CN114085862A - 一种树舌转基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种树舌转基因方法，属于生物领域，首先制备培养基，包括包括YPG培养基、MYG再生培养基，然后构建重组真核表达质粒载体：pCAMBIA1303‑pGPD‑FIP‑gap，然后取纯化后的1×107个树舌原生质体，悬浮于250μL渗透压稳定剂，加入5μg质粒pCAMBIA1303‑pGPD‑FIP‑gap轻轻摇匀，然后放置于冰上冰浴10min；接着加入50μL PEG缓冲液，置于冰上冰浴30min，再加入1mL的PEG缓冲液，混匀在28℃下静置20min；所述PEG缓冲液包括PEG6000、15mM CaCl2和10mM Tris水溶液，经过再生培养、潮霉素抗性筛选、传代培养后最后进行检测，结果显示经过两次潮霉素抗性筛选的转化子均为阳性，PCR阳性检测结果：10％‑60％的PEG缓冲液均可得到阳性转化子，其中用30％的PEG缓冲液进行树舌转化效率最好，1μg质粒可以获得110‑120个左右阳性转化子，阳性转化率可达95％。

Description

一种树舌转基因方法
技术领域
本发明涉及一种转基因方法，尤其是一种树舌转基因方法。
背景技术
树舌灵芝具有清热消炎、保肝护肝、治疗心脑血管疾病和强身健体的作用。近年来在树舌灵芝发现多种药用活性物质，例如多糖、甾类、三萜、脂类化合物、氨基酸、蛋白质、酚类和一些微量元素。树舌灵芝多糖是抗血脂异常及其相关并发症的活性物质。目前树舌主要研究在分离提纯生物活性物质体外检测。分子生物学和遗传转化等方面研究未见报道。由于树舌亚属与其他灵芝属亲缘性较远，遗传背景不尽相同。已有的灵芝遗传转化方法并不完全适用树舌灵芝。本专利拟发明一种树舌的PEG介导的遗传转化方法，将有助于研究树舌灵芝生物学功能，遗传育种和其他多种研究。
发明内容
本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，而提供一种树舌转基因方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种树舌转基因方法，其中，首先制备培养基，包括：
YPG液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO41g/L；
YPG固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO41g/L，琼脂粉15g/L；
MYG液体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，甘露醇109g/L；
MYG固体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，琼脂粉15g/L，甘露醇109g/L；
上述培养基在110℃下灭菌30min。
具体步骤如下；
(1)克隆赤灵芝内源甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(pGPD)和克隆树舌灵芝真菌免疫调节蛋白基因FIP-gap，分别连接至真核表达载体pCAMBIA1303上，构建重组真核表达质粒载体：pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap；
(2)将野生树舌灵芝接种于含有潮霉素的YPG固体培养基，记录野生树舌生长情况时间梯度为：6、12、18天，筛选潮霉素对树舌的最低抑制浓度，作为后续实验转化子的筛选浓度，浓度梯度：10、20、30、40、50、60、70、80μg/mL；目的是为了确定潮霉素抗性筛选时适用用的浓度；
(3)取纯化后的1×107个树舌原生质体，悬浮于250μL渗透压稳定剂，加入5μg质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap轻轻摇匀，然后放置于冰上冰浴10min；
接着加入50μL PEG缓冲液，置于冰上冰浴30min，再加入1mL的PEG缓冲液，混匀在28℃下静置20min；
所述PEG缓冲液包括PEG6000、15mM CaCl2和10mM Tris水溶液；
(4)先以4000r/min离心10min，弃上清液，接着加入1.0mLMYG液体再生培养基、50μg氨苄青霉素、100μg硫酸链霉素，在28℃静置培养5天，然后在培养液中加潮霉素，其中潮霉素的浓度为70μg/mL，然后吸取50μL培养液涂布于MYG固体再生培养基，生长5-10天观察生长情况；
(5)挑取筛选的拟转化子在不含抗生素的YPG固体培养基上传代培养5代。
(6)对传代培养后的拟转化子在YPG液体培养基中进行二次潮霉素筛选，其中潮霉素的浓度为80μg/mL，在28℃黑暗条件下，以120r/min培养7天后，将依然可以生长的菌球用无菌镊子取出接种于YPG固体培养基中培养；
(7)对二次筛选阳性的转化子提取基因组DNA，以野生树舌基因组作为阴性对照，质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap作为阳性对照，进行潮霉素基因的PCR检测。
本发明的优点：在MYG液体再生培养基中加入50μg/mL氨苄青霉素、100μg/mL硫酸链霉素，可以明显降低实验过程中细菌污染，同时在YPG液体培养基中加入潮霉素，并且潮霉素的浓度为80μg/mL，进行二次筛选明显提高筛选阳性转化子，准确率可达100％，同时真核重组质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap表达载体成功转化树舌灵芝并得以表达，为树舌灵芝可选用遗传转化的分子载体工具开拓了更多的可能。
结果显示第二次筛选的转化子均为阳性，PCR阳性检测结果：10％-60％的PEG缓冲液均可得到阳性转化子，其中用30％的PEG缓冲液进行树舌转化效率最好，1μg质粒可以获得110-120个左右阳性转化子，阳性转化率可达95％。
附图说明
图1是本发明真核重组表达质粒载体pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap。
图2是本发明野生树舌灵芝潮霉素最低抑制浓度筛选。
图3是本发明转基因树舌灵芝潮霉素初次筛选。
图4是本发明转基因树舌灵芝潮霉素二次筛选。
图5是本发明转基因树舌灵芝潮霉素基因PCR检测。
图3中，a为阴性对照、b-e为拟转化子；图4中a-h为不同编号的拟转化子，同一编号中左侧菌块为野生型树舌灵芝，右侧为转基因树舌转化子；图5中M为DNA marker，1为阳性对照，2为阴性对照，3-10为不同编号的转基因树舌灵芝拟转化子。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明做以下详细说明。
如图所示，一种树舌转基因方法，其中，首先制备培养基，包括：
YPG液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO41g/L；
YPG固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO41g/L，琼脂粉15g/L；
MYG液体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，甘露醇109g/L；
MYG固体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，琼脂粉15g/L，甘露醇109g/L；
上述培养基在110℃下灭菌30min。
具体步骤如下；
(1)克隆赤灵芝内源甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(pGPD)和克隆树舌灵芝真菌免疫调节蛋白基因FIP-gap，分别连接至真核表达载体pCAMBIA1303上，构建重组真核表达质粒载体：pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap；
(2)将野生树舌灵芝接种于含有潮霉素的YPG固体培养基，记录野生树舌生长情况时间梯度为：6、12、18天，筛选潮霉素对树舌的最低抑制浓度，作为后续实验转化子的筛选浓度，浓度梯度：10、20、30、40、50、60、70、80μg/mL；目的是为了确定潮霉素抗性筛选时适用用的浓度。
(3)取纯化后的1×107个树舌原生质体，悬浮于250μL渗透压稳定剂，加入5μg质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap轻轻摇匀，然后放置于冰上冰浴10min；
接着加入50μL PEG缓冲液，置于冰上冰浴30min，再加入1mL的PEG缓冲液，混匀在28℃下静置20min；
所述PEG缓冲液包括PEG6000、15mM CaCl2和10mM Tris水溶液。
(4)先以4000r/min离心10min，弃上清液，接着加入1.0mLMYG液体再生培养基、50μg氨苄青霉素、100μg硫酸链霉素，在28℃静置培养5天，然后在培养液中加潮霉素，其中潮霉素的浓度为70μg/mL，然后吸取50μL培养液涂布于MYG固体再生培养基，生长5-10天观察生长情况；
(5)挑取筛选的拟转化子在不含抗生素的YPG固体培养基上传代培养5代。
(6)对传代培养后的拟转化子在YPG液体培养基中进行二次潮霉素筛选，其中潮霉素的浓度为80μg/mL，在28℃黑暗条件下，以120r/min培养7天后，将依然可以生长的菌球用无菌镊子取出接种于YPG固体培养基中培养。
(7)对二次筛选阳性的转化子提取基因组DNA，以野生树舌基因组作为阴性对照，质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap作为阳性对照，进行潮霉素基因的PCR检测。
具体实验数据如表1
Figure BDA0003370057410000061
表1
结果显示第二次筛选的转化子均为阳性，PCR阳性检测结果：10％-60％的PEG缓冲液均可得到阳性转化子，其中用30％的PEG缓冲液进行树舌转化效率最好，1μg质粒可以获得110-120个左右阳性转化子，阳性转化率可达95％
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种树舌转基因方法，其特征在于：首先制备培养基，包括：
YPG液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO4 1g/L；
YPG固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO4 1g/L，琼脂粉15g/L；
MYG液体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，甘露醇109g/L；
MYG固体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，琼脂粉15g/L，甘露醇109g/L；
上述培养基在110℃下灭菌30min。
具体步骤如下；
(1)克隆赤灵芝内源甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(pGPD)和克隆树舌灵芝真菌免疫调节蛋白基因FIP-gap，分别连接至真核表达载体pCAMBIA1303上，构建重组真核表达质粒载体：pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap；
(2)将野生树舌灵芝接种于含有潮霉素的YPG固体培养基，记录野生树舌生长情况时间梯度为：6、12、18天，筛选潮霉素对树舌的最低抑制浓度，作为后续实验转化子的筛选浓度，浓度梯度：10、20、30、40、50、60、70、80μg/mL；
(3)取纯化后的1×107个树舌原生质体，悬浮于250μL渗透压稳定剂，加入5μg质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap轻轻摇匀，然后放置于冰上冰浴10min；
接着加入50μL PEG缓冲液，置于冰上冰浴30min，再加入1mL的PEG缓冲液，混匀在28℃下静置20min；
所述PEG缓冲液包括PEG6000、15mM CaCl2和10mM Tris水溶液；
(4)先以4000r/min离心10min，弃上清液，接着加入1.0mLMYG液体再生培养基、50μg氨苄青霉素、100μg硫酸链霉素，在28℃静置培养5天，然后在培养液中加潮霉素，其中潮霉素的浓度为70μg/mL，然后吸取50μL培养液涂布于MYG固体再生培养基，生长5-10天观察生长情况；
(5)挑取筛选的拟转化子在不含抗生素的YPG固体培养基上传代培养5代。
(6)对传代培养后的拟转化子在YPG液体培养基中进行二次潮霉素筛选，其中潮霉素的浓度为80μg/mL，在28℃黑暗条件下，以120r/min培养7天后，将依然可以生长的菌球用无菌镊子取出接种于YPG固体培养基中培养；
(7)对二次筛选阳性的转化子提取基因组DNA，以野生树舌基因组作为阴性对照，质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap作为阳性对照，进行潮霉素基因的PCR检测。
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