CN110656051B - 一种制备食药用真菌原生质体的方法 - Google Patents

一种制备食药用真菌原生质体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备高质量食药用真菌原生质体的方法，属于真菌的生物学领域。本发明方法为在食药用真菌静置培养过程中外源添加一定量的苯丙氨酸，使得食药用真菌细胞壁厚度降低58.58％，从而提供有助于原生质体制备的菌丝体，且可以高效、稳定地为食药用真菌遗传转化操作制备高质量原生质体。

Description

一种制备食药用真菌原生质体的方法
技术领域
本发明涉及一种制备食药用真菌原生质体的方法，属于真菌的生物学领域。
背景技术
食药用真菌，隶属担子菌纲或子囊菌纲，可经过复杂的代谢途径合成多糖、萜类化合物、凝集素、内酯等各类生物活性物质，通过基因遗传操作手段对食用菌开展分子水平的研究，有助于研究者进一步了解食药用真菌的生理代谢机制。
原生质体是一种可用于细胞壁再生、机体响应应激、信号传导、基因功能验证等研究的多用途细胞体系。制备原生质体时，人为添加酶制剂使原有细胞壁酶解，得到具有活性的细胞团，是食药用真菌遗传转化过程中的重要技术之一。目前食药用真菌的原生质体的制备仍处于较为落后的状态，由于真菌细胞壁的成分极为复杂，且在不同菌株间存在很大差异，细胞壁的酶解效果往往较差，从而直接导致原生质体形成率和复生率的降低，为后续实验，如外源基因的导入，带来一定难度。因此，开发一种易操作、用时短、效率高的食用菌原生质体制备的方法将为食药用真菌分子水平的理论研究提供技术支撑。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有的制备真菌，尤其是制备食药用真菌的原生质体的方法效率低下，原生质体形成率和复生率较低。
[技术方案]
本发明提供了一种制备真菌原生质体的方法，是在制备真菌菌体的过程中向培养基中添加苯丙氨酸，再利用酶处理菌丝体，然后从酶解液中分离得到真菌原生质体。具体地，可采用以下步骤：
(1)活化培养真菌；
(2)将活化后的真菌进行静置培养，培养基中添加苯丙氨酸；
(3)收集步骤(2)静置培养得到的菌丝体，用蜗牛酶及溶壁酶进行酶解处理，将酶解液进行过滤，从滤液中收集得到原生质体。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)活化培养真菌时，可采用下述具体过程：取真菌菌块，接种种子培养基中，在振荡条件下培养。每一升种子培养基含有葡萄糖20～30g，胰蛋白胨8～10g，酵母粉5～8g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，七水硫酸镁0.5～1.5g，维生素B10.05～0.15g。更进一步地，可选用下述条件：取0.5cm2大小的真菌菌块，接种到装液量80mL/250mL三角瓶的种子培养基中，150～200r·min-1、25～33℃培养6～8d。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中对活化后的真菌进行静置培养时，可采用下述具体过程：配置发酵培养基，向发酵培养基中添加0.1～0.8g/L的苯丙氨酸，将活化后的真菌菌丝体接入到发酵培养基中进行静置培养。每一升发酵培养基含有葡萄糖20～30g，胰蛋白胨8～10g，酵母粉5～8g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，七水硫酸镁0.5～1.5g，维生素B10.05～0.15g。所述静置培养的时间为3-5d，静置培养过程中可间歇手动摇动培养基。所述静置培养的温度为25～33℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中收集步骤(2)静置培养得到的菌丝体，分别用水、0.6M甘露醇溶液对菌体进行洗涤，然后向菌丝体中添加蜗牛酶与溶壁酶，利用蜗牛酶与溶壁酶处理菌丝体。酶解结束后，将酶解液过滤以除去未被酶解的菌丝，然后，收集滤液中的原生质体。
本发明所述真菌为食药用真菌。所述食药用真菌包括但不限于灵芝(Ganodermalucidum)、阿魏蘑(Pleurotus ferulae)、秀珍菇(Pleurotus geesteranus)、灰树花(Griflola frondosa)及其常见的生物分类学上亲缘关系相近或性状相近的食药用真菌。
[有益效果]：本发明在发酵过程中通过添加苯丙氨酸，在不增加原有培养周期的基础上，通过降低细胞壁厚度从而显著提高了食药用真菌原生质体的制备质量，最大原生质体形成率与再生率提高幅度达15％以上。
附图说明
图1A基于实施例1的实验方法所获得的灵芝细胞透射电镜图。
图1B制备完成的原生质体(400倍光学显微镜下观察)。
图1C原生质体在再生培养基上形成的菌落。
图2A基于实施例2的实验方法所获得的灵芝细胞透射电镜图。
图2B制备完成的原生质体(400倍光学显微镜下观察)。
图2C原生质体在再生培养基上形成的菌落(C)。
具体实施方式
种子培养基与发酵培养基每升含有葡萄糖30g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁1g，维生素B1 0.1g，自然pH。
再生培养基每升含有葡萄糖20g，麦芽糖10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨5g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾4.6g，甘露醇109.3g和琼脂20g。
蜗牛酶(Snailase)的来源：合肥博美生物科技有限责任公司；产品形态：冻干粉。
溶壁酶(Lywallzyme)的来源：广东省微生物菌种保藏中心；产品形态：冻干粉；易溶于水，活性稳定，较耐高温，便于贮存，产品质量稳定。
原生质体的形成率的检测及计算公式：将酶解结束后多数已经原生质体化的混合液，分别等量悬浮于0.6M甘露醇溶液(A)和无菌水(B)中，然后分别涂布在于高渗的再生培养基上，长出菌落(28℃培养7-10天)，计数二者的菌落数，并计算原生质体的形成率：(A-B)/A×100％；其中，A：高渗溶液(0.6M甘露醇溶液)可以使得原生质体化与未原生质体化细胞都处于正常状态，因此将细胞置于高渗溶液中并涂布计数，可得到原生质体化与未原生质体化的细胞的总数；B：在无菌水中原生质体化的细胞会由于渗透压作用破裂，因此将细胞置于无菌水中并涂布计数，可得到未原生质体化的细胞的数量。
原生质体的再生率的计算公式：将酶解结束后多数已经原生质体化的混合液涂布在再生培养基上(28℃培养7-10天)，长出菌落，统计菌落数。将酶解结束后多数已经原生质体化的混合液在显微镜视野中计数，统计原生质体数。在再生培养基上形成菌落数/原生质体总数(以血球计数法计算)×100％。原生质体数(个/mL)＝(80个小格内的细胞数/80)×400×10000×稀释倍数，其中，400表示计数板上每一大方格都是由400个小方格组成，10000表示每个大方格体积为1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)＝0.1mm3，而1mL＝1000mm3。
实施例1灵芝培养过程中不添加苯丙氨酸仅酶解
(1)灵芝的种子培养：取0.5cm2大小的灵芝菌块，接种到装液量80mL/250mL三角瓶的种子培养基中，150r·min-1、30℃培养7d。
(2)灵芝的二级静置培养：向250mL三角瓶中加入80mL发酵培养基，115℃灭菌20分钟。接种湿重2g的灵芝菌丝体，静置培养4d，每12h手动摇匀一次。
(3)二级静置培养结束后，通过透射电镜(TEM)观察细胞壁厚度，并制备原生质体。
①取步骤(2)液态静置培养4d得到的二级灵芝菌体，6500rpm离心10min，收集菌体，向菌体中加入30mL无菌水，对菌体进行洗涤，6500rpm离心10min，收集菌体。最后，向菌体中加入0.6M甘露醇(甘露醇溶于pH 6.0的磷酸缓冲液)，对菌体进行洗涤，6500rpm离心10min，将菌体收集至5mL离心管。
②配置2％(g/100mL)的蜗牛酶及2％(g/100mL)溶壁酶(利用pH 6.0磷酸缓冲液配置的0.6M甘露醇溶液进行溶解)经灭菌的0.22μm水系微孔滤膜过滤，于冰上保存备用。
③每300mg湿菌丝加1mL溶壁酶及500μL蜗牛酶，震荡混匀，于30℃摇床上酶解2.5h。
④酶解结束后，将酶解液吸入到5mL无菌注射器中，滤头中装有4层擦镜纸过滤除去大部分未酶解的菌丝。将滤液于4℃、3500rpm离心10min，小心去掉上清液。
⑤将步骤④收集得到的沉淀加入到0.6M甘露醇缓冲液中，4℃、3500rpm离心10min，再次小心去上清，收集沉淀即得到原生质体。
电镜观察结果显示，经过二级静置培养得到的灵芝的细胞壁厚度为0.17μm(图1A)，原生质体的形成率(图1B)与再生率(图1C)分别为84.16％和0.78％。
实施例2灵芝培养过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸促进原生质体的制备
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，步骤(2)中在配置发酵培养基时就向发酵培养基中添加了苯丙氨酸，使其终浓度为0.5g/L。静置培养结束后，通过TEM观察细胞壁厚度，并制备原生质体，制备原生质体过程中酶解2.5h。结果显示，经过二级静置培养得到的灵芝的细胞壁厚度为0.07μm(图2A)，相对于实施例1细胞壁厚度降低了58.82％。原生质体的形成率(图2B)与再生率(图2C)分别为98.64％和1.42％。相对于实施例1分别提高了17.20％和82.05％。
实施例3灵芝培养过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸促进原生质体的制备
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，步骤(2)中在配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加了苯丙氨酸，使其终浓度为0.1g/L。静置培养结束后，步骤(3)③中制备原生质体过程中的酶解时间2.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为97.35％和1.21％。相对于实施例1分别提高了15.67％和55.13％。
实施例4灵芝培养过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸促进原生质体的制备
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，步骤(2)中在配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加了苯丙氨酸，使其终浓度为0.8g/L。静置培养结束后，步骤(3)③中制备原生质体过程中的酶解时间2.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为97.12％和1.22％。相对于实施例1分别提高了15.40％和56.41％。
实施例5灵芝培养过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸促进原生质体的制备
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，步骤(2)中在配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加了苯丙氨酸，使其终浓度为0.5g/L。静置培养结束后，步骤(3)③中制备原生质体过程中的酶解时间1.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为89.13％和1.24％。相对于实施例1分别提高了5.91％和58.97％。
实施例6灵芝培养过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸促进原生质体的制备
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，步骤(2)中在配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加了苯丙氨酸，使其终浓度为0.5g/L。静置培养结束后，步骤(3)③中制备原生质体过程中的酶解时间2h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为93.24％和1.37％。相对于实施例1分别提高了10.79％和75.64％。
实施例7不添加苯丙氨酸仅通过酶解来制备阿魏蘑原生质体
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，实验菌株选用阿魏蘑。静置培养结束后，制备原生质体过程中酶解2.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为84.27％和0.75％。
实施例8阿魏蘑培养过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸促进原生质体的制备
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，实验菌株选用阿魏蘑，步骤(2)中配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加苯丙氨酸，使其终浓度为0.5g/L。静置培养结束后，制备原生质体过程中酶解时间为2.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为97.36％和1.13％。相对于实施例7分别提高了15.53％和50.67％。
表1实施例1-6及对照实施例1-2参数及所制备的灵芝原生质体
苯丙氨酸添加量(g/L) 酶解时间(h) 原生质体形成率(％) 原生质体再生率(％)
0 2.5 84.16％ 0.78％
0.1 2.5 97.35％ 1.21％
0.5 2.5 98.64％ 1.42％
0.8 2.5 97.12％ 1.22％
0.5 1.5 89.13％ 1.24％
0.5 2.0 93.24％ 1.37％
1.5 2.5 94.35％ 0.68％
1.5 1.0 48.42％ 0.47％
实施例9不添加苯丙氨酸仅通过酶解来制备秀珍菇原生质体
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，实验菌株选用秀珍菇。培养结束后，制备原生质体过程中酶解时间为2.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为82.89％和0.73％。
实施例10秀珍菇培养过程中向发酵培养基中添加苯丙氨酸促进原生质体的制备
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，实验菌株选用秀珍菇，步骤(2)中配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加苯丙氨酸，使其终浓度为0.5g/L。静置培养结束后，制备原生质体过程中酶解时间为2.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为94.47％和1.38％。相对于实施例9分别提高了13.97％和89.04％。
对比实施例1
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，步骤(2)中配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加苯丙氨酸，使其终浓度为1.5g/L。静置培养结束后，步骤(3)③中制备原生质体过程中酶解2.5h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为94.35％和0.68％。相对于实施例1形成率提高了12.11％，但是再生率降低12.82％。由此可以看出苯丙氨酸的浓度过高会使得原生质体再生率降低。
对比实施例2
培养基和培养方法同实施例1，区别在于，步骤(2)中在配置发酵培养基时，向发酵培养基中添加了苯丙氨酸，使其终浓度为1.5g/L。静置培养结束后，步骤(3)③中制备原生质体过程中的酶解时间选择1h。结果显示，原生质体的形成率与再生率分别为48.42％和0.47％。相对于实施例1形成率降低42.47％，再生率降低了39.74％。
本申请所指的食药用真菌不局限于现阶段为人们所知的食药用真菌，与已知的食药用真菌存在相似性的已知或未知种属的真菌皆适用于本申请的方法，并能够达到制备原生质体的形成率与再生率提高的近似效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种制备真菌原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）活化培养真菌；
（2）配置发酵培养基，向发酵培养基中添加0.1~0.8 g/L的苯丙氨酸，将活化后的真菌菌丝体接入到发酵培养基中进行静置培养3-5 d，静置培养的温度为25~33℃；每一升发酵培养基含有葡萄糖20~30 g，胰蛋白胨8~10 g，酵母粉5~8 g，磷酸二氢钾0.5~1.5 g，七水硫酸镁0.5~1.5 g，维生素B1 0.05~0.15 g；
（3）收集步骤（2）静置培养得到的菌丝体，分别用水、0.6 M甘露醇溶液对菌体进行洗涤，然后向菌丝体中添加0.2g蜗牛酶/ 3g菌丝体与0.1g 溶壁酶/ 3g菌丝体，利用蜗牛酶与溶壁酶对菌丝体进行酶解，酶解时间为1.5~2.5h，酶解结束后，将酶解液进行过滤以除去未被酶解的菌丝，从滤液中收集得到原生质体。
2.根据权利要求1所述的一种制备真菌原生质体的方法，其特征在于，步骤（1）活化培养真菌时，采用下述步骤：取真菌菌块，接种到种子培养基中，在25~33℃、150~200 r·min-1振荡条件下培养6~8 d。
3.根据权利要求1所述的一种制备真菌原生质体的方法，其特征在于，静置培养过程中间歇手动摇动培养基。
4.根据权利要求1~3任一所述的一种制备真菌原生质体的方法，其特征在于，所述真菌为食药用真菌，包括但不限于灵芝（Ganoderma lucidum）、阿魏蘑（Pleurotus ferulae）、秀珍菇（Pleurotusgeesteranus）、灰树花（Griflolafrondosa）及其常见的生物分类学上亲缘关系相近或性状相近的食药用真菌。
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