CN1188802A - 外源基因转化灵芝的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用外源基团转化灵芝的方法,其特征是将灵芝菌丝酶解制取灵芝原生质体,然后以含有外源基因的真菌表达质粒为载体,采用PEG介导的转化法,对灵芝原生质体进行转化处理,再将转化处理后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养,从而获得灵芝转化株。本发明方法能有效地将外源基因转化入灵芝原生质体中,并得到稳定的复制和表达,从而建立了灵芝的转化系统。这将为灵芝开辟广阔的应用领域,使得灵芝这一宝贵的资源得到更充分的利用。
Description
本发明涉及一种利用基因工程技术将外源基因转化入灵芝的方法。
灵芝是一种珍贵的药用和食用真菌，由于其对多种疾病尤其是当今医学上的一些顽症如肝炎、心血管疾病、癌症等具有显著的疗效，因而已引起国际医学界的重视，并已广泛开展了对其生化药理及临床应用等方面的研究。但目前关于灵芝的分子生物学方面的研究报道还很少，迄今尚未有外源基因成功地在灵芝中表达的报道。灵芝是一种大型药用和食用真菌，以它作为基因工程的受体菌，有着与细菌、酵母菌不同的独特优点。它是一种应用前景很广的异源基因表达系统，因此，通过基因工程技术建立稳定的灵芝转化系统，对充分利用和开发灵芝这一珍贵的资源有着重要的意义。
本发明的目的是研究并提供一种利用外源基因转化灵芝的方法，以便建立稳定有效的灵芝外源基因转化体系，从而能够直接有效地获得具有优良遗传性状或重要经济价值的表达产物的转基因灵芝新菌种。
本发明方法是将灵芝菌丝用溶壁酶酶解并制成纯化的灵芝原生质体，然后以含有外源基因(即目的基因，如抗性基因等)的真菌表达质粒为载体，采用PEG介导的转化法，对该纯化的灵芝原生质体进行转化处理，再将处理后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。
本发明方法一般包括以下具体步骤：
(1).取新鲜灵芝湿菌丝，按每克湿菌丝2-10ml酶液的比例加入溶壁酶液，30-35℃酶解1.5-30小时；
(2).将上述酶解液用G3砂芯漏斗过滤，滤液经离心(通常为3000-5000r/min 5-10min)去上清液，再用0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂洗涤1-3次，得到纯化的灵芝原生质体；
(3).将纯化的灵芝原生质体以1×108个/ml的浓度悬浮于液体再生培养基中，然后取1ml原生质体悬液，离心去掉上清液后，再将原生质体悬浮在200-300μl再生培养基中，并加入所选用的质粒载体5-20μg和PEG缓冲液50-100μl(如果同时加入肝素钠50-100μg，可更有利于提高转化率)，冰浴30-60分钟，再加入0.5-1mlPEG缓冲液，混匀后于25-28℃温育10-30分钟，然后离心沉淀原生质体(通常为3000-5000r/min 5-10min)；
(4).将上述经转化处理的原生质体悬浮于1ml液体再生培养基中，25-28℃静置培养3-5天，再涂布于含有选择因子的再生培养基平板上，25-28℃倒置培养4-8天，即可得到灵芝转化株。
在本发明方法中：
所用的溶壁酶液(简称酶液)的成份及其配比通常为：溶壁酶1-2.5％(w/v)，纤维素酶0.5-2.5％(w/v)，渗透压稳定剂0.5-0.8mol/L。可由1-2.5g溶壁酶和0.5-2.5g纤维素酶溶解于100mL 0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液而成。
所用的渗透压稳定剂通常为硫酸镁或甘露醇。
所用的再生培养基为常规使用的真菌原生质体再生培养基，通常使用的为纤维二糖再生培养基和MYG再生培养基，它们的配方分别为：
纤维二糖液体再生培养基：纤维二糖15克，蛋白胨2克，酵母粉4克，溶于0.5-0.8mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。
MYG液体再生培养基：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，pH自然，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。
纤维二糖、MYG固体再生培养基：相应的液体培养基中加入1.5％的琼脂。
所用的质粒载体通常优选pAN7-1真菌表达质粒。该质粒所带的大肠杆菌hph基因上游和下游分别与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子和色氨酸合成酶C基因(trpC)转录终止序列连接而能在真菌中表达(Peter J.Punt etal.，1987，Gene，56：117-124)。PEG缓冲液各成份的配比为：PEG4000 40-60％(w/v)，CaCl2 5-10mmol/L，Tris(pH7.4)5-10mmol/L。
本发明方法中用于制取灵芝原生质体的新鲜灵芝菌丝可通过以下方法培养得到：取PDA斜面上生长旺盛的灵芝菌丝，接种于液体PDA培养基中(PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，加水至1L，pH自然)，25-28℃培养2-4天，然后以3000-5000r/min离心5-10min，去上清液，用0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液洗涤1-3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
本发明方法适用于现有的各种灵芝菌种，例如泰山赤灵芝，日本灵芝，韩国灵芝等。以下结合附图说明本发明方法的效果及意义。
图1是未经转化处理的灵芝原生质体在含有100μg/ml HmB(潮霉素)的MYG平板上培养5天后的结果；
图2是经本发明方法用pAN7-1质粒转化处理的灵芝原生质体在含有100μg/ml HmB的MYG平板上生长5天后的结果；
图3是经本发明方法转化处理得到的16株抗性转化株在不含HmB的MYG平板上经过连续4代的传代后，转接到含有100μg/ml HmB的MYG平板上培养5天后的结果；
图4是两株灵芝转化株的Southern杂交结果图。其中1号泳道为质粒pAN7-1的Southern杂交结果；2号泳道为未转化灵芝总DNA的Southern杂交结果；3和4号泳道分别为灵芝转化株A的总DNA不做酶切和经HindIII酶切的Southern杂交结果；5和6号泳道分别为灵芝转化株B总DNA不做酶切和经HindIII酶切的Southern杂交结果。
如图1至图3所示，经本发明方法用pAN7-1质粒转化处理的灵芝原生质体在含有HmB的MYG平板上生长出众多菌株，而且这些菌株在无选择压力的情况下经过4代传代后，仍能保持良好的HmB抗性；而未经本发明方法处理的灵芝原生质体则全部不能在含HmB的MYG平板上生长；说明本发明方法已有效地将pAN7-1质粒转化入灵芝中，并且使该质粒上的hph基因在灵芝中得到稳定表达，因此灵芝转化株表现出外源基因所具有的HmB抗性，并且转化株在无选择压力的情况下经多代传代后仍具有较强的HmB抗性，说明转化株中外源基因的表达具有较强的稳定性。图4所示的Southern鉴定结果表明，在灵芝转化株中外源质粒已进入灵芝中，但并未整合进灵芝染色体DNA中，而是质粒通过内源重组方式从宿主菌(灵芝)中获得了其DNA中一段与DNA复制有关的序列，因而新形成的载体可以游离存在于灵芝中，并稳定地复制和表达。
上述结果说明本发明方法能有效地将外源基因转化入灵芝中，并使之得到稳定的复制和表达，从而建立了灵芝的转化系统。
本发明方法所建立的灵芝转化系统，为灵芝开辟了广阔的应用领域，将使灵芝这一宝贵资源得到更充分的利用。具体说来，主要包括：
1.灵芝有着很高的蛋白质分泌能力，能正确进行表达产物的翻译后加工，包括肽链剪切和糖基化等，且糖基化的方式与高等真核生物的类似，而且灵芝还是已经确认的安全菌株，对人体有益无害，并有成熟的发酵和后处理工艺，因而可以利用灵芝转化技术将一些具有重要经济价值的、来自高等生物的外源基因导入灵芝中表达。这样，利用灵芝发酵方法即可快速、大规模、廉价地生产具有活性的外源蛋白质。
2.通过灵芝转化技术将一些与优良性状有关的基因导入灵芝中，可在短时间内快速定向改良灵芝菌株，培育出优质高产的灵芝新品种。
3.在基础研究方面，灵芝的转化作为真菌的基因克隆和表达系统，可用于基因分离、基因组结构、基因表达及其调控等方面的研究，并且可为建立其它大型真菌的转化系统提供理论和实验依据。
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：称取1克灵芝湿菌丝，加3ml酶液(1g溶壁酶，0.5g纤维素酶，溶于100mL0.6mol/L的硫酸镁溶液中)，35℃酶解2小时。将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，3000r/min离心10分钟，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗涤两次，得纯化的原生质体。
取精制(纯化)后的灵芝原生质体1×108个悬浮在200μl纤维二糖再生培养基中，然后加入5μg pAN7-1，加入50μl PEG缓冲液[40％PEG4000，5mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris(pH7.4)]，冰浴30分钟。然后加入0.5ml PEG缓冲液，混匀后26℃温育10分钟，3000r/min离心10分钟，沉淀原生质体，然后重新悬浮于1ml纤维二糖再生培养基中，26℃静止培养5天，涂布于含有100μg/ml HmB的纤维二糖再生培养基平板，在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株。转化频率约为2个转化子/μg pAN7-1+107个原生质体。
实施例2：称取2克灵芝湿菌丝，加8ml酶液(2g溶壁酶，2.5g纤维素酶，溶于100mL0.5mol/L硫酸镁溶液)，30℃酶解2.5小时。将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，4000r/min离心10分钟，去上清液，用0.5mol/L硫酸镁洗涤两次，得纯化的原生质体。
取精制(纯化)后的灵芝原生质体1×108个悬浮在250μl纤维二糖再生培养基中，然后加入10μg pAN7-1，加入50μl PEG缓冲液[60％PEG4000，10mmol/LCaCl2，5mmol/L Tris(pH7.4)]，冰浴40分钟。然后加入1ml PEG缓冲液，混匀后26℃温育20分钟，3000r/min离心8分钟，沉淀原生质体，然后重新悬浮于1ml纤维二糖再生培养基中，26℃静止培养5天，涂布于含有100μg/ml HmB的纤维二糖再生培养基平板，在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株。转化频率约为4个转化子/μg pAN7-1+107个原生质体。
实施例3：称取4克灵芝湿菌丝，加10ml酶液(2.5g溶壁酶，0.5g纤维素酶，溶于100mL0.8mol/L甘露醇中)，32℃酶解2.5小时。将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，3500r/min离心10分钟，去上清液，用0.8mol/L甘露醇洗涤两次，得纯化的原生质体。
取精制(纯化)后的灵芝原生质体1×108个，悬浮在250μl MYG再生培养基中，然后加入10μg pAN7-1，加入100μl PEG缓冲液[60％PEG4000，10mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris(pH7.4)]，冰浴30分钟。然后加入1ml PEG缓冲液，混匀后26℃温育15分钟，3000r/min离心15分钟，沉淀原生质体，然后重新悬浮于1ml MYG再生培养基中，26℃静止培养5天，涂布于含有100μg/ml HmB的MYG再生培养基平板。在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株。转化频率约为3个转化子/μg pAN7-1+107个原生质体。
Claims (6)
1.一种外源基因转化灵芝的方法，其特征是将灵芝菌丝用溶壁酶酶解并制成纯化的灵芝原生质体，然后以含有外源基因的真菌表达质粒为载体，采用PEG介导的转化法，对该纯化的灵芝原生质体进行转化处理，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是包括如下具体步骤：
(1).取新鲜灵芝湿菌丝，按每克湿菌丝2-10ml酶液的比例加入溶壁酶液,30-35℃酶解1.5-3.0小时；
(2).将上述酶解液用G3砂芯漏斗过滤，滤液经离心去上清液，再用0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂洗涤1-3次，得到纯化的灵芝原生质体；
(3).将纯化的灵芝原生质体以1×108个/ml的浓度悬浮于液体再生培养基中，然后取1ml原生质体悬液，离心去掉上清液后，再将原生质体悬浮在200-300μl再生培养基中，并加入所选用的质粒载体5-20μg和PEG缓冲液50-100μl，冰浴30-60分钟，再加入0.5-1ml PEG缓冲液，混匀后于25-28℃温育10-30分钟，然后离心沉淀原生质体；
(4).将上述经转化处理的灵芝原生质体悬浮于1ml液体再生培养基中，25-28℃静置培养3-5天，再涂布于含有选择因子的再生培养基平板上，25-28℃倒置培养4-8天，即可得到灵芝转化株。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征是步骤(3)中在加入质粒载体的同时，加入肝素钠50-100μg。
4.按照权利要求1、2或3所述的方法，其特征是所用溶壁酶液的成份及其配比为：溶壁酶1-2.5％(w/v)，纤维素酶0.5-2.5％(w/v)，渗透压稳定剂0.5-0.8mol/L。
5.按照权利要求1、2或3所述的方法，其特征是所用的真菌表达质粒为pAN7-1。
6.按照权利要求2或3所述的方法，其特征是所用PEG缓冲液的成份及其配比为：PEG4000 40-60％(w/v)，CaCl2 5-10mmol/L，Tris(pH7.4)5-10mmol/L.
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| CN105039183A (zh) * | 2015-08-28 | 2015-11-11 | 广东省微生物研究所 | 一种埃德菌fs110原生质体及其制备方法和转化方法 |
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1998
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