JPH0379602A - 免疫刺激・抗増殖作用を有する多糖類、その製造方法及びこの物質を含有した薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は免疫刺激作用を有する多糖類、その製造方法及
びこの多糖類を含有した薬剤に関する。

［従来の技術］ 治療概念としての免疫刺激は医学においては久しく知ら
れている。一般にこれはそれ自身では抗原作用がごく僅
かであるか又は全く持たないが非特異な仕方で優先的に
身体自身の防御機構を誘発することのできる物質を投与
することと理解される。今日の知識によれば免疫防御を
刺激することのできる物質は多数あり特に各種の無機質
、例えばＡＩ（ＯＨ）　３、ＭｇＳＯ４、ベリリウム、
ミクロバクテリアを添加した植物油又は添加していない
植物油、そしてアルカロイド、セスキテルペン化合物、
ジテルペン化合物、キノン、多糖類等の一連の植物性作
用物質群を挙げることができる。免疫刺激の全プロセス
は例えばエル・チエディト他著「免疫刺激」、スプリン
ガー出版、ハイデルベルク／ニューヨーク、１９８０　
、エム・ハイデルベンガ著「多糖類の構造と免疫特異性
」、フォルトシュリッケ　デルケミ−オルグ、ナトウル
スト（Ｐｏｒｔｓｃｈｒｌｔｔｅｄｅｒ　Ｃｈｅｗ、　
Ｏｒｇ、Ｎａｔｕｒｓｔ）　４２．２８８頁（１９８２
）　；ジェー・ドレプス著「免疫薬理学」、スブリンガ
ー出版、１９８６年；ジー・ダンノ＼ルト著、セラボイ
テコン（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｌｋｏｎ）　ＬＬ　１９８
８年１１月、８５３頁；　「免疫ポテンション」、チバ
基礎シンポジウム、エルゼビル、エムステルダム、　１
９７３年；「感染症の免疫薬理学」、ジエー・ニー・マ
ジュデ、アラン・アール◆リス編、ニューヨーク、１９
８７’に詳しく記載しである。

免疫刺激物質の確かな作用様式は多くの場合今日まで決
定的には解明することができなかった。−膜内にこれら
の物質は特に、免疫能力のある細胞の機能及び／又は増
殖に対し影響を示すが、記憶反応を残さない。これは、
Ｔリンパ球とＢリンパ球と同様にマクロファージとか顆
粒球が免疫刺激物質の主なるターゲットであることを意
味する。この作用は直接的又は間接的に、例えば補体系
又はリンパ球を介し、キニン、例えばインターフェロン
、インターリューキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因
子等の生産により、そして大食球及び小食球の増殖によ
り生ずる。その際、非特異性及び特異性防御機構が絡み
合うことから、カスケード効果と幾つかの防御機構が同
時に影響し合うことが予想される。

医薬では、なかんずく混合感染治療、慢性持続性で且つ
化学療法に対して抵抗性のある細菌感染又はウィルス感
染の治療、危篤患者のその時々感染の予防、悪性疾患の
治療、そして一定の範囲内で自己免疫疾患の治療も免疫
刺激の好ましい適用範囲である。免疫刺激は細胞増殖抑
制治療の場合でもそれに伴って生ずる免疫抑制を一部補
償するために利用することができる。

各種の多糖類、特に茸及び高級植物の多糖類は免疫系の
活動を高めることができることが知られている。これら
の系列からなる最も知られた刺激剤にはα＝１．３／１
．８グルコースレンチナン及びシゾフィランがある。例
えば「感染症の免疫薬理学」、スプリンガー出版、１９
８６年参照。

欧州特許出願公開明細書第２４６０６９号により増殖抑
制特性を有するキョウチクトウ科植物の水性抽出物が知
られている。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、免疫刺激・抗増殖作用を有する新規な
多糖類、その製造方法及びこの多糖類を含有した薬剤を
提供することである。

［課題を解決するための手段］ 本出願人は意外なことにセイヨウキョウチクトウ（Ｎｅ
ｒｌｕｍ　ｏｌｅａｎｄｅｒ）の諸部分、特に葉や茎か
ら免疫刺激・抗増殖活性を有する多糖類を単離できるこ
とを発見した。

［課題を解決するための手段］ 本発明による多糖類の一つは従来知られているレンチナ
ン多糖類やシゾフィラン多糖類とは異なり事実上専らα
（ｌ→４）結合Ｄ−ガラクツロン酸単位から構成してあ
り、そのカルボキシル基は約９０％がメチル化している
。この多糖類の分子量はＨＰＬＣゲル浸透クロマトグラ
フィーで３００００〜４００００　Ｄ、好ましくは約３
５０００　Ｄであった。

更に中間生成物として得られる多糖類混合物は一般的免
疫刺激活性を有するだけでなく特に細胞増殖を抑制する
活性も持っていることが発見された。多糖類の沈降によ
って植物の抽出物から得られるこの多糖混合物は主に上
記α（ｌ→４）結合ガラクツロナン及び分子量の異なる
別のガラクツロナンを含有し、オリゴ糖も含有する。

更に低分子多糖類混合物が単離され、その分子量はＨＰ
ＬＣゲル浸透クロマトグラフィーで約２５００〜１２０
００　Ｄであった。従ってこれは免疫刺激作用を有する
従来既知の多糖類の分子量（約２００００　Ｄ）よりか
なり低い。植物セイヨウキョウチクトウの水性抽出物か
ら得られるこの多糖類混合物は分子量及び組成を異にす
る３つの下位分画を含有している。

本発明による多糖の免疫刺激作用の試験は単核系の能カ
モしてＴリンパ球、Ｂリンパ球の刺激性を測定すること
のできるインビトロ法で行われた。

この試験において意外なことに本発明による多糖類又は
多糖類混合物は特に腫瘍壊死因子の分泌を著しく高め得
ることが発見された。闘病壊死因子は誘発時マクロファ
ージにより形成され血路中に放出される。それは腫瘍防
御において重要な役割を演する。

別の試験では本発明による多糖類及びその混合物は免疫
刺激活性を示した。

本発明による多糖類を単離する出発物質としてセイヨウ
キョウチクトウの茎及び葉が適している。好ましくは葉
が用いられる。

本発明による多糖類を単離する方法は実質的に、粉砕し
た出発物質を約５倍の量の蒸留水と一部に２〜４時間、
好ましくは２．５〜３時間煮沸し次に固形部分をろ別し
抽出物を室温に冷やして再度濾過することにある。

高分子多糖類はアルコールで沈降させることにより、又
は重金属塩又は第四アンモニウム塩で錯形成することに
より、免疫刺激活性を有する中間生成物として多糖類混
合物の抽出物から得られる。多糖類は好ましくはエタノ
ールを３：１〜１：３の割合、好ましくは１：１の割合
で添加して沈降させる。少なくとも１２時間放置した後
に濾別し残留物を蒸留水中で溶解、沈降を二度繰返す。

最終的な残留物、それは再度水に溶解するが、それを場
合によっては凍結乾燥することができる。

粗分画は周知のゲルクロマトグラフィー法により例えば
バイオゲルＰ−６０カラムを利用して低分子成分と高分
子成分とに分離する。

次に高分子分画から例えばＤＥＡＥセファロ−ゼ（登録
商標）　ＣＢ−Ｂカラムを用いたイオン交換クロマトグ
ラフィーモして例えば０−１モルＮａＣ１勾配の塩勾配
で溶出（ＮａＣｌ濃度約０．２モルで本発明による多糖
類を溶出〉することにより本願発明の多糖類を単離する
。

本発明による低分子多糖類、それは混合物であるが、こ
れを単離する方法は実質的に、前記抽出工程後得られた
濾液を凍結乾燥させ、凍結乾燥した物質を蒸留水中に溶
解させ、そして蒸留水に対し透析させる（排除限界約１
００００　Ｄ）ことにある。凍結乾燥した透析物を次に
アルコール処理し遠心分離後に沈降物を周知のゲルクロ
マトグラフィー法で更に分離する。

［実施例］ 以下本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ セイヨウキョウチクトウからの高分子多糖類の単離と特
性。

多糖類の収率は出発物質の原産地及び収穫期に応じて変
化する。

以下に述べる作業は全て、他に記載がないかぎり、４℃
で実施したものである。

潅木セイヨウキョウチクトウの葉を粉砕し約５倍の量の
蒸留水で３時間煮沸した。固形部分をろ別し室温に冷や
した後更に１回濾過した。

この濾液にエタノール（９６％）を１：１の割合で混ぜ
た。この溶液を１２時間放置し、生成したゲル懸濁液を
ろ別し残物を蒸留水中に溶解した。この溶液に再びエタ
ノール（９８％）を１：１の割合で混ぜ１２時間放置し
た。生成したゲル懸濁液をろ別し残留物を蒸留水に溶か
し三回目としてエタノール（９Ｂ％）を１：１の割合で
混ぜた。少なくとも１２時間放置した後ゲル懸濁液をろ
別し残留物を蒸留水に溶解させ凍結乾燥させた。こうし
て中間生成物として粗抽出物を得た。

本発明による多糖類を製造するため低分子物質を高分子
物質から慎重に分離した。粗抽出物を水に溶かし溶液を
遠心分離し残留物をバイオゲルＰ−６０カラムに加え蒸
留水で溶出し２つの分画を得た。第１分画は分子量範囲
１７０００〜１２００００Ｄの多糖類混合物を含有して
いた。第２分画（分子盟約＜ｌ０ＧＯＯＤ）は低分子多
糖類及びオリゴ糖とその他の物質を含有していた。

本発明による多糖類はイオン交換クロマトグラフィーに
より高分子分画から例えばＤＥＡＥセファローゼ（登録
商標）　Ｃｌ３−Ｂを用いたクロマトグラフィーにより
得た。このため高分子分画を水に溶かし、ＤＥＡＥセフ
ァローゼを充填したカラム（３０ｃｍ　Ｘ　２ｃｇ＋）
に加え０−１モルＮａＣｌ勾配で溶出した。本発明によ
る多糖類は約０．２モルＮａＣｌで溶出した。それは＋
３８．１２°の旋光性（１ｍｇ／■ＩＨｚＯ，室温）を
示す。

本発明による多糖類は構造が であり、 ここに残基Ｒは平均メチル化度が約９０％であり、その
他は互いに独立して水素、アルカリ陽イオン又はアルカ
リ土類陽イオンを意味する。

更にメタノール測定と１３（、−核磁気共鳴分光学によ
り本発明多糖類の構造を調べた。この試験においてこの
多糖を構成するのはその約９０％がメチル化したＤ−ガ
ラクツロン酸単位だけであることが発見された。

過メチル化分析がこのガラクツロン酸 比を提供した［ニス・アイ・ハコモリ、生化学ジャーナ
ル（Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｌ）、（東京）５５．２０５（１
９６４）］。

過メチル化分析のＧＣ−ＭＳ結果は多糖鎖をα（１−４
）結合Ｄ−ガラクツロン酸単位が構威しそのカルボキシ
ル基の約９０％がメチル化していることを示した。α（
１−＋４）グリコシド結合以外の結合比は検出すること
ができなかった。そのことからこの多糖鎖は線形構造で
あり分枝を持たないことが判る。

この多糖を更に分析するためまず分子量を測定した。

分子量測定はＨＰＬＣゲル浸透クロマトグラフィー（Ｈ
Ｐ−ＧＰＣ）により行う。使用した）ＩＰ−ＧＰＣ系二
μボンダゲルゲル２５◆５ボンダゲルＥ５００（ワーテ
ルス社）。

緩衝系二〇、５モル燐酸緩衝液、ｐｌ！６参照物質とし
てデキストランＴＩＯ，Ｔ４０、Ｔ２Ｏ、Ｔｌｌ０　、
Ｔ２Ｏ（１０とグルコースを使用した。

この方法で確認した本発明多糖類の分子量は５ｏｏｏｏ
〜４００００　Ｄ、好ましくは約３５０００　Ｄであっ
た。

ただし分子量は適用する試験法に応じて変化し得ること
を指摘しておく。

カルバゾール試験［ティー争ビッタ、エイチーエム・ム
イル、分析生化学（＾ｎａｌｙｔ、Ｂ１ｏｃｈｅｍ４．
３８０頁（１９６２）］により本発明多糖類のウロン酸
含量を測定した。

ウロン酸含量％ １回目の試験　２回目の試験 多糖類　　　９９．９　　　　　１００本発明による多
糖類の組成を測定するためこれをＴＦＡと混ぜ、乾燥器
内で２時間Ｌ２Ｌ’Ｃで加熱した。ＴＦＡの除去後、以
下説明する薄層クロマトグラフィーを実施した。

吸着剤；　Ｎａｎｏ＝　ＤＣ（ＨＰＴＬＣ）用シリカゲ
ルＧＦ２ｓａ仕上げ板２０Ｘ　２０ｃｇｍ　（メルク社
〉。

溶媒系：ｎ−ブタノール◆アセトン・酢酸◆水（３５：
　８５：　１０：　２０）。

検出ニアニリンジフェニルアミノリン酸。

結果としてＤ−ガラクツロン酸のみ検出可能であること
が発見された。

Ｄ−ガラクツロン酸のα（ｌ→４）結合を更にペクチナ
ーゼを使って調べた。多糖類を蒸留水に溶かし、ペクチ
ナーゼと共に室温で３時間汲置した。次に薄層クロマト
グラフィーにより遊離ガラクツロン酸を検出した。

本発明多糖類の薬理作用は一般に認められたインビトロ
試験で調べた。

物質の免疫刺激作用を調べるための特定の試験方法がま
だ存在しないので、化合物又は植物抽出物が単核系の機
能状態及び能力に及ぼす影響モしてＴリンパ球、Ｂリン
パ球の刺激性を測定することのできるインビトロ法及び
インビボ法の如き方法が今日まで主に利用されている。

これらの試験で、本発明多糖類が特に腫瘍壊死因子遊離
試験で有効であることが確認された。

ＴＭＦ　（腫瘍壊死因子）は人間の場合１５７アミノ酸
からなる蛋白質である。これを誘発してマクロファージ
内に合成し血路内で運ばれる。

ＴＭＦが防御系を刺激して腫瘍細胞を殺す。ＴＭＦ試験
では被検物質を実験動物に注入する。

その後実験動物の血液中で腫瘍細胞線での壊死作用を基
にＴＭＦ：ｌａ度を測定し、被検物質の刺激作用のパラ
メータとして使用する。

この腫瘍壊死因子試験（ＴＮＦ−Ｔ）はエム・スティン
プル、ニー・ブロクシュ、エイチ・ヴアーグナー、エム
・エル、ローマンマテス、感染と免疫（［ｎｆ’ｅｃｔ
１ｏｎ　ａｎｄ　ｆｉｕｎｆｔｙ）　４Ｂ、８４５頁（
１９８４）に従って実施した。その結果を以下の表に示
す。

ＴＭＦ試験結果： 多糖類　濃度（μｇ）ＴＮＦ濃度（Ｕ／ｍ１）Ｐ８　　
　５０　　　　　　２５Ｂ Ｐ８　　　２５　　　　　　　６４ ＰＳ　　　　１２．５　　　　　　８ Ｐ　Ｓ　　　　８．２　　　　　　４ ｐｓ−本発明による多糖類 この表から読み取れるように本発明多糖類はＴＮＦ濃度
の著しい上昇を引き越し、すなわちマクロファージ中に
ＴＮＦの合成を誘発する。

中間生成物として得られる粗分画の免疫刺激作用をやは
り上記腫瘍壊死因子遊離試験で調べた。その結果を次掲
の表が示す。

ＴＮＦ−試験結果： 多糖類粗分画　濃度（μｇ）ＴＮＦ濃度（［Ｉ＃＋ｌ）
Ｐ　３　　　　　５０　　　　　　１０００Ｐ　５　　
　　　２５　　　　　　５００多糖類粗分画の免疫刺激
作用を更にプラントによる顆粒細胞試験で調べた（エル
□・プラント、ジエー・スカント、ヘマト（増補）　２
　（１９６７）。

プラント式顆粒細胞試験ではインビトロ試験により人間
の血清から得られた顆粒細胞分画により食細胞静間又は
細菌の数を顕微鏡下で測定する。本発明多糖類による食
細胞の上昇率を測定する。その結果を以下に示す。

多糖類分画［粗画分（多糖混合物）コ、濃度（ｍｇ／ａ
＋Ｉ）が１０−’　１０−３１０→１０−’　１０−６
のとき食細胞上昇値（％〉は９５．７４．７０．２．３
２表の結果が示すように、中間生成物として得られる多
糖類混合物が食細胞の著しい上昇を引き起こし、この上
昇はＴＮＦａ、１を試験で得られた刺激データと充分に
相関する。

この中間生成物は更に細胞増殖抑制作用を有する（抗増
殖作用）。

実施例２ セイヨウキョウチクトウの葉から低分子多糖類混合物又
は低分子多糖類をｔｌｉ離し特性表示する。

多糖類の収率は出発物質の原産地及び収穫期に応じて変
化する。以下に述べる作業は全て、他に記載がないかぎ
り　４℃で実施したものである。

潅木セイヨウキョウチクトウの葉を粉砕して約５倍の量
の蒸留水で３時間煮沸した。次に固形部分をろ別し室温
に冷やした後更に１回濾過した。この濾液を凍結乾燥さ
せ残留物を蒸留水に溶かし透析チューブ（分子量排除限
界：約１００００　Ｄ）内で蒸留水に対し２４時間３回
透析した。それぞれの２４時間後に透析液を蒸留水に交
換した。

本発明による多糖類混合物を製造するため透析液を凍結
乾燥させ残留物をメタノールと混ぜて震盪し１０分間３
０００ｒｐ■で遠心分離した。この過程を３回繰り返し
た。

別の分離工程において、遠心分離により得られた沈降物
を蒸留水に溶かしセファデックス（登録商標）Ｌ）Ｉ−
２０カラム（７５ｃｍ　Ｘ　２ｃｓ）に塗布し蒸留水で
溶出した。セファデックスＬＨ−２０カラムにより沈降
物を幾つかの分画に分離した。

第１分画（ＮＯＡＣ−ｎ　）は分子量約２５００〜１２
０００　Ｄの多糖類混合物を含有している。

Ｎ０ＡＣ−Ｉｆから下位分画の多糖類を単離するため、
この分画を場合によっては凍結乾燥後に蒸留水に溶かし
、セファデックス−Ｇ−５０カラム（９５ｃｍ　Ｘ　１
ｃｍ）に加え蒸留水で溶出した。このクロマトグラフィ
ーにより混合物を３つの多糖類分画に分離した。これら
の下位分画を以下ではＮ０ＡＧ　ＩＩＩ、Ｎ０ＡＧＩＶ
、Ｎ０ＡＧＶと呼ぶ。

水に溶かした多糖類分画に１５％トリクロロ酢酸を添加
することで約５〜７％の蛋白質性を取り除くことができ
る。

本発明による多糖類混合物を特性表示するため以下の試
験を実施した。

化学的試験： １、定性的糖質測定： 加水分解のため分画を２Ｎ　ＴＰＡと混ぜ、乾燥器内で
２時間１２１”Ｃで加熱した。ＴＦＡの除去後に薄層ク
ロマトグラフィーを実施した。

吸着剤：　Ｎａｎｏ−ＤＣ（ＨＰＴＬＣ）用シリカゲル
ＯＦ’２ｇ４仕上げ板２０Ｘ　２０ｃｍ　（メルク社）
。

溶媒系：ｎ−ブタノール・アセトン・酢酸・水（３５：
　　３５　：　　１０　：　　２０）　　。

検出ニアニリンジフェニルアミノリン酸。

結果として以下の糖質を検出できることが発見された。

ガラクツロン酸 アラビノース ラムノース ガラクトース キシロース グルコース ２、定量的中性糖質測定： 多糖類下位分画を加水分解し、次にアルジトールアセタ
ートに誘導化し［ニー・ビー・ブレークネイ他、炭水化
物摘要（Ｃａｒｂｏｎｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、）１１３
（１９８８）２９１１　、糖質をガスクロマトグラフィ
ーで測定した。

装置：バーキン・エルマー９００ カラム：ガラス、８ｆｔＸ２ｉＩＩ、　ＧＰ　３％５Ｐ
−２３−３０，１００／２００スベルコボルト。

温度：２１Ｏ℃。

中性糖質組成のモル比を次掲の表が示す。

画分　　　ラムノース　　アラビノース　キシロース　
ガラクトース　グルコースＮ０ＡＧＩＩ　　　　Ｏ，３
０，２０，２０，９１，０ＮＯＡＧＩＩ［１，１４，４
・・・　　　３．２　　　１．０ＮＯＡＧＩＶ　　　　
Ｏ，４３，９・・・　　　２．０　　　１．０ＮＯＡＧ
Ｖ　　　　Ｑ、２　　　　　　Ｑ、９　　　　０．３　
　０．９　　　１．（］モル比の計算はグルコースを１
．０としたもの。

３、ウロン酸の測定： ティービター、エイチ・エム・ムイル、分析生化学（Ａ
ｎａｌｔ、Ｂｌｏｃｈｃｍ、）　４．３３０頁（１９６
２）のカルバゾール試験により多糖類分画のウロン酸含
量を４０〜７０％と測定した。

４６分子量の測定： 単離した多糖類の分子量をＨＰＬＣゲル浸透クロマトグ
ラフィー（ＩＰ−ＧＰＣ）により求めた。

ＨＰ−ＧＰＣ系： μボラジルＧＰＣＢＧＡ十μボンダゲルゲル５００゜緩
衝系： ０．０５モル燐酸緩衝液ｐ　Ｈ８，０十〇、Ｌ５モルＮ
ａＣｌ。

参照物質ニ ゲルコース、マルトトリオース、マルトヘプタオース、
デキストラン硫酸５００口、デキストランＴ−１０、Ｔ
−４０、Ｔ−７０、Ｔ−１１０、Ｔ−２０００゜結果： 多糖類　　分子量（Ｄ） ＮＯＡＧＩＩＩ　　１００００−１２００ＯＮＯＡＧＩ
Ｖ　　５０００〜８００Ｏ ＮＯＡＧＶ　　２５１１０〜３５００ ５、蛋白質含量： 個々の分画の蛋白質含量をオー・エッチ・ロウリイ、生
化学ジャーナル（Ｂｌｏｌ　Ｃｈｅｗ、）、１９８（１
９５１）２６５頁に従って測定した。

この試験において多糖類混合物は蛋白質含量が約８〜１
０％であることが判明した。

旋光度： 多糖類の旋光度を旋光計（パーキン・ニルマー旋光計２
４１）を使って２０℃で測定した。

波長：　−５８９ｎｓ（Ｈａ） 濃度ｃ：ｏ、１％ 溶媒：蒸留水 多糖類は強い右旋性であることが判明した。

１２０〜１５０　＠の値が発見された。

薬理試験： 本発明による多糖類混合物の薬理作用を以下のインビト
ロ試験で調べ、本発明の多糖類混合物が特に腫瘍壊死因
子ａＭ試験で有効であることが発見された。

リンパ球形質変換試験： リンパ球形質変換試験ではリンパ球培養に３Ｈとマーク
したチミジン（ＤＮＡの１成分）を添加する。３Ｈチミ
ジンは増殖するリンパ球により吸着されてＤＮＡに組み
込まれる。ＤＮＡに組み込まれた３Ｈチミジン量はリン
パ球の増殖に比例し、多糖類の刺激作用を判定するパラ
メータとして利用することができる。

結果として次掲の表が３回の独立した測定の平均値を示
しており、多糖類混合物Ｎ０ＡＧ　ＩＩによりリンパ球
増殖のきわめて良好な刺激をこの表から読み取ることが
できる。

分画　リンパ球の刺激（％） 物質濃度（ｍｇ／ｍｌ）が以下のとき １０−’　　１０°”　　１０−”　　１０−’　　１
０（ＮＯ＾Ｇｎ　　８９　　５５　　３８　　２９　　
５４腫瘍壊死因子試験（ＴＮＦ）： 実施例１に述べたと同様に実施。

結果として、Ｎ０ＡＧｎはＴＮＦ形成にマクロファージ
をきわめて良好に刺激し、媒質■１当たり°１．５μｇ
のＮ０ＡＣＩＮが５００Ｕｓｌを超えるＴＮＦを誘発す
ることが発見された。

多糖類混合物Ｎ０ＡＧ■の免疫刺激作用を付加的にプラ
ント（エル・プラント、アイψスカント、ヘマト（増補
）　２　（１９６７）による顆粒細胞試験で実施例１に
述べたように調べた。

その結果を次掲の表（２回の独立した測定の平均値）が
示す。

分画　食細胞値％ 濃度（ｍｇ／ｇｇｌ）が以下のとき １０’　　　　１０’　　　　１０’　　　　１０’　
　　　１０’　　　　１０’Ｎ０ＡＧＩＩ　　７０　　
４０　１３０　　２１　　９９　　１８表の結果が示す
ように多糖類混合物Ｎ０ＡＧ　ＩＩはＴＮＦ遊離試験で
褐られる刺激データと十分に相関する食細胞値の著しい
上昇を引き起こす。

化学発光試験（ＣＬ−Ｔ）　　； この試験ではマクロファージと顆粒細胞の場合に試験物
質により反応性酸素化合物の生産増加が測定される。反
応性酸素化合物をルシゲニン糖の増強剤と反応させて化
学発光を生じさせる。この化学発光を測定することで免
疫系に対する試験物質の刺激作用が求められる。その結
果を次掲の表（２つの独立した測定の平均値）が示す。

分画　化学発光の上昇％ 濃度（ｉｇ／ｍｌ）が以下のとき ｌＯ°’　　１０−２１０−３１０’　　１０４１０’
Ｎ０ＡＧ■　７．２　９．１１　１．２　２４．４　−
　　７．６表から読み取れるように多糖類混合物Ｎ０Ａ
Ｇ　ｎはこの試験でも活性を示す。

本発明による多糖類又は各多糖類混合物は、化合物の製
剤として投薬することが一般には有効であるが、別々に
又は純粋物質又は製剤の混合物として投薬することがで
きる。製剤は好ましくは、 （１）本発明による多糖類又は多糖類混合物を少なくと
も１種、 （２）°好適な結合剤、担体物質及び／又は別の補助物
質を１種又は複数種、そして （３）場合によっては別の治療作用物質又はアジュバン
ト を含有した処方で行われる。

担体物質、結合剤及び／又は補助物質は、その他の製剤
成分と調和可能で、治療される有機体に不利な影響を与
えることのないよう薬学的及び薬理的に相溶性でなけれ
ばならない。

この処方には、最も適した投与経路は患者の状態による
のであるが、（皮下、皮肉、筋肉、静脈内投与を含む）
非経口投与又は経口投与に適したものも含まれる。

処方は本来薬学の分野で知られている方法を適用して行
われる。どの方法にも本発明多糖類又は多糖類混合物（
すなわち作用物質）を担体物質、結合剤及び／又は補助
物質と混合し又は化合させる工程が含まれ、その際補助
物質が付加的成分となる。処方は一般に、作用物質を液
状担体物質又は微細担体物質又はその両方と完全に混和
し、そして必要なら得られた生成物を希望する投与形状
とすることで製造される。経口投与に適した本発明によ
る処方はそれぞれ本発明作用物質を所定量含有したカプ
セル剤、カシェ剤又は錠剤等の離散千単位で、そして散
剤又は顆粒剤、溶液又は水性又は非水性液体中の懸濁液
、又は乳濁液、例えばリボゾームの形とすることができ
る。

作用物質は大丸薬又はペーストの形とすることもできる
。

錠剤は圧搾又は注型成形により製造することができ、場
合によっては通常の補助剤を１種又は複数種添加する。

非経口投与に適した処方には水性又は非水性媒質中の滅
菌注入溶液、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、そして人体を
考慮して処方を等張にする溶解物質が含まれる。更に本
発明による多糖類又は多糖類混合物は懸濁剤及び糊料を
含有していてもよい水性又は非水性媒質中の滅菌懸濁液
の形とすることもできる。処方は例えばアンプル又は密
閉した瓶の形の単一用量又は多重用量とすることができ
、又、凍結乾燥した形で保管することもでき、この場合
、投与が必要のとき滅菌した液状担体物質を例えば注入
目的に適した水を使用前に添加する必要があるだけであ
る。

投与の直前に準備する注入溶液及び懸濁液は上記種類の
滅菌した粉末、顆粒及び錠剤から準備することができる
。

本発明による製剤は前記成分と並んで当該処方に適した
別の成分も含有することができる。

例えば経口投与する製剤は種々の香味を含有していても
よい。

それぞれの投与に適した作用物質量はその都度の治療分
野に応じて変わる。一般（こ単一用量は５〜９５％の活
性成分を含有する。これζよ人間に１回投与の場合、用
量当たり非経口で【よ例えば５０μｇ　＝　１００５ｇ
　ｓ経口では１〜５００５ｇ　ｌこ亭１］当する。しか
しこの軽量は投与経路、患者の状態及び治療分野に応じ
て広い限界内で変化することがある。

以下本発明製剤の処方を幾つか例示する。

錠剤の処方 処方Ａ（錠剤）　　　　　Ｂ／錠剤 （ａ）活性成分　　　　　　２５０ （ｂ）乳糖　　　　　　　　２１０ （ｃ）ＰＶＰ　　　　　　　　　１５ （ｄ）ナトリウムスター　　　２０ チグリコレート （ｅ）　　ステアリン酸マグネシウム　　　　５００ 処方Ｂ（カプセル）　　Ｂ／カプセル 活性成分　　　　　　２５０ 予備糊化澱粉　　　　１５０ ００ 処方ＣＢ／カプセル 活性成分　　　　　　２５０ 乳糖　　　　　　　　１５０ 微晶質セルロース　　１００ ００ 処方Ｄ （ａ）活性成分 （ｂ）乳糖 （ｃ）ナトリウムスタ ーチグリコレート （ｄ）　　ステアリン酸マグネシウム −ｇ／カプセル ５０ ４３ ５ ２０ 処方Ｅ　　　　　　　　Ｂ／カプセル （ａ）活性成分　　　　　　２５０ （ｂ）　　ボ雫エチレングツコール　　　３５０処方Ｆ
（注入溶液〉 活性成分　　　　　０．２００ｇ 塩酸溶液　０．１ｍｏｌ／Ｉ　ｑ、ｓ、　ｐＨ４，０〜
７．０ 苛性ソーダ溶液０．１ｍｏｌ／ｌ　ｑ、ｓ、　ｐＨ４，
０〜７゜０滅菌 水　　ｑ、ｓ、〜１０ｍ１ 処方Ｇ 活性成分　　　　　０．１２５ｇ ｐＨ７の滅菌した無 発熱燐酸緩衝液　ｑ、ｓ、〜２５−１ 処方Ｈ “活性成分　　　　　　０．２０ｇ ベンジルアルコール　Ｏ，ｌＯｇ テトラヒドロフルフ リル・ポリエチレン舎 グリコエーテル　　　　１．４５ｇ 注入用水　　　　　ｑ、ｓ、〜３．ｏＯｍｌ処方！ 活性成分　　　　　０．２５００ｇ ソルビトール溶液　０．２５００ｇ グリセロール　　　２．００００ｇ 安息香酸ナトリウム０．００！ｙｏｇ 調味料　　　　　　０．０１２５園１ 純化水　　　　ｑ、ｓ、〜５．ＯＯＯｍｔ［発明の効果
〕 以上説明したように、本発明の多糖類は大なる免疫刺激
、抗増殖作用を有することから、−膜内免疫刺激活性を
示すだけでなく、細胞増殖を抑制する。特に腫瘍壊死因
子生成を著しく高め、腫瘍細胞増殖を制御することは極
めて重要な効果である。本発明の多糖類はセイヨウキョ
ウチクトウより得られ、籠単な操作により、高分子量の
多Ｗ類と低分子量の多糖類に分離され、治療目的に応じ
て所望組成、形状の調剤とされる。

手続補正書　（自船 平成２年８月１４日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の多糖類であって、ここに残基Ｒは平均メチル化度約９
   ０％であり、その他は互いに独立して水素、アルカリ陽
   イオン又はアルカリ土類陽イオンを意味し、ＨＰＬＣゲ
   ル浸透クロマトグラフィーで測定した分子量が３０００
   ０〜４００００Ｄである多糖類。
2. （２）糖質ラムノース、アラビノース、ガラクトース及
   びグルコースを、グルコース＝１．０として１．１：４
   ．４：３．２：１．０のモル比で含有しＨＰ−ＧＰＣで
   測定した分子量が約１００００〜１２０００Ｄである多
   糖類。
3. （３）糖質ラムノース、アラビノース、ガラクトース及
   びグルコースを、グルコース＝１．０として０．４：３
   ．９：２．０：１．０のモル比で含有しＨＰ−ＧＰＣで
   測定した分子量が約５０００〜６０００Ｄである多糖類
   。
4. （４）糖質ラムノース、アラビノース、キシロース、ガ
   ラクトース、グルコースをグルコース＝ｌ．０として２
   ．０：０．９：０．３：０．９：１．０のモル比で含有
   しＨＰ−ＧＰＣで測定した分子量が約２５００〜３５０
   ０Ｄである多糖類。
5. （５）請求項（１）〜（４）のいずれか１項記載の多糖
   類を単離する方法において、 ａ）セイヨウキョウチクトウ（Ｎｅｒｉｕｍｏｌｅａｎ
   ｄｅｒ）の部分を水中で２〜４時間煮沸し、ｂ）固形部
   分を分離し、抽出物を室温に冷やし、ろ過し、ろ液を水
   に対し分子量排除限 界約１００００Ｄで透析し、 ｃ）透析物を凍結乾燥し、凍結乾燥した物質をアルコー
   ル処理して不溶成分を分離し、 ｄ）残留物からゲルクロマトグラフィーにより分子量約
   ３５００〜１２０００Ｄの多糖類を単離することを特徴
   とする方法。
6. （６）工程ｂ）のときろ液から多糖類を沈降させ沈降物
   をろ別し溶媒に溶解させ、この溶液を場合によっては凍
   結乾燥させ次にゲルろ過によって高分子分画及び低分子
   分画を獲得し、高分子画分からイオン交換クロマトグラ
   フィーと塩勾配での溶出とにより酸性多糖類を単離する
   ことを特徴とする請求項（５）記載の多糖類の単離方法
   。
7. （７）固形分を約５倍の量の蒸留水中で煮沸する請求（
   ５）又は（６）記載の方法。
8. （８）多糖類を工程ｂ）のときエタノール（９６％）を
   １：１の割合で添加して沈降させる請求項（６）記載の
   方法。
9. （９）エタノール沈降を二度繰り返す請求項（８）記載
   の方法。
10. （１０）酸性多糖類を０−１モルＮａＣｌ勾配で溶出す
    ることにより単離する請求項（６）〜（９）のいずれか
    １項記載の方法。
11. （１１）請求項（１）〜（４）のいずれか１項記載の多
    糖類を少なくとも１種、又は請求項（５）〜（１０）の
    いずれか１項記載の方法により得られる多糖類を、薬学
    的に受け入れ可能な担体及び／又は補助物質と一緒に含
    有した製剤。