KR20060090807A

KR20060090807A - 미생물을 이용하여 제조된 진균성 면역조절 단백질(ｆｉｐ)및 그 용도

Info

Publication number: KR20060090807A
Application number: KR1020067005474A
Authority: KR
Inventors: 쥔-리앙 코; 유-루 황; 즈-치 첸; 쉬-웨이 훙; 호-룽 지앙; 칭-룽 후; 청-춘 관; 쉬엔-주 저우
Original assignee: 이스턴 바이오텍 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2004-09-14
Publication date: 2006-08-16
Also published as: TW200817021A; WO2005040375A9; JP2007535299A; KR100888850B1; US20090042776A1; EP1666592A4; CN1863912A; CN100462437C; TWI351963B; TW200512292A; EP1666592A1; TWI328038B; US8163519B2; WO2005040375A1

Abstract

본 발명은 진균에서 보다 잘 발현되는 진균성 면역조절 단백질(FIP)을 코딩하는 개선된 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주, 본 발명의 단백질을 상기 형질전환 숙주에서 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 본 발명의 단백질, 본 발명의 단백질을 포함하는 상기 숙주의 용도 및 FIP 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 광범위한 면역조절 활성을 가진다. 따라서, 본 발명은 화장품 또는 약학적 조성물에서의 본 발명의 단백질의 용도 및 본 발명의 단백질을 포함하는 식품 또는 사료 첨가제에 관한 것이다. 끝으로, 본 발명은 개체에게 FIP 또는 FIP가 융합된 단백질을 경구 투여함으로써 면역 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

영지, 면역조절 단백질

Description

미생물을 이용하여 제조된 진균성 면역조절 단백질(ＦＩＰ) 및 그 용도{A FUNGAL IMMUROMODULATORY PROTEIN PRODUCED BY MICROORGANISME AND USES THERE OF}

본 발명은 진균에서 보다 잘 발현되는 진균성 면역조절 단백질(FIP)을 코딩하는 개선된 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환시킨 숙주, 본 발명의 단백질을 상기 형질전환 숙주에서 발현시키는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 본 발명의 단백질, 본 발명의 단백질을 포함하는 상기 숙주의 용도 및 FIP의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 광범위한 면역조절 활성을 가진다. 따라서, 또한 본 발명은 화장품 또는 약학적 조성물에서의 본 발명에 따른 단백질의 용도 및 본 발명의 단백질을 포함하는 식품 또는 사료 첨가제에 관한 것이다. 끝으로, 본 발명은 개체에게 FIP나 FIP와 융합된 단백질을 경구 투여함으로써 면역학적 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

진균의 자실체 및 균사체로부터 유래된 렉틴(lectin)은, 자유 라디칼을 제거할 수 있는 것으로 제시된, 면역조절 효과 및 간보호 효과를 가지고 있다(Lin J. M. et al., Am J Chin Med. 1993; 21(1): 59-69). 겨우살이에서 유래된 (L)-갈락토시드-특이 렉틴은 생체내 및 시험관내에서 사이토카인 생성을 증강시킨다(Gabius H. J. et al., Anticancer Res. 1992 May-Jun;12(3):669-75). Balb/C 마우스를 질 병 모델로서 사용한 실험에서, 렉틴 및 재조합 렉틴이 종양 형성을 저해할 수 있는 것으로 보고되었다(Couraud P. O. et al., J. Biol. Chem. 1989; 264: 1310-1316).

불로초속(Ganoderma) 식물은 귀하고 유용한 한약재 식물이다. 중국에서는 5,000년에 넘게 "링지(Ling Zhi)"로 알려져 있다. 불로초속 식물로는 영지(G. lucidum(red)), 잔나비불로초(G. applanatum (brown)), 쓰가불로초(G. tsugae (red)), 가노더마 시넨스(G. sinense (black)), 및 말굽버섯(G. oregonense (dark brown))을 포함하여 여러종이 있다.

영지(링지 또는 레이시(Reishi)), 풀버섯(Volvariella Volvacea)(중국 버섯), 팽이버섯(Flammulina Velutipes)(금침 버섯)과 같은 식용성 진균으로부터 유래된 몇종의 단백질들은, 유사한 아미노산 서열 및 면역조절 기능을 공통적으로 가지고 있다. 이러한 단백질을 진균성 면역조절 단백질(FIP)라고 한다(Ko J. L., Eur. J. Biochem. 1995; 228:224-249). 한의학에서 영지는 모든 건강 식품들 중에서도 가장 많이 연구된 진균이다.

영지는 항-알레르기 효과(Chen H. Y et al., J. Med. Mycol. 1992; 33: 505-512), 간보호 효과(Lin J. M. et al., Am J Chin Med. 1993;21(1): 59-69), 항암 효과(Wasser SP (1999), Crit Rev Immunol 19: 65-96) 및 면역학적 이점(Kino (1989), Journal of Biological Chemistry 264(1): 472-8)을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 영지는 가공하지 않은 물질 형태(Horner W. E. et al., Allergy 1993; 48: 110-116)나, 또는 작은 분자 형태(Kawagishi H., et al., Phytochemistry 1993; 32: 239-241)로서 한정적으로 사용되고 있다.

영지에서 분리된 FIP인, LZ-8(영지-8)은 전신성 과민증에 긍정적인 효과를 나타낸다(Kino K. et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1): 472-8). LZ-8은 간암 치료와 당뇨병 예방에 사용되고 있다(Kino K. et al., J. Biol Chem. 1989; Jan 5; 264(1): 472-8). LZ-8 및 팽이버섯에서 분리된 다른 면역조절 단백질인 FIP-5는 유사한 아미노산 서열을 가지며, 면역글로불린의 중쇄와 유사한 폴딩 구조를 가진다. 또한, LZ-8의 발현 증강에 의해, 이들 단백질들이 면역조절 활성을 나타내며 전신성 과민증 환자들에서 긍정적인 효과를 보인다는 것이 입증되었다(Ko J. L., Eur. J. Biochem. 1995; 228: 224-249).

빵 효모는 전통 식품 가공(예, 빵 및 와인)에 널리 사용되는 안전한 미생물이다. 빵 효모는 유전학, 생리학 및 분자생물학을 연구할 수 있는 전형적인 모델 생물이다. 또한, 빵 효모의 안정성으로 인해, 히루딘(Hirudin), 헤모글로불린, 유로키나제(Urokinase), 인간 혈청 알부민(HSA), 인슐린계 성장 인자 1(IGF-1), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), B 형 간염 백신 등의 단백질계 약물 생산에 성공적으로 활용되고 있다(Romanos M. A. et al., 효모 1992; 8: 423-488). 지정된 단백질 생산에 사용되는 적절한 숙주인 효모는, 발현되는 단백질의 발현 양상에 따라 선택된다. 예컨대, 식품 및 단백질계 약물 생산에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용할 수 있다.

현재, LZ-8는 복잡하고 시간 소모적인 제조 과정(예, 추출, 미국 특허5,334,704)을 거쳐 영지에서만 오로지 수득할 수 있다. 영지에 대한 수요는 엄청나지만, 천연 영지는 드물며, 험한 산중의 고목에서만 생육한다. 따라서, 고품질 의 불로초속 식물을 지속적으로 공급하기 위한 기술이 요구되고 있다. 현재, 이용가능한 LZ-8을 대량 생산할 수 있는 방법이 없는 실정이다.

이전 연구에서 제시된 방법(미국 특허 5,334,704)을 이용한, 추출 및 정제에 의한 영지의 면역조절 단백질을 생산하는 방법은, 효율성이 낮고 비용이 많이 든다. 영지 면역조절 단백질을 생산하기 위해 대장균(E. coli)을 이용한 다른 방법은, 내독소가 오염될 수 있으며 정제 과정에 여전히 비용이 많이 든다. 영지 면역조절 단백질을 생산하기 위해 포유류 세포를 이용하는 방법은, 고가의 배지가 요구되며, 바이러스 또는 프리온 오염 가능성이 있다.

미국 특허 5,334,704는, 불로초속 식물로부터 분리된 당단백질이 면역억제 활성을 가지고 있음을 개시하고 있다. 당단백질의 제조 방법은, 불로초속 식물의 균사체를 배양하는 단계, 배양된 균사체를 수계 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출물로부터 표적 단백질을 정제하는 단계로 이루어져 있다. 진균을 배양하고 진균으로부터 표적 단백질을 정제하는 특허 기술은, 고비용이 요구되는 기술로, 시험관내에서 미생물을 배양하는 것 이상으로 훨씬 더 복잡할 뿐만 아니라 산업화하기 어렵다.

발명의 개시

본 발명은 도 1(I)에 기재된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 벡터 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 FIP를 포함하는 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 FIP를 제공한다.

또한, 본 발명은 FIP를 포함하는 숙주세포의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 상기 숙주 형질전환체로부터 FIP를 정제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 FIP를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 화장품, 의약품, 식품 및 사료 첨가제로 적용될 수 있다.

또한, 본 발명은 개체의 면역학적 활성을 조절하기 위하여 FIP 또는 FIP가 융합된 단백질을 개체에게 경구 투여하는 방법을 제공한다.

발명의 상세한 설명

빵 효모와 영지 둘다 진균에 속하므로, 효모는 영지 유래 이종 단백질 발현시 영지와 유사하는 단백질 수정(예, 당화 및 이황화 결합 형성)을 수행하는 것으로 기대된다.

본 발명은 아래 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다:

또한, 본 발명은 상기 핵산 서열에 추가적인 분비 신호 서열이 연결된 것을 제공한다. 따라서, 신규의 연결 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포에서 발현된 FIP는 세포외액으로 직접 분비되어 저비용으로도 숙주세포에서 용이하게 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 다른 유전자와 연결하여 제조할 수 있는 연결 유전자를 제공한다. 여러가지 단백질로 구성된 융합 단백질을 제조하여, 두 가지 성분의 단백질의 부가적인 생물학적 기능을 제공한다(Weisbart RH, Cancer Lett. 2003; 195(2): 211-9). FIP는 소화계에서 흡수될 수 있으므로, FIP를 다른 단백질과 융합시킴으로써, FIP를 표적 생물에 다른 단백질을 전달하기 위한 전달 시스템으로서 사용할 수 있다. 상기 융합 단백질의 경구 투여로, 표적 생물에 상기 융합 유전자를 이루는 두가지 유전자 성분에 따른 이점들을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 숙주세포에 형질전환될 수 있다. 상기 벡터는 여러가지 용도 및 조건에 따라, 원형 플라스미드(circular plasmid) 또는 통합성 플라스미드(integrated plasmid)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 세균, 진균 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 무손상 형태 또는 파괴된 형태(disrupted form)일 수 있다.

바람직한 숙주 세포의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccaromyces pombe), 토룰롭시스(Torulopsis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans), 아스퍼질러스(아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(A. niger), 아스퍼질러스 아와모리(A. awamori), 아스퍼질러스 오리제(A. oryzae)), 또는 트리코더마(트리코더마 리세이(Tricoderma reesei))가 있다. 또한 식물 유래 세포 역시 숙주 세포의 바람직한 예이다.

또한, 본 발명은 FIP를 가지는 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은, (a) 개선된 FIP 핵산 서열 삽입체를 가지는 발현 벡터를 구축하는 단계, (b) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계 및 (c) 상기 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 단백질의 바람직한 예는 도 3에 나타나 있다. 바람직한 숙주 세포의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애, 피키아 파스토리스, 한세뉼라 폴리모르파, 칸디다 유틸리스, 칸디다 보이디니, 칸디다 말토사, 클루이베로마이세스 락티스, 야로이야 리폴리티카, 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스, 쉬조사카로마이세스 폼베, 토룰롭시스, 아르술라 아데니니모란스, 아스퍼질러스(아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 오리제, 또는 트리코더마(트리코더마 리세이)가 있다. 또한 식물 유래 세포 역시 숙주 세포의 바람직한 예이다. 상기 단계 (b) 및 (c)에서, 가장 바람직한 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애이다. 상기 단계 (b)의 벡터는, 도 4(II,III)의 pYB101-FIP-효모 또는 pYB101-FIP-lz이다. 진균에서 더 잘 발현되는 FIP 코돈(도 1(I))은, 이의 높은 tRNA 번역 효율을 고려하여 선택한 것이다(Sorensen MA, Pedersen S. J Mol Biol. 1991; 222(2):265-80).

또한, 본 발명은 FIP를 포함하는 숙주 세포의 용도를 제공한다. 예컨대, FIP를 포함하는 무손상 효모를 경구 투여할 수 있으며, 숙주로부터 상기 단백질 정제과정을 거치지 않고 표적 생물에 섭취될 수 있으며, 그로 인해 이용 단가를 낮출 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 상기 숙주세포에서 FIP를 정제하는 방법으로 제공하며, 상기 방법은 (a) 발효된 용매에 숙주 세포를 용해시키는 단계, (b) 세포를 파괴하는 단계, (c) 상기 용액의 pH를 4-5로 조정하는 단계, (d) 세포 추출물내 파편들을 분리하는 단계, (e) 상층액을 원심분리하는 단계, (f) 상기 상층액을 pH 4-5로 평형화시킨 컬럼에 가하는 단계 및 (g) 영지 면역조절 단백질을 용출시키는 단계를 포함한다. 특히, 상기 방법은, (a) 발효된 효모를 5-50 mM PBS(Sigma)에 1:5 - 1: 20(v/v)로 용해시키는 단계, (b) 세포 추출물내 세포를 파괴기로 파괴하는 단계, (c) 상기 용액을 pH4-5로 조정하는 단계; (d) 상기 용액을 3000 g로 15분간 원심분리하여 파편들을 분리하는 단계, (e) 상층액을 다시 12,000 g에서 1분간 원심분리하는 단계, (f) 상기 상층액을 pH 4-5로 평형화된 CM 세파로스 컬럼(Amersham Biosciences)에 가하는 단계 및 (g) 20-50 mM의 pH4-5 아세트산을 가하여 영지 면역조절 단백질을 용출시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 본 발명의 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 FIP 또는 FIP를 포함하는 숙주 세포를 개체에 투여하는 경로에 관한 것이다. 투여 경로는 정맥내, 복막내, 경구, 점막, 피부 흡수 또는 그외 이용가능한 경로로부터 선택될 수 있다. 바람직한 경로는, 경구 투여이다. 예컨대, FIP를 포함하는 숙주 세포는 용액내 침지될 수 있으며, FIP는 어류의 아가미를 통해 어류에 흡수될 것이다.

FIP 또는 FIP를 포함한는 숙주 세포로 투여될 수 있는 개체의 바람직한 예는, 포유류, 어류, 갑각류 및 가금류이다. 바람직한 포유류 및 가금류는 각각 돼지 및 닭이다. 바람직한 어류는 그루퍼(Grouper), 연어 및 송어이다. 바람직한 갑각류는, 새우, 바닷가재, 홍다리얼룩새우(Penaeus monodon), 보리새우(Penaeus japonicus) 또는 백새우(Penaeus vannamei)이다.

또한, 본 발명은 진균성 면역조절 단백질을 포함하는 면역학적 활성 조절에 사용되는 경구용 조성물에 관한 것이다. 상기 진균성 면역조절 단백질은 천연 영지 또는 본 발명의 방법에 따른 진균성 면역조절 단백질로부터 제조된다. 본 발명에 따른 단백질의 기능 연구에 따라, 상기 조성물은 염증 및 과민증 감소, 면역 활성 조절, 당뇨병 예방, 천식 개선, 세균 및 바이러스 감염에 대한 면역 반응 조절, 기관 이식에 대한 면역 반응 조절용 약학적 용도로 적용될 수 있으며, 생명 연장, 면역학적 활성 조절, 사료 효율(feed conversion, 즉, 체중으로 전이되는 사료 중량 비) 증가 및 스트레스에 의한 염증과 같은 음성적인 면역 반응 조절용 식품 또는 사료 첨가제로 적용될 수 있다(Black PH, Brain Behav Immun. 2003 Oct;17(5):350-64).

또한, 본 발명은 FIP를 개체에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 면역 질환의 조절 방법을 제공한다. 상기 단백질은 E. Coli 또는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 진균으로부터 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 약용 식품(예, 영지), 식품, 음료, 화장품, 사료 첨가제 또는 약물내 FIP의 함량의 측정하기 위한, 웨스턴 블롯(western blot) 또는 효소면역측정법(enzyme-linked immunoabsorbant assay, ELISA)과 같은 면역 분석법을 제공한다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Ed., pp: 18.60-18.75).

본 발명의 단백질을 포함하는 조성물은 제형 타입에 따라 당업계에 일반적인 다른 물질을 함유할 수 있다. 예컨대, 경구 투여에 적합한 제형들은, 감미료, 증점제 및 향료와 같은 다른 성분을 함유할 수도 있다.

본 발명의 단백질을 포함하는 조성물의 적절한 조성은, 질병의 종류, 심각도 및 단계에 따라 결정될 수 있으며, 여러가지 사항에 따라 변경될 수 있다.

도 1은 (I) 사카로마이세스 세레비지애, FIP-효모에서 발현된 개선된 FIP 코돈 및 (II) 영지버섯 FIP-lz에서 발현된 천연형(original) FIP 코돈을 나타낸다.

도 2는 (I) 사카로마이세스 세레비지애, FIP-효모의 개선된 코돈에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 및 (II) 영지버섯 FIP-lz의 천연형 코돈에 대한 정방향 및 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열과 제한효소 부위를 나타낸다.

도 3은 영지버섯, 쓰가불로초 및 팽이버섯에서 발현된 FIP 아미노산 서열을 비교한 것이다. 동일한 아미노산은 굵게 표시되어 있다.

도 4는 (I) pYB101, (II) pYB101-FIP-효모 및 (III) pYB101-FIP-lz의 플라스미드 구축 맵을 나타낸 것이다.

도 5는 (I) pYB101-FIP-효모 또는 (II) pYB101-FIP-lz로 형질전환된 효모(DY150 또는 by4741)에서 발현된 FIP의 양을 나타낸 것이다. M: 분자량 175, 83, 62, 47.5, 32.5, 25, 16.5 및 6.5 Kd의 표준 단백질. S: 형질전환된 E. Coli로부터 제조된 표준 FIP. 레인 1-2: pYB101-FIP-효모로 형질전환된 Dy150 효모 No.1-2. 레인 3-4: pYB101-FIP-효모로 형질전환된 By4741 효모 No.1-2. 레인 5-6: pYB101-FIP-lz로 형질전환된 By4741 효모 No.1-2. 레인 7-8: pYB101-FIP-lz로 형질전환된 Dy150 효모 No.1-2.

도 6은 FIP의 (I) 정방향 프라이머 및 (II) 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열 및 제한효소 부위를 나타낸다.

도 7은 pYB101s 및 pYB101s-FIP 제조에 사용된 알파-인자 리더 서열의 뉴클레오티드 및 제한효소 부위를 나타낸다. 상기 제한효소 부위는 굵은체로 표시한다. 알파-인자 리더 서열의 시작 부분과 FIP 유전자는 화살 표시되어 있다.

도 8은 플라스미드 (I) pYB101s와 (II) pYB101s-FIP의 구축 맵이다.

도 9는 pYB101s-FIP로 형질전환된 효모 By4741에서 발현된 FIP의 양을 나타낸 것이다. M: 분자량 175, 83, 62, 47.5, 32.5, 25, 16.5 및 6.5 Kd의 표준 단백질. S: 형질전환된 E. Coli에서 제조한 표준 FIP. 레인 1-3: pYB101s-FIP-효모로 형질전환된 By4741의 1일째, 2일째 및 3일째 배양물.

도 10은 FIP를 포함하는 효모의 50 L 발효물로부터 수득한 샘플의 웨스턴 블롯이다. M: 표준 단백질. S: E. Coli에서 제조한 표준 FIP.

도 11은 여러가지 방법으로 제조된 다양한 농도의 FIP와 함께 배양한 말초 혈액 세포(PBL)로부터 생산된 INF-γ의 양을 나타낸 것이다. 블랭크: PBS 대조군. 배치 1: 1차 50 L 발효 공정에서 준비한 파열 효모의 상층액, 배치 2: 2차 50 L 발효 공정에서 준비한 파열 효모의 상층액. 효모: 구입한 효모의 파열 상층액. PHA: 식물적혈구응집소(phytohemagglutinin).

도 12는 (I) AKTA^TM 익스플로러 10S 시스템을 이용한 단백질 분획의 분석을 나타낸다. F3, F4 및 F5는 3번째, 4번째 및 5번째 분취 샘플이다. (II) AKTA^TM 익스플로러 10S 시스템로 분취 정제 FIP 분획의 SDS-PAGE이다. M: 분자량 175, 83, 62, 47.5, 32.5, 25, 16.5 및 6.5 Kd의 표준 단백질. STD: 형질전환된 E. Coli 유래의 표준 FIP.

도 13은 여러가지 농도의 정제 FIP하에 그루퍼(grouper)의 두신 세포(head-kidney)에 대한 NBT 분석 결과를 나타낸다. 대조군: PBS 대조군.

도 14는 여러가지 농도로 FIP를 복부에 주사한 후 이리도바이러스 기회 감염에 의한 그루퍼의 사망율을 나타낸다. PBS: 바이러스 기회 감염전에 0.1 ml PBS를 복막내 주사. 0.25, 1, 5 ug/0.1 ml: 바이러스 기회 감염전에 0.25, 1, 5 ug/0.1 ml의 정제 FIP를 복막내 주사.

도 15는 각 그룹에 FIP를 포함하는 효모를 여러 함량으로 먹인 후에 비브리오 하르베이(Vibrio harveyi) 기회 감염된 그루퍼 그룹들의 생존율을 나타낸다. PBS: 포스페이트 완충액 대조군. 20 mg, 4 mg, 0.8 mg: FIP를 포함하는 효모 20 mg, 4 mg, 및 0.8 mg 투여. 대조군: 비형질전환 효모 투여.

도 16은 FIP 또는 Der p II 추출물로 재자극한 Der p II-감작된 Balb/c 마우스의 비장세포에서의 IFN-γ 발현을 나타낸 것이다. FIP-gts: FIP. Der p: 집먼지 진드기 항원(Der p2). 대조군: PBS 대조군.

아래 실시예들은 예시하기 위한 것으로 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 발현 벡터 pYB101-FIP-효모 및 pYB101-FIP-lz의 제조

FIP-효모 및 FIP-lz의 구축

FIP-효모 및 FIP-lz의 DNA 서열은 도 1(I) 및 (II)에 나타나 있다. DNA 서열은 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 May 15:88(10): 4084-4088에 따라 제조하였다.

FIP-효모 및 FIP-lz의 제조

FIP-효모 및 FIP-lz에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는, 영지 면역조절 단백질을 코딩하는 공지된 DNA 서열(J. Biol. Chem. 1991; 266(4), 2486-2493)을 토대로 판매사에서 구입하였다(Mission Biotech Co., Ltd. Taiwan). 도 2(I)에 도시된 바와 같이, 상기 프라이머들의 양 말단에 제한효소부위 PmlI 및 BamHI을 삽입하였다. PCR 반응을 수행하여 원하는 프라이머를 수득하였다. 증폭된 프라이머의 서열을 분석하여, 이를 검증하였다.

발현 벡터 pYB101, pYB101-FIP-효모 및 pYB101-FIP-lz의 구축

현재 통용되는 기술을 이용하여, 갈락토스 프로모터, 유전자 Ura 3, 및 2μ ori을 pYB(Yeastern Biotech Co., Ltd., Taiwan)에 도입하여, 영양 선별 마커 및 효모 복제 오리진으로 제공하였다. 신규 벡터인 도 4(I)의 pYB101는, 공지의 빵 효모, 예컨대 BY4741 또는 DY150로 형질전환될 수 있다. 벡터 pYB101와 FIP-효모 및 FIP-lz를 코딩하는 DNA 서열을 제한효소 PmlI 및 BamHI(New England Biolabs, Beverly, USA)로 절단하였다. 절단된 절편들은 PCR Cleaning Up Purification Kit(Viogene, Taiwan)으로 정제하였다. T4 DNA 라이게이즈(New England Biolabs, Beverly, USA)를 이용하여 FIP-효모 및 FIP-lz의 절단 절편 3 mol과, 절단된 pYB101 1 mol을 연결하여, 도 4(II) 및 (III)의 pYB101-FIP-효모 및 pYB101-FIP-lz를 제조하였다.

E. coli에 pYB101-FIP-효모 및 pYB101-FIP-lz 형질전환

표준적인 형질전환 방법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. pp: 1.82-1.84)을 이용하여 E. coli DH5α에 pYB101-FIP-효모 및 pYB101-FIP-lz를 형질전환시켰다. 이용가능한 DNA 추출 키트(Mini-M Plasmid DNA Extraction Kit, Viogene, Taiwan)를 이용하여, 형질전환된 E. coli로부터 다량의 pYB101-FIP-효모와 pYB101-FIP-lz를 수득할 수 있었다.

실시예 2: 소량의 FIP-효모 및 FIP-lz 단백질 제조

빵 효모에 pYB101-FIP-효모 및 pYB101-FIP-lz의 형질전환

효모 형질전환 키트(Yeastern Biotech Co., Ltd., Taiwan)를 이용하여, 빵 효모(BY4741 또는 DY150)에 pYB101-FIP-효모 또는 pYB101-FIP-lz 1 ㎍을 형질전환하였다.

영양 조건에 의한 형질전환 효모 선별

상기 형질전환 효모를 YNBD 배지(0.17% 아미노산 무첨가성 박터 효모 질소 베이스(Difco, England), 0.5% 암모니아 설페이트, 2% 글루코스, 2% 한천(Sigma, USA))에 도말하여 배양하였다. 영양요구주 BY4741(MAT a his3delta1 leu2delta0 met15delta0 ura3delta0) 및 DY150(MAT a ura3-52 leu2-3 112 trp1-1 his3-11, 15, ade2-1 can1-100)를 이용하고, 배양하기 전에 0.0024% 히스티딘, 0.0072% 루신 및 0.0012% 메티오닌(BY4741), 또는, 0.0072% 루신, 0.0048% 트립토판, 0.0024% 히스티딘 및 0.0024% 아데닌(DY150)(Sigma, USA)를 YNBD 배지에 첨가하였다. 상기 배지는 2-3일간 30 ℃에서 유지시켰다. 상기 배지에 우라실을 무첨가하여 형질전환 효모를 선별하였다. 두가지 벡터 pYB101-FIP-효모 및 pYB101-FIP-lz는 우라실을 코딩하는 유전자를 가지고 있다. 따라서, 형질전환된 빵 효소는 우라실을 가지게 될 것이이므로 상기 배지내 우라실의 공급없이도 생존할 수 있지만, 형질전환되지 않은 효모는 생존할 수 없다.

교반기에서 소량의 형질전환 효모의 테스트

형질전환 효소의 2종의 영양요구주를 실시예 2에 기재된 필수 영양분이 첨가된 YNBD 배지 50 ml에 접종하였다. 이를 250 rpm으로 30 ℃에서 3일간 배양하였다. 효모 배양물을 원심분리한 다음 YNB 배양 배지로 3회 세척하여 글루코스를 제거하였다. 이후 효모 배양물을 필수 영양분이 첨가된 YNBG 배양배지(0.17% 아미노산 무첨가성 박터 효모 질소 베이스, 0.5% 암모니아 설페이트, 2% 갈락토스) 50 ml에 0.1 OD_600nm로 조정하였다. 효모 배양물은 30 ℃에서 250 rpm으로 배양하였다. 분광광도계 Ultrospec 2100 pro (Amersham Pharmacia biotech, USA)를 이용하여 매일 효모 농도를 모니터닝하여 OD_600nm을 측정하였고, 효모 샘플 1 ml을 매일 수거하였다. 이 샘플은 10000 xg에서 5분간 Microfuge 18 Centrifug(Bechman Coulter, USA)로 원심분리한 다음 3회 세척하여 효모 균체를 수득하였다. 이 균체는 -20℃에 보관하였다.

실시예 3: 웨스턴 블록 분석을 이용한 형질전환 효모에서 발현된 영지 면역조절 단백질의 정량

수거한 효모 균체를 PBS(Sigma, USA)로 OD_600nm=0.5로 희석하였다. 희석한 균체를 2x SDS 샘플 완충액(Sigma, USA)에 용해시킨 다음 3분간 100℃로 열처리하였다. 이를 냉각한 다음, 희석 균체 10 ㎕로 Nature (1970) 227, 680-685에 개시된 방법에 따라 100 v에서 SDS-PAGE를 수행하였다.

다음의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. pp: 18.60-18.75의 표준적인 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다. 모든 단백질들이 이동될때까지 Semi-PHOR(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco)를 이용하여, 50 mA의 전기충격으로 PVDF 막(Hybond-P, Amersham Bioscience, USA)에 겔상의 단백질을 이동시켰다. 이후, 막을 37 ℃에서 1시간 및 4 ℃에서 밤동안 블럭킹 완충액에 침지하였다. 블록킹 완충액을 제거한 다음, 여기에 블록킹 완충액중의 10^-3X의 토끼 항-영지 면역조절 단백질 혈청(Taiwan Advance Bio-Pharm Inc., Taiwan)을 첨가하여 37 ℃에서 한시간 배양하였다. 혈청액을 제거하고 세척 완충액으로 막 세척한 다음, 10^-4의 HRP-표지된 마우스 항-토끼 혈청(Sigma, USA)를 첨가하여 상기 막과 함께 37 ℃에서 1시간 두었다. 세척 완충액으로 막을 세척한 다음 색 표시제 TMB(Sigma, USA)를 첨가하여 발색시켰다. 웨스턴 블록 분석을 종료하기 위해, 물 첨가에 의해 색이 없어질때 색 반응을 종결지었다. 최종 결과는 도 5에 나타낸다.

도 5(I, II)에서, M 및 S는 표준 단백질 마커 및 E. coli에서 제조된 표준 FIP 정제물이다. 그룹 1-4는 개선된 FIP 코돈으로 발현시킨 FIP이다. 그룹 2-5는 천연형 FIP 코돈으로 발현시킨 FIP이다. 도 5(I)에 도시된 바와 같이, 그룹 1-3에서는 FIP가 뚜렷하게 발현되었지만 그룹 5-8에서는 FIP가 검출되지 않았다. 이러한 결과는, 효모에서 개선된 FIP 코돈이 매우 잘 발현될 수 있음을 나타낸다.

실시예 4: 발현 벡터 pYB101s-FIP의 제조

FIP 구축

FIP 주형 서열은 도 1(I)에 나타낸 FIP-효소의 서열이다. DNA 서열을 실시예 3에서와 같이 준비하였다. 효모 BY4741을 형질전환 숙주로 선별하였다.

FIP 프라이머 제조

FIP의 정방향 및 역방향 프라이머를 공급사(Mission Biotech Co., Ltd. Taiwan)에서 구입하였다. pYB101-FIP-효모(도 4)를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 도 6(I) 및 (II)에 도시한 바와 같이, 상기 프라이머에 제한효소 부위 PmlI 및 XhoI을 삽입하였다. PCR 반응을 수행하여 목적한 프라이머를 수득하였다. 증폭된 DNA를 서열분석하여(Mission Biotech Co., Ltd. Tiwan), 이의 서열을 확인하였다.

발현벡터 pYB-101s 및 pYB101s-FIP 구축

현재 통용되는 방법으로, 갈락토스 프로모터, 유전자 Ura 3, 2 μ ori, α-인자 리더 서열(도 7)을 pYB(Yeastern Biotech Co., Ltd., Taiwan)에 도입하여 영 양 선별 마커, 효모 복제 오리진 및 분비 신호를 각각 설정하였다. 도 8(I)의 신규 벡터 pYB101s는 BY4741와 같은 공지의 빵 효모에 형질전환될 수 있으며, 서열분석으로 이의 서열을 확인하였다(Mission Biotech Co., Ltd. Taiwan).

벡터 pYB101s와 FIP를 코딩하는 DNA 서열을 제한효소 PmlI 및 XhoI(New England Biolabs, Beverly, USA)으로 절단하였다. 절단된 절편은 PCR Cleaning Up Purification Kit(Viogene, Taiwan)로 정제하였다. T4 DNA 라이게이즈(New England Biolabs, Beverly, USA)를 이용하여 FIP 절단 절편 3 mol과, 절단된 pYB101s 1 mol을 연결하여, 도 8(II)의 pYB101s-FIP를 제조하였다.

E. coli에 pYB101s-FIP 형질전환

실시예 1에 기재된 바와 같이, E. coli DH5α에 pYB101s-FIP를 형질전환시켰다. 형질전환 E. coli로부터 다량의 pYB101s-FIP를 수득할 수 있다.

실시예 5: 소량의 FIP 제조

빵 효모 BT4741에 pYB101s-FIP의 형질전환

실시예 2에서와 같이, 빵 효모 BT4741에 1 ㎍의 pYB101s-FIP를 형질전환시켰다.

영양 조건에 의한 형질전환 효모 선별

실시예 2와 동일한 방법으로, YNBD 한천 배지(w/0.0024% 히스티딘, 0.0072% 루신, 0.0012% 메티오닌)에서 상기 형질전환 효모를 선별하였다.

교반기에서 소량의 형질전환 효모 테스트

실시예 2와 같이, 상기 형질전환 효모를 필수 영양분이 첨가된 50 ml YNBD 배지에 접종하였다. 배지에 갈락토스를 첨가하여 FIP 단백질 생산을 유도하였고, 매일 분비되는 FIP를 채집하였다.

실시예 6: SDS-PAGE를 이용한 형질전환 효모에서 발현된 FIP의 정량

실시예 3과 같이 SDS-PAGE로 샘플 FIP 단백질을 분석하였다. 이후 겔은 30분간 코마시 브릴리언트 블루 G-250(Sigma)로 염색하고, 탈염액(20% 메탄올, 10% 아세트산)으로 단백질 밴드가 뚜렷해질때까지 탈염하였다. 염색 결과는 도 9에 나타낸다.

실시예 7: 50 L 발효 공정

50 ml 플라스크에 효모 접종

영지 면역조절 단백질을 생산하는 형질전환 효모를 웨스턴 블롯 분석으로 선별하여, 실시예 2에서와 같이 필수 영양분과 함께 YNDB 배지에 접종하였다. 이를 30 ℃에서 250 rpm으로 24시간 배양하였다.

2000 ml 플라스크에 효모 접종

상기 50 ml 배양물을 2000 ml 플라스크내 동일 배지 450 ml에 접종하였다. 이를 30 ℃에서 250 rpm으로 24시간 배양하였다.

50 L 발효조에서의 효모 발효(Chuan Tai Factory, Taiwan)

상기 500 ml 배양물을 원심분리하고, 실시예 2에서처럼, YNB 배지로 2회 세척하여 글루코스를 제거하였다. 필수 영양분이 첨가된 50 L의 YNBG 배양배지(0.17% 아미노산 무첨가성 박토 효모 질소 베이스, 0.5% 암모니아 설페이트, 2% 갈 락토스(Sigma, USA))내 효모 농도를 0.1 OD_600nm로 첨가하였다. 효모 배양물은 25-30 ℃에서 400-500 rpm으로 pH 45-5.5로 발효시켰다. pH는 적량의 2M NaOH 및 HCl(Sigma, USA)를 첨가하여 조정하였다. 발효조내 압력은 0.2-0.4 kg/cm²로, 환기는 40-50 L/min로 유지시켰고, 0.2 ㎛ 필터로 여과하였다.

50 L 발효조내 영지 면역조절 단백질 정량

실시예 3에서와 같이, 발효 배양물에서 일부 샘플을 취하여, 샘플내 영지 면역조절 단백질 함량을 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, 50 L 발효조의 산물에는 영지 면역조절 단백질이 포함되어 있다.

실시예 8: 형질전환 효모에서 발현된 영지 면역조절 단백질의 활성 분석

총 세포 추출물 제조

회수한 효모 균체를 PBS로 세척하고 3회 원심분리하였다. 효모 펠렛을 모아 펠렛과 동일 부피의 0.4 mm 유리 비드를 첨가하였다. 혼합물은 4 ℃에서 20초간 혼합하고 1분간 얼음위에 두었다. 상기 단계를 5번 반복하였다. 15,000 rpm으로 4 ℃에서 5분간 원심분리한 다음, 상층액을 총 세포 추출물로 사용하였다.

상기 샘플을 원심분리하고, 상층액을 회수하였다. 이 상층액은 0.2 ㎛ (Sartorius)막을 통과시킨 후, 사용하기전까지 보관하였다.

인간 말초 단핵구 세포(PMNC) 준비

헤파린 처리된 말초 혈액을 성인에게서 채혈하고, 혈액 샘플에 Ficoll-paque 배양 배지(Amersham Biosciences)를 첨가하였다. 아머샴 프로토콜을 따라, 상기 용액을 원심분리하여 PMNC를 분리하였다. 세포를 세포 배양용 24-웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 1 X 10⁶ cells/ml로 두었다. 각 1 ml의 배양 배지는 RPMI1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)의 10% FBS, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 100 units/ml의 페니실린 및 200 mM의 L-글루타메이트를 포함하고 있다. 37 ℃에서 0, 24 또는 48시간 생육시킨후 세포를 배양하였다.

사이토카인 분석:

24-웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 세포를 1 X 10⁶ cells/ml로 두고 영지 면역조절 단백질을 여러가지 농도로 첨가하였다. 세포를 배양하고 일반 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 INF-γ의 활성을 분석하였다. 그 결과는 도 11에 나타낸다. 도 11에서, 배치 1 및 배치 2는 여러가지 농도의 FIP가 첨가된 샘플이다. 표준적인 ELISA 방법으로 INF-γ 활성을 조사하기 위해 PHA (phytohaemagglutinin, Sigma)를 사용하였다(The Journal of Immunology, 1998, 161: 2114-2119). 블랭크 및 효모 군에서는 거의 INF-γ 활성이 나타나지 않았으나, 정제 FIP 및 PHA가 세포에 첨가된 배치 1 및 배치 2에서는 INF-γ의 활성이 유의할만한 수준으로 관찰되었다. 이러한 결과는, PMNC를 48시간 배양하는 중에 정제 FIP 4 ㎍을 첨가함으로써, 다른 단백질을 첨가하는 것에 비하여 보다 많은 INF-γ를 유도할 수 있음을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 50 L 발효 공정에 따른 샘플이 증량된 INF-γ를 생산하는 것을 나타내는 것으로, FIP의 활성은 효소에 의한 결과가 아님을 의미한다.

실시예 9: FIP 정제

발효된 효모를 pH 6.0의 20 mM PBS(Sigma)에 1:10(v/v)로 용해하였다. 30 Kpsi하에서 파괴기(Basic Z model(Constant System Ltd. UK)를 사용하여 세포를 파괴하였다. 이 용액에 1M 아세트산을 첨가하여 pH를 4-5로 조절하였다. 이 용액은 3000 g에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 분리하여 다시 12,000 g에서 1분간 원심분리하였다. 상층액 10 ml을 20-50 mM 아세트산으로 평형화된 CM 세파로스 컬럼(Amersham Biosciences) 30 ml에 가하였다. 여기에 pH 4-5의 20-50 mM 아세트산을 가하여, 영지 면역조절 단백질을 용출시켰다.

도 12(I)에서, F3, F4 및 F5는 3번째, 4번째 및 5번째 분취한 샘플을 나타낸다. F3 및 F4는 보다 높은 mAU 값을 가졌다. F3과 F4를 도 12(II)에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE로 더욱 분석하였다. 도 12(II)에서, F3, F4 및 F5는 3번째, 4번째 및 5번째 분취한 샘플이다. STD는 표준 샘플(E coli 유래의 정제 FIP)이다. M은 표준 분자량이다. F3 및 F4에서 단백질은 STD과 동일한 분자량을 나타내었다. F3 및 F4의 단백질 밴드를 웨스턴 블롯으로 더욱 분석하여 FIP임을 확인하였다. 이러한 결과는 F3 및 F4의 FIP가 매우 순수한 상태임을 나타낸다.

실시예 10: 영지 단백질의 활용

사료첨가제로서의 영지 단백질의 사용

영지 단백질의 독성 검사

평균 체중 5.9, 평균 신장 7.25 cm의 그루퍼를 25 ℃, 33ppt 염도에서 채집하였다. 실시예 9에서와 같이, 5, 1, 025 ㎍/fish/0.1 ml의 농도로 정제 FIP를 그 루퍼 치어에게 복막내 투여하였다. 대조군에게는 PBS 용액을 투여하였다. 이들 어류는 14일간 본래의 유동성 물속에서 생육시켰다. 어류의 사망율을 매일 집계하였다. 첫 2주 동안에는 어류 사망이 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 농도의 FIP는 그루퍼에서 어떠한 독성도 나타내지 않았다.

FIP에 의한 비특이적 면역 반응 증강

그루퍼 두신 세포(Head-Kidney cell)의 FIP 치료에 의한, 생체내 비특이적 면역 반응 강화

600 g의 그루퍼를 시장에서 구입하였다. 두신 세포를 배양하고, 식세포를 표준적인 배양 기법으로 분리하였다. 두신 세포는 그루퍼에서 비특이적 면역 반응에 작용하는 주된 세포이다(Engelsma MY, Fish Shellfish Immunol. 2003 Nov;15(5):397-410). 이들 세포를 AL-10 배양액(L15(Gibco) : AIM5(Gibco) = 1:1)에 현탁시킨 다음 96-웰 플레이트(Corning)에 10⁷/ml의 농도로 0.1 ml을 접종하였다. 상기 플레이트를 25 ℃에 2시간 두었다.

2, 1, 0.5, 0.2 및 0.02 ㎍/ml 농도로 FIP를 2시간동안 실온상의 두신 배양물에 첨가하였다. 니트로블루 테트라졸륨 분석(NBT 분석,Sigma)을 수행하여 비특이적 면역 반응을 측정하였다. A_620nm 값이 높을수록 비특이적 식세포작용이 더욱 강화됨을 나타낸다.

두신 세포에 FIP를 첨가하면 식세포작용이 강화되며, 이는 NBT 분석으로 측정된다. 도 13에서 나타난 바와 같이, FIP를 2, 1 및 0.5 ㎍/0.1 ml로 첨가하는 경우, 두신 세포의 식세포작용이 뚜렷하게 증가되었으며, 이는 FIP가 비특이적며 면역 반응을 증강시킬 수 있음을 시사한다.

FIP에 의한 어류의 이리도바이러스 예방

전술한 실험에서와 같이, 그루퍼에게 PBS나 FIP를 복막내 투여하였다. 3주간 생장시킨 후, 0.1 ml의 바이러스 투여량 10,000 x TCID₅₀을 이들 어류의 복막에 투여하였다. 어류의 사망율을 매일 집계하였다. 일반적으로, 이리도바이러스를 복막내 투여한 그루퍼는 2주내에 사망하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, 가장 많은 양의 FIP, 5 ㎍ FIP/fish/0.11 ml를 투여한 어류에서의 2주후 사망율은 70% 였다. 따라서, 2주내 30%의 예방율을 달성하였다.

어류의 비브리오 하르베이 감염 예방

100마리의 그루퍼(Epinephelus malabevicus, 평균 중량 52.9g)을 5개 군으로 나누었다. 각 그룹에는 20마리의 그루퍼가 할당되었다:

1. PBS 대조군;

2. 20 mg 천연형 효모/60 g 체중으로 섭취한 그루퍼;

3. 20 mg 천연형 효모/60 g 체중으로 섭취한 그루퍼;

4. 4 mg 천연형 효모/60 g 체중으로 섭취한 그루퍼;

5. 0.8 mg 천연형 효모/60 g 체중으로 섭취한 그루퍼.

각 군에 이틀에 한번 제공하였다. 7일 후 각 군에게 비브리오 하르베이를 기회감염시켰다.

그루퍼에, 반치사량(LD₅₀) 3 x 10⁶CFU/ml으로 10회 비브리오 하르베이로 기회감염시켰다. 기회감염 하기 전에, 각 그룹의 10마리에서 혈액 샘플을 채혈하였다. 라이소자임 활성을 포함한 비특이적 면역 반응은, 상기 혈액 샘플을 이용하여 검사하였다. 그외 각 군의 10마리를 비브리오 하르베이로 기회감염시켰다. 어류의 생존율, 식이 및 사망율을 매일 기록하였다.

도 15에 나타난 바와 같이, 비브리오 하르베이에 의한 기회 감염을 수행한 후에, PBS 및 처연형 효모 군의 5일째 생존율은 10-20%로 현저하게 감소되었으나, FIP를 포함하는 효모를 이용한 나머지 3종의 군에서의 생존율은 60-80%로, FIP의 경구 투여가 어류의 면역성을 강화하고 수명을 연장시키기에 충분한 것으로 나타났다.

실시예 11: FIP 또는 Der p 추출물로 재자극화한 Balb/c 마우스의 Der p -감응된 비장세포에서의 IFN-γ 측정

FIP 또는 Der p 자극

Der p (House dust mite Dermatophagoides antigen (Der pII))-감작된 Balb/c 마우스 2가지 군으로부터 비장세포를 채취하였다. FIP 마우스 군에는 이틀에 한번 FIP 2 ㎍을 먹였다. Der p 마우스 군에는 첫째날 및 7일째에 복막내 Der P를 투여하였고, 14일째에는 Der p를 살포하였다. 15일째에 마우스를 희생시켜 비장 세포를 채취하였다.

마우스에서 분리한 비장 세포를 6 X 10⁶ cells/ml로 5% RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 이후 비장세포는 10 ㎍/ml Der p II 또는 2 ㎍/ml FIP로 재자극하였다. 대조군의 비장세포에는 PBS를 첨가하였다. 48시간 후에 배양 상층액을 회수하여, IFN-γ 함량을 분석하였다.

도 16에서, Der p는 Der p II이다. FIP-gts는 FIP이다. 대조군의 Balb/c 마우스 비장세포와 FIP(81.8 pg/ml)을 먹인 Balb/c 마우스의 비장세포사이에서는 IFN-γ의 생산량에 있어서, 차이가 없었다. 또한, FIP를 먹이지 않은 Balb/c 마우스의 비장세포나 Der p-재자극한 마우스에서 유래된 비장세포는 FIP로 재자극되는 경우, 대조군에서보다 더 많은 IFN-γ(463.8 및 1100.7)을 생산할 것이다. 이러한 실험은 FIP가 경구 투여를 통해 기능할 수 있으며, 면역 활성, 특히 직접적인 과민증 저해를 조절할 수 있음을 입증하였다.

본 발명은 당업자에게 충분히 구체적으로 제조방법 및 이용방법을 설명하고 예시하지만, 본 발명의 사상 및 범위에 이탈되지 않는 범위에서 여러가지 변경, 수정 및 개선이 이루어질 수 잇다.

당업자라면, 본 발명이 목적을 수행할 수 있도록 잘 설계되어 언급한 목표 및 이점 뿐만 아니라 내재된 사항을 이룰수 있음을 인정할 것이다. 플라스미드, 세포주, 용도, 공정 및 이의 생산 방법은 대표적인 바람직한 예로, 예시된 것일 뿐, 본 발명의 범위로 제한되지는 않는다. 당업자라면 수정을 가하거나 다른 용도로 사용할 수 있을 것이다. 이러한 수정은 본 발명의 사상의 범위에 포함되며, 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정된다.

당업자라면 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않는 범위에서, 개시 된 발명에 대한 다양한 치환 및 수정이 이루어질 수 있음을 용이하게 인정할 것이다.

본 발명의 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개물들은 발명에 적합한 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개물은 각각의 공개물이 특별히 그리고 개별적으로 원용에 의해 포함되는 것으로 표시되더라도, 동일한 범위에서 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

본 명세서에서 적절히 예시된 발명은 본 명세서에 특별히 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 한정 또는 한정들이 없는 상태에서도 실시될 수도 있다. 채택된 용어 및 표현은 한정이 아닌 기술의 용어로서 사용된 것이며, 임의의 등가의 특징들을 배제하는 용어 및 표현을 나타내고, 기술하거나 또는 그것의 일부이고자 하는 의도는 아니며, 다양한 수정이 청구된 본 발명의 범위내에서 가능하다는 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 예에 의해 특별히 개시되어, 당업자에 의해 본원에 개시된 개념의 선택 사항, 수정 및 변경이 결정될 수 있지만, 이러한 수정 및 변경은 첨부된 청구항에 의해 개시된 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 간주된다.

<110> YEASTERN BIOTECH CO., LTD. BONATURE INC. <120> FUNGAL IMMUNOMODULATORY PROTEIN PREPARED BY MICROORGANISMS AND USE THEREOF <130> ZP041151TCP <150> US 60/503,547 <151> 2003-09-17 <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule encoding fungal immunomodulatory protein <400> 1 atgtctgata ctgctttgat tttcagattg gcttgggatg ttaagaagtt gtctttcgat 60 tacactccaa actggggtag aggtaaccca aacaacttca ttgatactgt tactttccca 120 aaggttttga ctgataaggc ttacacttac agagttgctg tttctggtag aaacttgggt 180 gttaagccat cttacgctgt tgaatctgat ggttctcaaa aggttaactt cttggaatac 240 aactctggtt acggtattgc tgatactaac actattcaag ttttcgttgt tgatccagat 300 actaacaacg atttcattat tgctcaatgg aactga 336

Claims

하기 핵산 서열을 포함하는 진균성 면역조절 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자:

ATGTCTGATA CTGCTTTGAT TTTCAGATTG GCTTGGGATG TTAAGAAGTT GTCTTTCGAT

TACACTCCAA ACTGGGGTAG AGGTAACCCA AACAACTTCA TTGATACTGT TACTTTCCCA

AAGGTTTTGA CTGATAAGGC TTACACTTAC AGAGTTGCTG TTTCTGGTAG AAACTTGGGT

GTTAAGCCAT CTTACGCTGT TGAATCTGAT GGTTCTCAAA AGGTTAACTT CTTGGAATAC

AACTCTGGTT ACGGTATTGC TGATACTAAC ACTATTCAAG TTTTCGTTGT TGATCCAGAT

ACTAACAACG ATTTCATTAT TGCTCAATGG AACTGA
제 1항에 있어서, 하나의 전달 시스템에서 발현되는 다른 유전자와 연결된 것을 특징으로 하는, 분리된 핵산 분자.
제 1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 2항에 따른 연결된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 3항 또는 제4항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제 5항에 있어서, 세균, 진균 세포 또는 효모 세포인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 5항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccaromyces pombe), 토룰롭시스(Torulopsis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans), 아스퍼질러스(아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거(A. niger), 아스퍼질러스 아와모리(A. awamori), 아스퍼질러스 오리제(A. oryzae)), 또는 트리코더마(트리코더마 리세이(Tricoderma reesei))인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 5항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 5항에 있어서, 무손상 형태 또는 파괴된 형태인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 5항에 있어서, 상기 단백질을 분비할 수 있는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 5항에 있어서, 포유류, 어류, 갑각류 및 가금류로 이루어진 군으로부터 선택된 개체에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 11항에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 복막내, 경구, 점막, 피부 흡수 또는 액침(immersing in solution)으로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 11항에 있어서, 상기 투여는 경구 경로인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 11항에 있어서, 상기 포유류는 돼지이고, 가금류는 닭인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 11항에 있어서, 상기 어류는 그루퍼(grouper), 연어 또는 송어인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
제 11항에 있어서, 상기 갑각류는 새우, 바닷가재, 홍다리얼룩새우(Penaeus monodon), 보리새우(Penaeus japonicus) 또는 백새우(Penaeus vannamei)인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
(a) 숙주 세포에 삽입될 FIP 핵산 서열을 가지는 발현 벡터를 구축하는 단계;

(b) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및

(c) 상기 숙주 세포를 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서의 진균성 면역조절 단백질 발현 방법.
제 17항에 있어서, 상기 FIP 핵산 서열은 제 1항의 핵산 서열인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포에서의 진균성 면역조절 단백질 발현 방법.
제 17항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)의 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포에서의 진균성 면역조절 단백질 발현 방법.
제 17항에 있어서, 상기 단계 (b)의 벡터는 pYB101-FIP-효모인 것을 특징으로 하는, 숙주 세포에서의 진균성 면역조절 단백질 발현 방법.
제 17항의 방법으로 제조된 진균성 면역조절 단백질 및 제 17항의 방법으로 형질전환된 숙주 세포로부터 분리된 진균성 면역조절 단백질.
(a) 발효된 숙주 세포를 용매에 용해시키는 단계;

(b) 세포를 파괴하는 단계;

(c) 상기 용액의 pH를 4-5로 조정하는 단계;

(d) 세포 추출물내 파편들을 분리하는 단계;

(e) 상층액을 원심분리하는 단계;

(f) 상기 상층액을 pH 4-5로 평형화된 컬럼에 가하는 단계; 및

(g) 영지(Ling Zhi) 면역조절 단백질을 용출시키는 단계를 포함하는, 벡터로 형질전환된 숙주세포로부터 FIP를 정제하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 영지 면역조절 단백질은 pH 4-5의 20 - 50 mM 아세트산을 가하여 용출시키는 것을 특징으로 하는, 벡터로 형질전환된 숙주세포로부터 FIP를 정제하는 방법.
진균성 면역조절 단백질을 포함하는, 면역학적 활성 조절에 사용되는 경구 투여용 조성물.
제 24항에 있어서, 진균성 면역조절 단백질은 천연 영지 또는 제 21항의 진 균성 면역조절 단백질로부터 제조되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 24항에 있어서, 염증 및 과민증을 감소시키기 위해 화장품 용도로 적용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 24항에 있어서, 염증 및 과민증 감소, 면역학적 활성 조절, 당뇨병 예방, 천식 개선, 세균 및 바이러스 감염에 대한 반응성 증가 및 기관 이식에 대한 면역학적 반응 감소를 위한 약학적 용도로 적용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 24항에 있어서, 생명 연장, 면역학적 활성 조절, 사료 효율(feed conversion) 증가 및 스트레스 감소를 위한 식품 또는 사료 첨가제로 적용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
진균성 면역조절 단백질 또는 FIP와 융합된 단백질을 개체에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 면역학적 활성의 조절 방법.
제 29항에 있어서, 상기 단백질은 대장균(E.coli) 또는 사카로마이세스 세레비지애인 것을 특징으로 하는, 면역학적 활성의 조절 방법.