산성이 1.3배 정도 높아졌으며, 해바라기에서는 쿠마린 화합물의 생산을 유도한다고 보고된 바 있다(Gutierrez et al., J. Plant Physiol. 160:1117, 2003). 또한 상기 구리이온을 처리할 때 칼슘이온은 식물체 내로 흡수되고, 칼륨이온은 배출되는 등 이온의 플럭스가 발생하며 이때 발생하는 이온 플럭스와 구리이온 간의 상호관계가 화합물의 생산을 유도하는 작용과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명의 일실시예에서는 참당귀의 뿌리조직에 이스트 추출물을 처리하고 각각 농도를 달리하여 구리이온을 추가로 처리한 후, 참당귀의 뿌리조직으로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양을 비교하였다. 그 결과, 구리이온을 처리하지 않은 경우에 비해 구리이온을 처리하였을 경우 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 증가한 것으로 나타났고, 이스트 추출물 및 구리이온을 함께 처리한 경우가 구리이온만을 처리하였을 경우보다 참당귀의 뿌리조직으로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 월등하게 증가한 것으로 나타났다(도 5c 참조).

이에 본 발명은 참당귀에 구리이온을 추가로 처리함으로써 참당귀로부터 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기에서 유도물질을 처리하는 단계는 상기 유도물질을 참당귀에 분무하는 단계, 도포하는 단계, 배양 배지에 첨가하는 단계 또는 참당귀의 식물 주변 토양에 부어주는 단계일 수 있다. 이때, 상기 유도물질이 액체 형태일 경우, 참당귀 식물의 지하부(뿌리)에 근접한 토양에 액체를 부어주거나, 지하부에 근접한 줄기에 분무할 수 있으며, 상기 유도물질이 분말 형태일 경우, 참당귀 식물의 지하부에 근접한 토양에 분말을 도포하거나, 지하부에 근접한 토양에 분말을 섞을 수 있다. 바람직하게는 캘러스에 대해서 유도물질을 캘러스 상에 도포할 수 있으며, 조직에 대해서는 배양 배지에 첨가하여 혼합하여 배양할 수 있고, 식물 전체에 대해서는 유도물질이 포함되어 있는 용액을 식물 주변의 토양에 부어줄 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 유도물질의 처리시간은 48시간 ~ 10주일 수 있다. 상기 처리시간이란 참당귀에 상기 유도물질을 분무 또는 도포한 시점, 배양 배지에 상기 유도물질을 첨가한 시점 및 참당귀의 식물 주변 토양에 상기 유도물질이 포함되어 있는 용액을 부어준 시점으로부터 본 발명의 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트를 추출하기 직전까지의 시간을 말한다. 바람직하게 상기 유도물질의 처리 시간은 캘러스 및 뿌리에 대해서 48 ~ 96 시간일 수 있고, 참당귀의 식물 전체에 대해서는 48시간 내지 10주일 수 있다.

본 발명에 따른 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트는 한국산 참당귀에서만 추출되는 이차대사산물로써 데커신은 하기 화학식 1로 표시할 수 있고, 데커시놀 안 젤레이트는 하기 화학식 2로 표시할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트는 터페노이드(terpenoid)계열의 피라노쿠마린(pyranocoumarine)으로서 분자량은 328이고, 분자식은 C₁₉H₂₈O₅이며 쿠마린 핵을 가지고 있다. 이들은 구조 이성질체로서 쿠마린 핵에 세네시오일산(senecioylic acid)이 에스터 결합에 의해 결합된 구조와 세네시오일산의 구조 이성질체인 안젤로산(angeloic acid)이 결합된 구조를 갖는다.

또한, 상기 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트는 폐암, 간암 세포 등 여러 가지 암세포에 대한 항암활성, 배뇨작용, 항부종 작용, 당뇨성 고혈압의 경감 및 신장독성 경감 등 여러 가지 질병의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 이러한 여러 가지 약리 효과가 있는 참당귀의 이차대사산물인 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트는 국내산 참당귀에서만 추출되며 대규모의 시약회사에서 판매되고 있지 않아 많은 생산량의 확보에 어려움이 있다.

따라서 본 발명에 따른 참당귀에 유도물질을 처리하여 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법은 참당귀로부터 생산되는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 양을 증가시킬 수 있다.

상기 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법은 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 참당귀로부터 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트를 추출, 분리 및 정제하는 것일 수 있다. 바람직하게는 참당귀로부터 유도된 캘러스, 조직 또는 식물 전체를 적절히 건조하여 침연(macerated)하거나 단지 건조시켜 적절한 유기용매로 추출하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 분리 및 정제 방법을 이용하여 분리 및 정제할 수 있다.

가장 바람직하게는 상기에서 기재된 방법에 따라 참당귀로부터 유도된 캘러 스, 조직 및 식물 전체에 유도물질을 처리한 후, 유도물질이 처리된 캘러스, 조직 및 식물 전체를 그대로 또는 그 건체를 사용할 수 있으며, 추출효율을 증대시키기 위해 캘러스, 조직 및 식물의 지하부 전체를 그대로 또는 그 건체를 분쇄기로 분쇄한 것을 사용할 수 있다. 건조방법으로는 양건, 음건, 열풍건조, 동결건조 및 자연건조 방법을 모두 사용할 수 있다.

상기 추출에 사용되는 유기용매로는 특별히 한정되지는 않으나 바람직하게는 탄소수 1개 내지 5개의 유기용매를 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산 및 석유에테르 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 참당귀로부터 유도된 캘러스, 조직 또는 식물 전체를 80% 에탄올로 추출하였다.

또한, 상기 분리 및 정제는 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 아세토니트릴, 메탄올 및 물이 혼합된 용매를 이동상 용매로 하여 농도구배 고속액체크로마토 그래피(HPLC)를 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 참당귀로부터 분리 및 정제된 이차대사산물인 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 정확한 정량분석은 HPLC 분석시 적당한 분석용 컬럼 및 최적의 자외선(UV) 파장을 선정함으로써 수행할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 분자량과 구조가 유사한 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트에 대한 기존의 분석 연구결과는 상기 두 화합물의 구조이성질체의 특성으로 인해 크로마토그래피 상에서 피크 분리의 해상도가 높지 않고 두 피크가 중첩되어 나오는 결과를 나타내고 있다.

그러나 본 발명자들은 본 발명의 일실시예에서 데커신 및 데커시놀 안젤레이트가 혼합되어 있는 표준물질을 역상 C18 컬럼을 이용하여 HPLC 분석을 수행하였고, HPLC 분석 시 데커시놀 안젤레이트의 최적의 자외선 파장이라고 알려진 330nm를 이용하여 수행한 결과, 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 두개의 피크를 확인하였고 상기 두 개 피크의 체류시간(retention time)은 각각 14.27분 및 17.08인 것으로 나타났다(도 4a 및 4b 참조). 이러한 결과는 기존에 두 피크의 체류시간 차이가 1분 미만인 것으로 알려진 것에 비해 월등하게 우수한 해상도를 나타내는 분석 조건임을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 상기의 방법에 따라 참당귀의 식물 전체에 대하여 유도물질을 처리하지 않은 대조군 및 유도물질인 정제된 이스트를 처리한 실험군에서 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양을 고속액체크로마토그리피로 비교 분석한 결과, 정제된 이스트를 처리한 실험군이 대조군에 비해 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양이 월등히 증가하였음을 확인하였다(도 6a 및 6b 참조).

아울러, 본 발명자들은 상기의 방법에 따라 재배된 월령 2개월 및 월령 4개월의 참당귀 성체에 정제된 이스트를 처리한 실험군 및 처리하지 않은 대조군에서 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양을 비교한 결과, 월령 2개월의 경우, 정제된 이스트를 처리한 실험군이 대조군에 비해 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양이 3배 증가한 것으로 나타났고, 월령 4개월의 경우에는 정제된 이스트를 처리한 실험군이 대조군에 비해 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양이 1.4배 증가한 것으로 나타났다(도 7 참조).

또한, 본 발명의 일실시예에서는 상기 유도물질 중, 정제된 이스트 추출물에 의한 참당귀의 뿌리 중량변화 및 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양을 비교하였다. 그 결과, 정제된 이스트 추출물을 처리한 재배지에서 재배된 참당귀의 뿌리 중량이 정제된 이스트 추출물을 처리하지 않은 곳에서 재배된 참당귀의 뿌리 중량에 비해서 증가한 것으로 나타났고(표 1 및 도 8참조), 참당귀의 뿌리에서 생산되는 데커시놀 알젤레이트의 생산량도 역시 정제된 이스트 추출물을 처리한 경우, 정제된 이스트 추출물을 처리하지 않은 경우보다 더욱 증가한 것을 확인할 수 있었다( 도 9 참조).

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

참당귀의 배양

<1-1> 캘러스 유도 및 배양

농촌진흥청에서 개량되어 신품종으로 등록된 참당귀 ‘만추’품종의 종자, 엽병, 줄기 및 뿌리를 캘러스 유도를 위한 재료로 사용하였다. 종자를 제외한 조직은 파종 후 2개월이 경과하여 본 잎이 자란 성체 중 길이 15cm 미만의 식물을 사용하였다. 치상에 앞선 멸균과정은 증류수로 재료 표면의 이물질을 씻어내고, 70% 에탄올에 담근 후 2분간 볼텍싱(vortexing)하였다. 이후, 멸균수로 3회 세척한 후 1% 차아염소산소다(NaClO) 용액에서 15분간 초음파 세척하여 살균하고, 이를 살균수로 4∼5회 충분히 씻어 물기를 제거한 다음 조직을 잘라 반고체(agar) 상태의 캘러스 유도 배지위에 치상하였다. 단, 종자의 경우 발아율을 높이기 위해 멸균 후 3일간 4℃에서 저온 처리하여 치상하였다. 상기와 같이 제조된 조직편으로부터 캘러스를 유도하기 위하여 MS(Murashige & Skoog) 기본배지(pH 5.8)를 사용하였고, 생장조절제인 2.4-디클로로페녹시 아세트산 (2,4-D; 2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 0.1 ㎎/ℓ및 키네틴(kinetin) 0.1㎎/ℓ를 첨가하였다. 이후, 유도된 캘러스는 설탕의 농도가 30g/L 로 첨가된 반고체 MS 배지에서 4주 주기로 계대 배양하였고, 동일한 조성의 액체 배지에서 현탁 배양을 수행하였다. 현탁 배양의 계대 주기는 14일이며, 배양 온도는 25℃이고, 120rpm의 속도로 교반시키면서 배양하였다.

그 결과, 상기 방법에 의해 종자, 엽병 및 줄기로부터 유도된 캘러스를 도 1a, 도 1b 및 도 1c 에 나타내었다.

<1-2> 뿌리 조직배양

뿌리 조직배양을 위해 참당귀 소식물체로부터 유도된 뿌리조직을 MS 기본 배지에 뿌리 생장을 유도하는 2,4-디클로로페녹시 아세트산 (2,4-D; 2,4-dichlorophenoxy acetic acid), 1-나프탈렌아세트산 (NAA; 1-naphtalene acetic acid)및 인돌 부틸산(IBA: indole-butylic acid) 호르몬을 첨가하여 25℃에서 15일간 암조건으로 배양하였다.

그 결과, 상기 방법에 의해 조직 배양된 뿌리 조직의 형태를 도 2에 나타내었다.

<1-3> 참당귀 식물 전체의 재배

참당귀 만추 품종의 종자를 흐르는 물에 3일간 침종한 후, 트레이에 파종하여 포항공대 온실 내에서 재배하였다. 재배 온도는 실온으로 하였으며 14시간의 명조건과 10시간의 암조건을 주기적으로 하였다. 그 결과, 상기 방법에 의해 재배된 참당귀의 식물체를 도 3에 나타내었다.

< 실시예 2>

유도물질 처리에 의한 데커시놀 안젤레이트의 생산성 향상 효과 분석

<2-1> 캘러스 및 뿌리 조직 배양 시 유도물질의 처리

참당귀의 유효성분인 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 높이기 위하여 생물학적 유도물질 중 복합 조성물인 이스트 추출물(YE; yeast extract), 상기 이스트 추출물에서 다당류만을 정제한 이스트 추출물 (PYE; purified yeast extract), 다당류에 해당하며 유도물질이라고 알려진 키틴 (CH; chitin), 식물체 내에서 효소의 작용에 의해 생산되는 신호전달 물질인 메틸 자스몬산 (MJ; methyl jasmonate) 및 살리실산(SA; salicylic acid)을 시그마에서 구입하여 사용하였다. 먼저, 상기 유도물질들 중 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 및 키틴은 물에 녹여 각각 0.1g/ml 농도의 용액을 만든 후, 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였고, 메틸 자스몬산은 97%의 메틸자스몬산 용액 11.2 ㎕를 에탄올 1ml에 희석하여 0.05M의 용액을 만든 후, 0.2μm 필터로 여과하여 사용하였으며, 살리실산은 에탄올 1ml에 0.007g을 녹여 0.05M의 용액을 만든 후, 0.2μm 필터로 여과하여 사용하였다. 상기 유도물질을 캘러스에 처리하는 방법은 상기 <1-1>의 방법으로 배양된 캘러스의 생체중량(FCW: fresh cell weight)에 대하여 20mg/g로 액상 형태의 유도물질을 캘러스 상에 균일하게 도포하였고, 도포 후 48 ~ 96시간 동안 방치하였다. 또한, 상 기 유도물질을 뿌리조직에 처리하는 방법은 상기 <1-2>의 방법으로 배양된 뿌리조직의 생체중량(FCW: fresh cell weight)에 대하여 유도물질을 20mg/g로 뿌리조직을 배양하는 배지에 첨가하여 48 ~ 96시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 유도물질을 처리하지 않은 것을 사용하였다.

<2-2> 데커시놀 안젤레이트의 추출

상기 실시예 <2-1>에서 유도물질들이 처리된 참당귀를 회수하여 진공 건조한 후 80% 에탄올 용액의 부피당 무게가 10~20 mg/ml이 되도록 한 후, 50℃에서 한시간 동안 초음파로 추출한 후, 30분간 볼텍싱(vortexing)하였다. 이 후, 상기 용액을 원심분리한 후 상등액을 수득하였다.

<2-3> 데커시놀 안젤레이트의 분석 조건 확립

참당귀로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트를 효과적으로 분석하기 위해서는 데커시놀 안젤레이트의 구조 이성질체로 알려진 데커신과의 분리가 중요하다. 이에 본 발명자들은 상기 두 물질을 효과적으로 분리하기 위하여 데커신 및 데커시놀 안젤레이트가 혼합되어 있는 표준물질(경상북도 농업기술원 신물질 연구소(의성)에서 소량 분양 받았음)을 포토다이오드 어레이 분석기(Photodiode array detector; 996, Waters, Milford, MA)가 장착된 HPLC(워터스사)를 이용하였으며, C18 역상 컬럼 (3.9 x 300mm; μBondapak, Waters)을 이용하여 분석하였다. 이동상 용매는 메탄올 및 물의 혼합용매를 농도 구배(gradient mode), 즉, 메탄올: 물의 혼합 비율을 3:7 에서 5:5로 변화시키면서 1ml/min의 유속으로 수행하였고, HPLC 분석은 자외선 파장을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 혼합 표준물질은 2개의 피크(peak)로 분리되었는데, 앞쪽에 분리된 피크가 데커신이며 뒤쪽에 분리된 피크가 데커시놀 안젤레이트로서 상기 두 개 피크의 체류시간(retention time)은 각각 14.27분 및 17.08이었다. 이러한 결과는 기존에 두 피크의 체류시간 차이가 1분 미만인 것으로 알려진 것에 비해 월등하게 우수한 해상도를 나타내는 분석 조건임을 알 수 있었다. 또한, 도 4b에서 보는바와 같이 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 330nm의 자외선 파장에서 가장 높은 흡광도를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

<2-4> 참당귀로부터 추출한 데커시놀 안젤레이트의 분석

본 발명자들은 상기 실시예 <2-2>에서 유도물질이 처리된 참당귀로부터 추출한 데커시놀 안젤레이트의 정량분석을 상기 실시예 <2-3>으로부터 확립된 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 최적의 분리 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 단, 이때 사용한 컬럼은 시마드주(shimadzu)사의 prep LC 컬럼을 사용하였다.

그 결과, 참당귀로부터 유도된 캘러스에 유도물질인 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 처리한 실험군이 상기 유도물질들을 처리하지 않은 대조군에 비해 데커시놀 안젤레이트의 생산성이 더 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 5a 참조). 또한 참당귀의 뿌리 조직에 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 처리한 경우, 대조군에 비해 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 증가 하였음을 알 수 있었고, 이스트 추출물 또는 정제된 이스트 추출물을 처리한 경우에는 시중에 고가로 판매되고 있는 유도물질인 살리실산을 처리한 경우보다 참당귀 뿌리로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 월등히 증가한 것을 확인할 수 있었으며 메틸자스몬산을 처리하였을 경우와 거의 유사한 생산량을 보였다(도 5b 참조).

<2-5> 구리 이온의 효과

본 발명자들은 참당귀로부터 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 높이기 위하여, 쿠마린계 생합성을 유도한다고 알려진 구리이온을 참당귀의 뿌리조직에 추가로 처리하여 이로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 비교하였다. 이를 위해 먼저, 상기 실시예 <2-1>의 방법과 동일하게 참당귀의 뿌리조직에 이스트 추출물을 20mg/g의 농도로 처리한 후, 염화구리(CuCl₂)를 물에 녹여 1M의 농도로 만든 다음, 상기 이스트 추출물을 처리한 뿌리조직에 각각 0mM, 1mM, 5mM 및 10mM 의 농도가 되도록 처리하였다. 48시간 후, 상기 실시예 <2-2> 및 <2-3>의 방법에 따라 각각의 참당귀 뿌리로부터 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 비교하였다.

그 결과, 구리이온을 처리하지 않았을 경우 보다 구리이온을 처리하였을 경우, 데커시놀 안젤레이트의 생산성이 증가한 것을 확인할 수 있었고, 또한 구리이온과 이스트 추출물을 함께 처리하였을 경우, 구리이온만을 처리한 경우에 비해 데커시놀 안젤레이트의 생산성이 월등히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5c 참조).

< 실시예 3>

참당귀 식물 전체에서 유도물질 처리에 의한 데커시놀 안젤레이트의 생산성 향상 효과 분석

참당귀 식물 전체에서도 상기 유도물질에 의해 데커시놀 안젤레이트의 생산성이 증가하는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 재배된 참당귀 식물 전체에 상기 실시예 <2-4>에서 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 가장 높게 증가시킨 정제된 이스트 추출물을 상기 실시예 <2-1>의 방법과 동일하게 참당귀의 생체중량(FCW: fresh cell weight)에 대하여 20mg/g로 참당귀 주변의 토양에 부어준 뒤, 48시간 동안 방치하였다. 대조군으로는 정제된 이스트 추출물을 처리하지 않은 참당귀 식물전체를 사용하였다.

상기 유도물질을 처리한 실험군 및 유도물질을 처리하지 않은 대조군의 참당귀 식물전체로부터 상기 실시예 <2-2> 및 <2-3>의 방법으로 데커시놀 안젤레이트를 추출하고 정량 분석하였다.

그 결과, 정제된 이스트를 처리한 참당귀 식물 전체로부터 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양이 정제된 이스트를 처리하지 않은 대조군으로부터 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양에 비해 월등히 증가한 것으로 나타났다(도 6a 및 도 6b).

< 실시예 4>

정제된 이스트 추출물에 의해 참당귀 식물 전체로부터 생산되는 데커시놀 안 젤레이트의 생산성 향상 효과 분석

상기 유도물질 중 정제된 이스트 추출물을 유도물질로 사용하여 상기 실시예<1-3>의 방법으로 재배된 월령 2개월 및 월령 4개월의 참당귀 식물 전체를 상기 실시예 3의 방법과 동일하게 처리하여 월령 2개월 및 월령 4개월의 참당귀 식물 전체로부터 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양을 비교 분석 하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 월렬 2개월의 참당귀의 경우, 정제된 이스트를 처리한 실험군이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양이 3배 증가한 것으로 나타났고, 월령 4개월의 경우에는 정제된 이스트를 처리한 실험군이 대조군에 비해 생산된 데커시놀 안젤레이트의 양이 1.4배 증가한 것으로 나타났다.

< 실시예 5>

정제된 이스트 추출물에 의한 참당귀의 뿌리 중량 변화 및 데커시놀 안젤레이트의 생산성 향상 효과 분석

상기 유도물질 중 정제된 이스트 추출물을 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 재배된 참당귀 주변의 토양에 부었다. 이때, 참당귀 재배지를 3구역으로 나눈 뒤, 각 군에 대해 25개체씩을 대상으로 수행하였다. 제1구역은 대조군으로 상기 유도물질을 처리하지 않았고, 제2구역에는 정제된 이스트 추출물을 생체중량당 17g/m²(재배 면적당 농도는 13g/m²이고, 이를 참당귀 뿌리의 무게로 환산하면 약 생체 중량당 17mg/g의 농도임)의 농도로 처리하였으며, 제3구역에는 상기 정제된 이스트 추출물을 생체중량당 85g/m²(재배 면적당 농도는 67g/m²이고, 이를 참당귀 뿌리의 무게로 환산하면 약 생체 중량당 85mg/g의 농도임)의 농도로 처리하였다. 상기 정제된 이스트 추출물의 처리는 2주 간격으로 4차례 처리하였고 처리한 후 10주차에 각 구역의 참당귀 개체들을 모아 지상부와 지하부(뿌리)를 분리한 후, 지하부를 흐르는 물에 씻어 흙을 제거하였다. 그런 뒤, 표면에 물기를 제거한 후 생체 중량을 측정하였다. 상기 생체 중량을 측정한 결과는 하기 표 1에 기재하였다.

또한, 상기 수득한 각 군의 참당귀 뿌리들은 상기 실시예 <2-2> 및 <2-3>의 방법과 동일한 방법을 수행함으로써 뿌리에서 생산된 데커시놀 안젤레이트의 생산량을 비교하였다.

생체 중량 측정

	중량 (g)
제1구역(대조군)	185 ± 69.5
제2구역	237 ± 80.4
제3구역	293 ± 84.9

생체 중량 측정 결과, 상기 표 1에 기재한 바와 같이, 정제된 이스트를 처리하지 않은 대조군에 비해 정제된 이스트 추출물을 처리한 제2구역 및 제3구역의 참당귀 뿌리 중량이 증가한 것으로 나타났다(도 8 참조). 또한, 제2구역보다 5배의 더 많은 양의 정제된 이스트 추출물을 처리한 제3구역의 참당귀 뿌리 중량이 월등히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 정제된 이스트 추출물이 참당귀의 뿌리 중량을 증가하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 세 구역의 참당귀 뿌리에서 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 생산량을 비교한 결과, 대조군의 참당귀 뿌리에서 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양에 비해 제2구역 및 제3구역의 참당귀 뿌리에서 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 증가한 것으로 나타났다. 특히, 제2구역에 비해 제3구역의 참당귀 뿌리에서 생산되는 데커시놀 안젤레이트의 양이 더욱 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 9 참조).

이상에서 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 참당귀에 유도물질을 처리하여 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법은 유도물질인 이스트 추출물, 정제된 이스트 추출물 또는 키틴을 참당귀에 처리함으로써 참당귀로부터 폐암, 간암 세포 등 여러 가지 암세포에 대한 항암활성, 배뇨작용, 항부종 작용, 당뇨성 고혈압의 경감 및 신장독성 경감 등 여러 가지 질병의 치료에 효과가 있다고 알려진 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 높이는 효과가 있다.

Claims

참당귀(Angelica gigas Nakai)에 이스트 추출물(yeast extract), 정제된 이스트 추출물(purified yeast extract) 및 키틴(chitin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 유도물질을 처리하는 단계를 포함하는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트의 생산성을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 참당귀에 구리이온을 추가로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 참당귀는 캘러스, 뿌리 및 식물 전체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유도물질을 참당귀의 생체중량(FCW:fresh cell weight)에 대하여 1mg/g ~ 100mg/g로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 처리시간은 48시간 ~ 10주인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유도물질을 처리하는 단계는 상기 유도물질을 참당귀에 분무하는 단계, 도포하는 단계, 배양 배지에 첨가하는 단계 및 주변 토양에 부어주는 단계로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.