JP2007535299A - 微生物から精製した真菌類免疫調節タンパク質(fip)とその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
Lin、J. M. et al., Am J Chin Med.1993; 21(1): 59-69 Gabius、H. J. et al., Anticancer Res. 1992 5月-6月; 12(3): 669-75 Couraud P.O et al., J. Biol. Chem.1989;264: 1310-1316 Ko J.L.、Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249 Chen H.Y,他., J. Med. Mycol. 1992; 33:505-512 Lin、J. M.,et al., Am J Chin Med. 1993; 21(1): 59-69 Wasser SP(1999)、Crit Rev Immunol 19:65-96 Kino(1989)、Journal of Biological Chemistry 264(1): 472-8 Horner W.E. et al., Allergy 1993; 48:110-116 Kawagishi H., et al., Phytochemistry 1993;32:239-241 Kino K.,et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1):472-8 Romanos M.A,et al., Yeast 1992; 8: 423-488
ATGTCTGATA CTGCTTTGAT TTTCAGATTG GCTTGGGATG TTAAGAAGTT GTCTTTCGAT TACACTCCAA ACTGGGGTAG AGGTAACCCA AACAACTTCA TTGATACTGT TACTTTCCCA AAGGTTTTGA CTGATAAGGC TTACACTTAC AGAGTTGCTG TTTCTGGTAG AAACTTGGGT GTTAAGCCAT CTTACGCTGT TGAATCTGAT GGTTCTCAAA AGGTTAACTT CTTGGAATAC AACTCTGGTT ACGGTATTGC TGATACTAAC ACTATTCAAG TTTTCGTTGT TGATCCAGAT ACTAACAACG ATTTCATTAT TGCTCAATGG AACTGA
FIP-イーストとFIP-lzのコンストラクション
FIP-イーストのDNA配列は図1(I)でとFIP-lzは図1(II)でえがかれた。Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 May 15:88(10): 4084-4088. によって、DNA配列は精製された。 Natl。 Acad。 Sci。 米国。 1991 5月15日: 88(10)、: 4084-4088.
マンネンダケ免疫調節タンパク質 (J.Biol. Chem1991; 266(4)、2486-2493)をコードする知られているDNA配列によって、商品供給者(台湾のMission Biotech株式会社)からFIP-イーストとFIP-lzのフオーワードとリバースのプライマーを購入した。 PmlIとBamHIの制限部位は図2(I)と2(II)で描いたようにプライマーの両端に加えられた。 PCR反応は、必要なプライマーを得るために実行された。増幅されたプライマーは配列され、それらの配列は確認された。
現在利用できるテクニックを使用し、栄養選択マーカーとイースト転写の起源を提供するためにガラクトースプロモーター、遺伝子Ura3、および2μoriは、それぞれpYB(Yeastern Biotech株式会社、台湾)にイントロデュースされた。 新しいベクター、図4(I)に描いたのようなpYB101はBY4741またはDY150などの知られているベイカーのイーストにトランスフォームされる。pYB101とFIP-イーストおよびFIP-lzをコードするDNA配列のベクターは制限酵素のPmlIとBamHI(New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された。消化された断片は、PCR Cleaning Up Purification Kit(Viogene、台湾)を使用し、精製された。図4(II)と(III)に描いたようにそれぞれpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの精製するためにFIP-イーストおよびFIP-lzの消化された断片の三つのモルはT4 DNA合成酵素(New England Biolabs, Beverly, USA)によって消化された断片pYB101の一つのモルに結紮された。
標準のトランスフォーメーションのテクニック(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. pp: 1.82-1.84)を使用し、pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzによって大腸菌DH5αはトランスフォームされた。商業的に利用できるDNA抽出キット(Mini-M Plasmid DNA Extraction Kit, Viogene, 台湾)を使用し、トランスフォームされた大腸菌から多量のpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzが入手できた。
pYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzのBakerのイーストへのトランスフォーメーション
Bakerのイースト(BY4741およびDY150)はイーストトランスフォーメーションキット(Yeastern Biotech株式会社、台湾)を使用し、1μgのpYB101-FIP-イーストまたはpYB101-FIP-lzによってトランスフォームされた。
上で述べたトランスフォームされたイーストは、YNBDメディア(アミノ酸(Difco、イギリス)のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のブドウ糖、2%の寒天(シグマ、米国))で広げられ、培養された。 栄養欠陥型BY4741(MAT a his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0)とDY150(MAT a ura3-52 leu2-3 112trp1-1 his3-11、15、ade2-1 can1-100) を使用し、0.0024%のヒスチジン、0.0072%のロイシンおよび0.0012%のメチオニン(BY4741),または0.0072%のロイシン、0.0048%のトリプトファン、0.0024%のヒスチジンおよび0.0024%のアデニン(DY150)(シグマ、米国)は 培養の前にYNBDメディアに追加された。 このメディアは30℃で2-3日間維持された。トランスフォームされたイーストを選択するためにメディアでウラシルが供給されなかった。 ベクターpYB101-FIP-イーストとpYB101-FIP-lzの両方がウラシルをコードする遺伝子を所有している。したがって、トランスフォームされたBakerのイーストは、そのようなウラシルを所有し、ウラシルをメディアに提供しないで、生き残ることができるが、トランスフォームされなかったイーストは生き残ることができない。
取り入れられたイーストマスはPBS(シグマ、米国)でOD600nm=0.5に希釈された。 希釈されたマスは、2 X SDSサンプルバッファ(シグマ、米国)の中に溶かされ、100℃で3分間加熱された。 冷却の後に、10μlの希釈されたマスはネイチャー(1970)227(680-685)で説明されたプロトコルに従って、100ボルトでSDS-ページにかけられた。
FIPのコンストラクション
FIPのテンプレート配列は描かれ、FIP-イーストの配列は図で1(I)に描かれた。 DNA配列は例3で説明されたように精製された。 イーストBY4741はトランスフォームのホストとして選定された。
商品供給者(Mission Biotech株式会社, 台湾)からFIP-イーストとFIP-lzのフオーワードとリバースのプライマーを購入した。PCR反応は、テンプレートとしてpYB101-FIP-イースト(図4)を使用することで実行された。PmlIとBamHIのレストリクションサイトは図6(I)と(II)で描いたようにプライマーに加えられた。PCR反応は、必要なプライマーを得るために実行された。増幅されたDNAは(Mission Biotech株式会社、台湾)に送られ、それらの配列を確認した。
現在利用できるテクニックを使用し、栄養選択マーカー、イースト転写の起源、および分泌信号を提供するためにガラクトースプロモーター、遺伝子Ura3、2μoriおよびα−ファクターリーダー・シーケンス(図7で描いたように)は、それぞれpYB(Yeastern Biotech株式会社、台湾)にイントロデュースされた。新しいベクター、図8(I)に描いたのようなpYB101はBY4741などの知られているBakerのイーストにトランスフォームされる。そして、彼らの配列は(Yeastern Biotech株式会社、台湾)確認された。
実施例1で説明されたように大腸菌DH5αはpYB101s-FIPでトランスフォームされた。トランスフォームされた大腸菌からpYB101s-FIPの多量を得ることができた。
BakerのイースBY4741へのpYB101s-FIPのトランスフォーメーション
BakerのBY4741は1μgのpYB101s-FIPで実施例2で説明されるようにトランスフォームされた。
実施例2で説明された同じプロトコルによって、上で述べたトランスフォームされたイーストはYNBD寒天(0.0024%のヒスチジン、0.0072%のロイシン、および0.0012%のメチオニン)から選択された。
サンプルFIPタンパク質は例3で説明されたようにSDS-ページによって分析された。 また、ゲルは、Coomassie brilliant blue G-250(シグマ)で30分間で染められ、タンパク質バンドが明確になるまで脱色溶液(20%のメタノール、10%の酢酸)で脱色した。染色結果は図9で示される。
50mlフラスコ内でのイースト接種。
マンネンダケ免疫調節タンパク質を作り出すトランスフォームされたイーストはウエスタンブロット解析によって選択され、実施例2でのように必要な栄養と共に50mlのYNBDメディアに接種された。培養は30℃と250rpmで24時間維持された。
上で述べた50mlの培養は2000mlフラスコ中の450 ml同じメディアに接種された。培養は30℃と250rpmで24時間維持された。
上で述べた500mlの培養はブドウ糖を取り除くためにYNBメディアで二回で遠心分離され、洗われた。イースト濃度は例2のように50mlの共に必要な栄養を持っているYNBG培地(アミノ酸のない0.17%のBacto Yeast Nitrogen Base、0.5%のアンモニア硫酸塩、2%のガラクトース(シグマ、米国))で0.1OD600nmに調整された。イースト培養は25-30℃、400-500rpm、pH4.5-5.5で3日間育てられた。pH値は2MのNaOHとHCl(シグマ、米国)の必要な量を加えることによって、調整された。 発酵槽での圧力は0.2-0.4kg/cm2で維持され、40-50L/分の換気は0.2μmのフィルタで濾過された。
実施例3で発酵培養からいくつかのサンプルを取り、サンプル内のマンネンダケ免疫調節タンパク質はウエスタンブロット解析で決定した。図10で示されたように、50L発酵槽からの製品にはマンネンダケ免疫調節タンパク質がある。
総セル抽出物の精製
取り入れられたイーストマスは、PBSと共に洗われ、3回遠心された。 イーストペレットは集められ、ペレットと同じボリュームの0.4mmのガラス玉は加えられた。混合物は4℃で20秒間旋転され、1分間氷に置かれた。このステップは5回繰り返された。5分間、4℃で1,5000rpmで遠心分離した後、上澄みは総セル抽出物として使用された。
ヘパリン化末梢血が大人達から集められ、Ficoll-paque培養メディア(Amersham Biosciences)が血液サンプルに加えられた。Amershamのプロトコルによって、溶液はPMNCを切り離すために遠心された。 セルは組織培養のために24-孔のプレートの中に1 X 106セル/mlの濃度でプレートされた。各1mlの培養メディアは10%のFBS、100μg/mlのストレプトマイシン、100ユニット/mlのペニシリン、および200mM L-グルタミン酸塩のRPMI1640メディア(GIBCO、グランドアイランド(ニューヨーク)) を含む。セルは37℃で成長した後,0時間、24時間または48時間培養された。
セルは加えられた異なった濃度のマンネンダケ免疫調節タンパク質を含む24-孔のプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)の中に1 X 106セル/mlの濃度でプレートされた。セルは培養され、インターフェロンγの活性が市販のキット(R&D Systems, Minneapolis, MN)を使用することで、検査された。 結果は図11で示される。 図11では、バッチ1とバッチ2は異なった濃度のFIPの加えられたサンプルであった。 PHA(植物凝集素、Sigma)は標準の酵素結合免疫吸着検定法のテクニックを采用し、インターフェロンγの活性をテストするのに使用された (免疫学、1998年のジャーナル、161: 2114-2119) 。空白とイーストグループのインターフェロンγの活性は明確にわずかしか示さなかったが, バッチ1と2は、その中に純化したFIPがあったまたはPHAがセルに加えられ、明確なインターフェロンγの活性を示した。結果は、48時間育てられたPMNCに4μgの純化したFIPを加えると他のタンパク質を加えることより多くのインターフェロンγを誘導できることを示した。また、結果は、50L発酵方法からのサンプルがインターフェロンγの量を増加させたこと、しかもFIPの活性がイーストの結果でないことを示した。
発酵しているイーストは1:10 (v/v) 20mM PBS(シグマ)、pH6.0で溶かされた。セルは破砕機(Basic Z model (Constant System Ltd. UK))によって30Kpsiの下で破砕された。 この溶液のpHは1Mの酢酸を加えることにより、pH4-5に変更された。この溶液15分間の3000gで遠心。 上澄みは切り離され、1分間の1,2000gで、再び遠心分離された。この上澄みの10mLはCM Sepharoseカラム(Amersham Biosciences)の30mLに加えられた。このカラムは20-50 mM酢酸によって平衡され、pH4-5を維持した。 20-50 mM酢酸溶液、pH4-5および洗浄したマンネンダケ免疫調節タンパク質を加えた。
食物添加物としてのマンネンダケタンパク質の応用
マンネンダケタンパク質の毒性試験
5.9gの平均重量と7.25cmの平均長さがあるグルーパーは25℃と33ppt塩度で集められた。純化したFIPは実施例9のように5、1、0.25 μg/魚/0.1mlの濃度で腹内により、若いグルーパーに投予された。PBS溶液がコントロールグループに投予された。これらの魚は14日間オリジナルの流水で成長した。魚の死亡率は毎日記録された。死亡は全く最初の2週間で観察されなかった。したがって、上の濃度でのFIPはグルーパーに少しの毒性も示さなかった。
FIPでグルーパーの原腎臓セルを処理するのによる非特異免疫反応の生体外の増進
市場から600グラムのグルーパーを購入した。原腎臓セルは培養され、そして食細胞が標準の培養のテクニックを使用することで切り離された。原腎臓セルはグルーパーの非特異免疫反応に影響する主なセルである(Engelsma MY, Fish Shellfish Immunol. 2003 Nov;15(5):397-410)。これらのセルはAL-10培養溶液(L15(Gibco): AIM5(Gibco)=1:1)に混濁され、そして0.1mlは96孔プレート(コーニング)に107/mlの濃度で接種された。 このプレートは25゜Cで2時間維持された。
グルーパーは前の実験で言われたようにPBSまたはFIPの腹内によって投与された。 3週間の成長後、0.1mlの10,000 x TCID50のウイルスの投与量をこれらの魚の腹膜に与えた。魚の死亡率は毎日記録された。一般に、イリドウイルスの腹内による投与されたグルーパーは2週間で死んだ。 図14で示されるように、FIPの最も高い投与量、5μg FIP/魚/0.11mlで投与された魚は2週間後に70%の死亡率を示した。したがって、30%の保護率が2週間で達成された。
100匹のグルーパー(Epinephelus malabevicus、52.9gの平均重量)は5つのグループに分かれた。 各グループは20匹のグルーパーを含んだ:
1. PBSのコントロール;
2. 20mgのオリジナルのイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
3. 20mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
4. 4mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
5. 0.8mgのFIPを含むイースト/60g体重を食べさせたグルーパー;
FIPまたはDer pの刺激
脾臓セルがDer p(イエダニDermatophagoides抗原(Der pII))の感作したBalb/cネズミの2つのグループから集められた。 FIPグループのネズミは2日間あたり2μgのFIPを飼われた。 Der pグループのネズミは、1日目と7日目にDer Pを腹内で投与され、14日目にDer pでスプレーした。 ネズミは15日目に殺され、脾臓セルは集められた。
Claims (30)
- 以下の核酸配列を含む真菌類免疫調節タンパク質をコードする単離した核酸分子:
ATGTCTGATA CTGCTTTGAT TTTCAGATTG GCTTGGGATG TTAAGAAGTT GTCTTTCGAT TACACTCCAA ACTGGGGTAG AGGTAACCCA AACAACTTCA TTGATACTGT TACTTTCCCA AAGGTTTTGA CTGATAAGGC TTACACTTAC AGAGTTGCTG TTTCTGGTAG AAACTTGGGT GTTAAGCCAT CTTACGCTGT TGAATCTGAT GGTTCTCAAA AGGTTAACTT CTTGGAATAC AACTCTGGTT ACGGTATTGC TGATACTAAC ACTATTCAAG TTTTCGTTGT TGATCCAGAT ACTAACAACG ATTTCATTAT TGCTCAATGG AACTGA。 - 一つのデリバリーのシステムで発現される他の遺伝子に結紮される請求項1に記載の単離した核酸分子。
- 請求項1に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項2に記載の結紮された核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項3または4に記載のベクターでトランスフォームしたホスト細胞。
- バクテリア、真菌セルまたはイーストセルである請求項5に記載のホスト細胞。
- Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis, Candida boidinii, Candida maltosa, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidentalis, Schizosaccaromyces pombe, Torulopsis, Arxula adeninivorans, or Aspergillus (A. nidulans, A. niger, A. awamori, A. oryzae) or Tricoderma (T. reesei)である請求項5に記載のホスト細胞。
- イーストはSaccharomyces cerevisiaeである請求項5に記載のホスト細胞。
- 完全または破砕したフォームである請求項5に記載のホスト細胞。
- この発明のタンパク質を分泌することができる請求項5に記載のホスト細胞。
- 哺乳動物、魚、甲殻類、および家禽から成るグループから選択された対象に投与される請求項5に記載のホスト細胞。
- 投与が静脈内、腹内、口服、粘膜、皮膚吸着または液内の浸入を含むグループから選択されるルートによるのである請求項11に記載のホスト細胞。
- ルートは口服によるのである請求項11に記載のホスト細胞。
- 哺乳動物はブタであり、家禽は鶏である請求項11に記載のホスト細胞。
- 魚は、グルーパー、サケまたはマスである請求項11に記載のホスト細胞。
- 甲殻類が、エビ、ロブスター、Penaeus monodon、Penaeus japonicusまたはPenaeus vannameiである請求項11に記載のホスト細胞。
- 真菌類免疫調節タンパク質のあるホスト細胞の中でタンパク質を発現する方法であって、(a)ホスト細胞が好ましく挿入したFIPヌクレオチド配列を持っている発現ベクターのコンストラクション、(b) ベクターによるホスト細胞のトランスフォーム、そして(c)発現のための適切な条件のもとでホスト細胞を培養することを含む方法。
- 改良されたFIPヌクレオチド配列が請求項1に記載の核酸配列である請求項17に記載の方法。
- ステップ(a)と(b)におけるホスト細胞がSaccharomyces cerevisiaeである請求項17に記載の方法。
- ステップ(b)におけるベクターがpYB101-FIP-イーストである請求項17に記載の方法。
- 請求項17に記載の方法によって精製した真菌類免疫調節タンパク質、および請求項17に記載の方法でトランスフォームしたホスト細胞から分離した真菌類免疫調節タンパク質。
- 前記ベクターでトランスフォームしたホスト細胞からのFIPを純化する方法であって、以下のステップ:
(a) 溶剤の中に発酵した細胞を溶解する;
(b) セルを破砕させる;
(c) 溶液のpHを4〜5に調整する;
(d) セル抽出物内の残骸を分離する;
(e) 上澄みを遠心する;
(f) 上澄みをpH4〜5で平衡したカラムに加える;そして
(g) マンネンダケ真菌類免疫調節タンパク質を洗浄する
を含む方法。 - マンネンダケ真菌類免疫調節タンパク質の洗浄はpH4〜5の20-50mM酢酸の添加による請求項22に記載の方法。
- 真菌類免疫調節タンパク質を含む、口服ルートによる免疫活性の調節における使用ための組成物。
- 真菌類免疫調節タンパク質が自然なマンネンダケまたは請求項21に記載の真菌類免疫調節タンパク質から精製したのである請求項24に記載の組成物。
- 炎症と過敏性を減少させるための化粧品用途に応用される請求項24に記載の組成物。
- 炎症と過敏性の減少、免疫活性の調節、糖尿病の予防、喘息の改良、バクテリアとウイルス性の感染に対する反応の増加、臓器移植に対する免疫反応の減少するための薬物用途に応用される請求項24に記載の組成物。
- 長生きさせるための食物および食物添加物、免疫活性の調節、食事変更の増加とストレスの減少のために応用される請求項24に記載の組成物。
- 対象に対する真菌類免疫調節タンパク質またはFIP融合タンパク質の口服を含む免疫活性を調節する方法。
- 前記タンパク質が大腸菌またはSaccharomyces cerevisiaeから精製される請求項29に記載の方法。
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