CN104789551A

CN104789551A - 利用ptc转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法

Info

Publication number: CN104789551A
Application number: CN201510226811.8A
Authority: CN
Inventors: 李刚; 刘铁平
Original assignee: Jiangsu Zhong Xiang High-Tech Industrial Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Zhong Xiang High-Tech Industrial Co Ltd
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2015-05-06
Publication date: 2015-07-22

Abstract

本发明提供了一种利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法，所述的方法是用溶壁酶将灵芝菌丝体酶解成原生质体，所制备的原生质体经精制、纯化后、利用PTC转化缓冲液，以纯化的灵芝原生质体作为受体细胞，将含有外源基因的真菌表达载体转入灵芝原生质体中，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。本发明的方法转化效率高，能将外源基因高效的转化入灵芝中，并使之得到稳定的复制、传代和表达，成功建立了灵芝的高效转化系统，为灵芝开辟了广阔的应用领域，将使灵芝这一宝贵资源得到更充分的利用和开发。

Description

利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法

技术领域

本发明涉及一种通过化学诱导将外源基因转入灵芝的方法，尤其是涉及一种利用聚乙二醇-氯化钙转化缓冲液（PTC）将外源基因高效转入灵芝真菌的方法。

背景技术

灵芝是一种珍贵的药用和食用菌，由于对多种疾病尤其是当今医学上的一些顽症如肝炎、心血管疾病、癌症等具有显著的疗效，因而已引起了国际医学界的瞩目。中国、日本、韩国、英国、美国已广泛开展了灵芝的生化、药理、临床等方面的研究。但是关于灵芝的分子生物学方面的研究，目前很少见报道，迄今尚未有外源基因转入灵芝中的报道。为了进行灵芝的分子生物学研究，建立一个高效的转化系统是必需的，也是利用现代基因工程定向改良灵芝的药用品质的前提。此外，灵芝作为一种对人体无任何毒副作用的大型药用和食用真菌，以它作为外源基因的受体菌，对人体安全可靠，具有与细菌、酵母菌等不同的独特优点，它是一种应用前景很广的异源基因表达系统。因此，通过基因工程技术建立稳定、高效的灵芝转化系统，对充分利用和开发灵芝这一珍贵的资源有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用PTC转化缓冲液将外源基因高效转入灵芝真菌的方法，以便建立稳定、高效的灵芝外源基因转化体系，从而能够直接有效地获得具有优良遗传性状或重要经济价值的表达产物的转基因灵芝新菌种，以成为一个全新的转基因载体。

本发明提供了一种利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法，所述的方法包括以下步骤：

（1）灵芝原生质体的制备：用PDA液体培养基于26-28℃，140-180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝；接种3mL菌丝悬液到100mL MYG液体再生培养基中，130-200rpm摇床培养3天，然后离心洗涤得到新鲜的灵芝湿菌丝；用由2-3g溶壁酶溶解于100mL 0.6-0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液而成的溶壁酶液，按每330-400mg灵芝菌丝体加1mL溶壁酶液计算，在30℃、pH值为6.0条件下酶解2-3小时；将所得原生质体用灭菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，0.5-0.8mol/L渗透压稳定剂洗涤，然后用STC洗涤，最后溶于1mL STC中；

（2）原生质体转化：取约2×10⁷个灵芝原生质体，加入30-70μL PTC转化缓冲液，再加入10-20μg真菌表达载体、浓度为10-100mmol/L的ATA 20-50μL和浓度为10-30mmol/L亚精胺5-20μL，充分混匀后，冰浴45分钟；然后加入1-2mL STC缓冲液，室温静置25分钟；4℃ 8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1-2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板；

所述的PTC转化缓冲液由终浓度为10-80%的PEG4000、1-10mmol/L的CaC1₂、1-10mmol/L的Tris混合而成；

所述的STC缓冲液由终浓度为0.1-0.8mol/L的山梨醇、10-100mmol/L Tris.Cl、10-100mmol/L的CaCl₂混合而成；

所述的渗透压稳定剂为硫酸镁、葡萄糖或甘露醇。

所述的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；所述的MYG固体再生培养基为：在所述的MYG液体培养基中加入15克的琼脂即得。

所述的真菌表达载体为含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒。

所述的外源基因为动物﹑植物或细菌来源的基因。

所述的外源目的基因为p53基因。

所述的灵芝为赤芝。

本发明优点在于：

一方面，本发明用溶壁酶将灵芝菌丝体酶解成原生质体，所制备的原生质体经精制、纯化后、利用PTC转化缓冲液，以纯化的灵芝原生质体作为受体细胞，将含有外源基因的真菌表达载体转入灵芝原生质体中，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株，各步骤和参数设置恰当，使得转化效率高达60-100个转化子∕μgDNA·10⁷转化子。

另一方面，本发明的方法能将外源基因高效的转化入灵芝中，并使之得到稳定的复制、传代和表达，成功建立了灵芝的高效转化系统。

总的来说，本发明方法所建立的灵芝转化系统为灵芝开辟了广阔的应用领域，将使灵芝这一宝贵资源得到更充分的利用和开发。具体说来，主要包括：

1.灵芝有着很高的蛋白质分泌能力，能正确进行表达产物的翻译后加工，包括肽链剪切和糖基化等，且糖基化的方式与高等真核生物类似，而且灵芝还是已经确认的安全菌株，对人体有益无害，并有成熟的发酵和后处理工艺，因而可以利用灵芝转化技术将一些重要经济价值的、来自高等生物的外源基因导入灵芝中表达，利用灵芝发酵方法即可快速、大规模、廉价地生产具有活性的外源蛋白质；

2.通过灵芝转化技术将一些与优良性有关的基因导入灵芝中，可在短时间内快速定向改良灵芝菌株，培养出优质高产的灵芝新品种；

3.在基础研究方面，灵芝的转化作为真菌的基因克隆和表达系统，可用于基因分离、基因组结构、基因表达及其调控等方面的研究，并且可为建立其它大型真菌的转化系统提供理论和实验依据。

附图说明

图1是用实施例2方法将含有p53基因的pAN7-1质粒进行转化处理后的灵芝原生质体在含有100μg/mL HmB的MYG平板上培养15天后的结果。

图2是从图1中的转化平板上随机挑取3个含有p53基因的抗性转化子，将这3株转化子先在不含HmB的MYG平板上连续传代5代后，再接种到一个含有100μg/mL HmB的MYG平板上培养3星期后的结果。

图3是将2个随机选取的实施例2方法得到的p53基因灵芝转化菌株和一株未转化的野生型灵芝菌株进行Southern blot分析的结果。其中，1号泳道为质粒pAN7-1（6.7kb长，酶切成线状质粒）的Southern blot的结果，作为正对照。2号泳道为野生型灵芝基因组DNA的Southern blot结果，作为负对照。3号泳道为转化株p53-1#基因组DNA不作酶切的Southern blot结果。4号泳道为转化株p53-2#基因组DNA不作酶切的Southern blot结果。5号泳道为转化株p53-1#基因组DNA BamHI酶切的Southern blot结果。

图4是p53浓度与OD₆₃₀对应关系曲线。将上述两株p53基因灵芝转化菌株（同图3中的两个转化株）进行ELISA分析。

具体实施方式

下面对本发明提供的具体实施方式作进一步的说明。

实施例1

用PDA液体培养基于28℃，180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天（灵芝菌种是赤芝，生物学分类名：灵芝Ganoderma lucidum(Leyss:Fr.)P.Karst，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟。接种3mL菌丝悬液到100mL MYG液体再生培养基中，200rpm摇床培养3天，然后以4000rpm离心10min，去上清液，用0.6mol/L的硫酸镁溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。

称取1克灵芝湿菌丝，加3mL由2g溶壁酶（购自广东省微生物研究所）溶于100mL 0.6mol/L的硫酸镁溶液中而成的溶壁酶液，30℃、pH值为6.0条件下酶解2小时。将酶解液用灭过菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗涤1次，再用15mL STC洗涤1次，最后溶于1mL STC中。将原生质体用血球计数板计数后，稀释到10⁸个/mL，4℃保存备用。

取160μl灵芝原生质体（约2×10⁷个），加入30μL PTC转化缓冲液，再加入20μL（约10μg）含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒（pAN7-1原始质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司，商品号：MLCC150115；插入的p53基因序列如SEQ ID NO:1所示；p53基因序列插入在pAN7-1原始质粒的BglII和SnaBI两个酶切位点之间）和50μL、10mmol/L ATA（金精三羧酸，Aurintricarboxylic acid，购自Sigma公司，商品号Sigma A1895），5μL、20mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入1mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃、8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB（潮霉素B，Hygromycin B）的MYG固体再生培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为60个转化子/μg DNA·10⁷原生质体。

本实施例1中的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。在该MYG液体再生培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。

本实施例1中的PTC转化缓冲液由终浓度为10%（w/v）的PEG4000、1mmol/L的CaCl₂、1mmol/L的Tris混合而成，溶剂为纯水。

本实施例1中的STC缓冲液由终浓度为0.1mol/L的山梨醇、10mmol/L Tris.Cl、10mmol/L的CaCl₂混合而成，溶剂为纯水。

实施例2

用PDA液体培养基于26℃，140rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体4天（灵芝菌种是赤芝，生物学分类名：灵芝Ganoderma lucidum(Leyss:Fr.)P.Karst，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟。接种3mL菌丝悬液到100mL MYG液体再生培养基中，180rpm摇床培养3天，然后以3000rpm离心10min，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。

称取2克灵芝湿菌丝，加5mL由2.5g溶壁酶溶于100mL 0.8mol/L的甘露醇溶液中而成的溶壁酶液，30℃、pH值为6.0条件下酶解2.5小时。将酶解液用灭过菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，去上清液，用0.8mol/L甘露醇洗涤1次，再用15mL STC洗涤1次，最后溶于1mL STC中。将原生质体用血球计数板计数后，稀释到10⁸个/mL，4℃保存备用。

取160μl灵芝原生质体（约2×10⁷个），加入50μL PTC转化缓冲液，再加入15μL（约15μg）含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒（同实施例1）和20μL、20mmol/L ATA，10μL、10mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入1.5mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃、8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1.5mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为85个转化子/μgDNA·10⁷原生质体。

本实施例2中的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。在该MYG液体再生培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。

本实施例2中的PTC缓冲液由终浓度为40%（w/v）的PEG4000、5mmol/L的CaCl₂、5mmol/L的Tris混合而成，溶剂为纯水。

本实施例2中的STC缓冲液由终浓度为0.4mol/L的山梨醇、50mmol/L Tris.Cl、50mmol/L的CaCl₂混合而成，溶剂为纯水。

实施例3

用PDA液体培养基于27℃，150rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天（灵芝菌种是赤芝，生物学分类名：灵芝Ganoderma lucidum(Leyss:Fr.)P.Karst，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟。接种3mL菌丝悬液到100mL MYG液体再生培养基中，130rpm摇床培养4天，然后以4000rpm离心10min，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。

称取5克灵芝湿菌丝，加15mL由3g溶壁酶溶于100mL 0.8mol/L的葡萄糖溶液中而成的溶壁酶液，30℃、pH值为6.0条件下酶解3小时。将酶解液用灭过菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，去上清液，用0.6mol/L甘露醇洗涤1次，再用15mL STC洗涤1次，最后溶于1mL STC中。将原生质体用血球计数板计数后，稀释到10⁸个/mL，4℃保存备用。

取160μl灵芝原生质体（约2×10⁷个），加入70μL PTC转化缓冲液，再加入50μL（约20μg）含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒（同实施例1）和50μL、100mmol/L ATA，20μL、30mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入2mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃、8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB的MYG再生固体培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为75个转化子/μg DNA·10⁷原生质体。

本实施例3中的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。在该MYG液体再生培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。

本实施例3中的PTC缓冲液由终浓度为80%（w/v）的PEG4000、10mmol/L的CaCl₂、10mmol/L的Tris混合而成，溶剂为纯水。

本实施例3中的STC缓冲液由终浓度为0.8mol/L的山梨醇、100mmol/L Tris.Cl、100mmol/L的CaCl₂混合而成，溶剂为纯水。

实施例4

对本发明利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法进行效果鉴定。从图1至图2可以看出，经实施例2的方法用含有p53基因的pAN7-1质粒转化处理的灵芝原生质体在含有100μg/mL HmB的MYG再生固体培养基平板上生长出众多菌株，而且这些菌株在无选择压力的情况下经过5次传代后，仍能保持良好的HmB抗性；而未经本发明方法处理的灵芝原生质体则全部不能在含HmB的MYG再生固体培养基平板上生长。说明本发明的方法已有效地将外源质粒转入灵芝中，并且使该质粒上的hph基因在灵芝中得到稳定﹑高效表达。

图3中，野生型灵芝菌株总DNA与探针之间没有形成杂交带，而转化株p53-1#﹑p53-2#未酶切的基因组DNA样品，在高分子量的位置与探针形成杂交带。证明含有p53基因的外源质粒已经整合到这两株灵芝的基因组DNA中。转化株p53-1#基因组DNA用BamHI单酶切的样品，则在约2kb和4kb处各产生1条杂交带（两条杂交带的大小系根据图中各电泳条带的迁移率估算得出的），证明可能有2个拷贝的p53基因整合到灵芝转化株1#的基因组DNA中。

从图4中，我们测得转基因菌株p53-1#和p53-2#的OD₆₃₀分别为0.363和0.469，扣除阴性对照孔（来自非转化灵芝菌丝的总蛋白）的OD₆₃₀值0.093后，二者的净OD₆₃₀值分别为0.270和0.303，根据线性回归方程求得二者的浓度分别为8.45/ml和11.22U/ml，换算成干菌丝含量分别为16.90U/g和22.4U/g。即p53-1#、p53-2#转基因灵芝菌株中，每克灵芝干菌丝中可表达p53蛋白16.90U和22.44U。

以上结果充分说明本发明的方法能将外源基因高效的转化入灵芝真菌中，并使之得到稳定的复制、传代和表达，成功建立了灵芝的高效转化系统。

对比例1

取160μl灵芝原生质体（约2×10⁷个），加入30μL PTC转化缓冲液，再加入20μL（约10μg）含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒（同实施例1）和50μL、10mmol/L ATA（金精三羧酸，Aurintricarboxylic acid，购自Sigma公司，商品号Sigma A1895），5μL、20mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入1mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃、8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB（潮霉素B，Hygromycin B）的MYG固体再生培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为33个转化子/μg DNA·10⁷原生质体。

本对比例1中的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。在该MYG液体再生培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。

本对比例1中的PTC转化缓冲液由终浓度为10%（w/v）的PEG4000、0.8mmol/L的CaCl₂、1mmol/L的Tris混合而成，溶剂为纯水。

本对比例1中的STC缓冲液由终浓度为0.1mol/L的山梨醇、10mmol/L Tris.Cl、10mmol/L的CaCl₂混合而成，溶剂为纯水。

对比例2

取160μl灵芝原生质体（约2×10⁷个），加入70μL PTC转化缓冲液，再加入50μL（约20μg）含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒（同实施例1）和50μL、100mmol/L ATA，20μL、30mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入2mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃、8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB的MYG再生固体培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为35个转化子/μg DNA·10⁷原生质体。

本对比例2中的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。在该MYG液体再生培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。

本对比例2中的PTC缓冲液由终浓度为80%（w/v）的PEG4000、10mmol/L的CaCl₂、15mmol/L的Tris混合而成，溶剂为纯水。

本对比例2中的STC缓冲液由浓度为0.8mol/L的山梨醇，浓度为100mmol/L Tris.Cl，浓度为100mmol/L的CaCl₂混合而成，溶剂为纯水。

对比例3

取160μl灵芝原生质体（约2×10⁷个），加入50μL PTC转化缓冲液，再加入15μL（约15μg）含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒（同实施例1）和20μL、20mmol/L ATA，10μL、10mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入1.5mL STC缓冲液，室温静置25分钟。4℃、8000g离心5分钟，然后用500μL STC重悬后于4℃、5000g离心5分钟，再用1.5mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28℃放置18-24小时后，取100μL涂于含有浓度为100μg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为39个转化子/μgDNA·10⁷原生质体。

本对比例3中的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然，溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。在该MYG液体再生培养基中加入15克的琼脂，即得MYG固体再生培养基。

本对比例3中的PTC缓冲液由终浓度为40%（w/v）的PEG4000、5mmol/L的CaCl₂、5mmol/L的Tris混合而成，溶剂为纯水。

本对比例3中的STC缓冲液由终浓度为0.4mol/L的甘露醇、50mmol/L Tris.Cl、50mmol/L的CaCl₂混合而成，溶剂为纯水。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏中祥高科技实业有限公司

<120> 利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法

<130> /

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60

gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120

gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 180

gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccgcgtgg cccctgcacc agcagctcct 240

acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 300

aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 360

tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 420

tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 480

gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 540

cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 600

ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 660

gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 720

tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 780

agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcatg tttgtgcctg tcctgggaga 840

gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 900

ccagggagca ctaagcgagc actgtccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 960

aaaccactgg atggagaata tttcaccctt cagatccgtg ggcgtgagcg cttcgagatg 1020

ttccgagagc tgaatgaggc cttggaactc aaggatgccc aggctgggaa ggagccaggg 1080

gggagcaggg ctcactccag ccacctgaag tccaaaaagg gtcagtctac ctcccgccat 1140

aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagact ga 1182

Claims

1.一种利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

所述的渗透压稳定剂为硫酸镁、葡萄糖或甘露醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨1克，pH自然溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；所述的MYG固体再生培养基为：在所述的MYG液体培养基中加入15克的琼脂即得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的真菌表达载体为含有外源目的基因的pAN7-1真菌表达质粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的外源基因为动物﹑植物或细菌来源的基因。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的外源目的基因为p53基因。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的灵芝为赤芝。