CN112375689A - 菌丝培养方法及利用其制备和再生原生质体的方法 - Google Patents

菌丝培养方法及利用其制备和再生原生质体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了菌丝培养方法，包括：将无菌玻璃纸放置于固体培养基的表面上，后将菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上，培养，所得菌丝体直接用于原生质体制备。本发明还公开了桦褐孔菌原生质体的制备方法，包括：将无菌玻璃纸平铺在PDA培养基平板上，将桦褐孔菌菌丝接接种于无菌玻璃纸上，培养；从无菌玻璃纸上刮取到培养好的桦褐孔菌菌丝体，酶解并过滤得到桦褐孔菌原生质体。本发明还公开了桦褐孔菌原生质体的再生方法，包括将原生质体涂布于再生培养基上进行再生培养。本发明制得的桦褐孔菌原生质体呈均一球状，质量高。本发明在无菌玻璃纸上培养菌丝，无需繁琐操作直接刮取即可直接用于原生质体制备，不易污染，易于操作。

Description

菌丝培养方法及利用其制备和再生原生质体的方法
技术领域
本发明属于食药用菌育种领域，涉及一种菌丝培养方法，特别涉及利用菌丝培养方法制备及再生原生质体的方法。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr.)Pilat)为层菌纲，非褐菌目，多孔菌科，褐卧孔菌属药用真菌，常生长在桦树、杨树等树种上，主要分布在芬兰、波兰、俄罗斯、我国大小兴安岭、长白山区、日本北海道及北美北部等高纬度寒冷地区(Fradj等，2019)。作为一种珍稀药用菌，桦褐孔菌广泛应用于抗肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病等治疗(Patel，2015；.Burmasova等，2019)。然而，桦褐孔菌野生资源有限，自然条件下不易形成子实体，野生菌核产量低；人工栽培形成菌核产量也较低(Balandaykin等，2015；贺紫薇等，2020)。因此，随着桦褐孔菌市场需求增加，采用菌丝体培养替代野生菌核应用可缓解桦褐孔菌野生资源的不足。桦褐孔菌中主要活性成分为多糖类、三萜类、多酚类、生物碱类等化合物，为了提高桦褐孔菌中活性成分的产量，选育出性状优良的高产菌株对进一步开发利用具有重要的意义。在食药用菌育种中，制备优质的原生质体是关键步骤，是完成菌种诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种的基础。桦褐孔菌由于不易形成子实体，很难获得孢子，因此，制备优质的原生质体在桦褐孔菌的育种中尤为重要。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明另有一个目的是提供一种菌丝培养方法。
本发明还有一个目的是提供一种桦褐孔菌原生质体的制备方法。
本发明再有一个目的是提供一种桦褐孔菌原生质体的再生方法。
为此，本发明提供的技术方案为：
菌丝培养方法，包括如下步骤：将无菌玻璃纸放置于固体培养基的表面上，将菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上，培养，所得菌丝体直接用于原生质体制备。
桦褐孔菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将无菌玻璃纸平铺在PDA培养基平板上，将桦褐孔菌菌丝接接种于所述无菌玻璃纸上，培养6-10天；
步骤二、从所述无菌玻璃纸上刮取到培养好的桦褐孔菌菌丝体，酶解分离得到桦褐孔菌原生质体。
优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，步骤一中，获取所述桦褐孔菌菌丝的方法包括如下步骤：已长满桦褐孔菌的PDA培养基平板边缘生长的菌丝用打孔器打孔获取到带有桦褐孔菌菌丝块，将所述菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上。
优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，步骤二中，酶解的方法包括如下步骤：将培养好的桦褐孔菌菌丝体刮取，加入混合酶解液后于温度32-35℃和转动条件100rpm下，酶解3-4h。
优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，所述混合酶解液包括质量比1-3:1的溶壁酶和蜗牛酶，混合酶解液的浓度为20-30mg/ml。
优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，步骤二中，分离的方法包括如下步骤：所得酶解液通过若干层擦镜纸过滤后离心，沉淀即为所述桦褐孔菌原生质体。
优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，步骤二中，采用渗透压稳定剂溶液溶解溶壁酶和蜗牛酶形成所述混合酶解液。
优选的是，所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法中，所述渗透压稳定剂为浓度0.6M的MgSO4溶液。
桦褐孔菌原生质体的再生方法，包括如下步骤：将原生质体涂布于再生培养基上进行再生培养；
所述再生培养基包含如下浓度的组分：土豆200g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物4g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，琼脂粉15-20g/L，渗透压稳定剂作为溶剂，定容至1000mL，pH自然；
所述渗透压稳定剂为浓度0.6M的MgSO4溶液。
本发明至少包括以下有益效果：
采用本发明的方法制得的桦褐孔菌原生质体呈均一球状，质量高，原生质体浓度可达5×106个/mL以上。并且，本发明在无菌玻璃纸上接种和培养菌丝，无需繁琐操作直接刮取即可直接用于原生质体制备，不易污染，易于操作。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例中的桦褐孔菌菌丝培养图，菌丝培养时间为6天；
图2为本发明其中一个实施例中10×10倍显微镜下的原生质体释放图，其中球状为原生质体；
图3为本发明其中一个实施例中原生质体再生菌落图，其中，3A为桦褐孔菌出发菌株，3B为原生质体再生菌株，培养时间为8天。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种菌丝培养方法，包括如下步骤：将无菌玻璃纸放置于固体培养基的表面上，将菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上，培养，所得菌丝体直接用于原生质体制备。
本发明还提供了桦褐孔菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将无菌玻璃纸平铺在PDA培养基平板上，将桦褐孔菌菌丝接种于所述无菌玻璃纸上，培养6-10天；
步骤二、从所述无菌玻璃纸上刮取到培养好的桦褐孔菌菌丝体，酶解分离得到桦褐孔菌原生质体。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤一中，获取所述桦褐孔菌菌丝的方法包括如下步骤：已长满桦褐孔菌的PDA培养基平板边缘生长的菌丝用打孔器打孔获取到带有桦褐孔菌菌丝块，直接接种于所述无菌玻璃纸上。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤二中，酶解的方法包括如下步骤：将培养好的桦褐孔菌菌丝体刮取，加入混合酶解液后于温度32-35℃和转动条件100rpm下，酶解3-4h。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述混合酶解液包括质量比1-3:1的溶壁酶和蜗牛酶，混合酶解液的浓度为20-30mg/mL。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤二中，分离的方法包括如下步骤：所得酶解液通过若干层擦镜纸过滤后离心，沉淀即为所述桦褐孔菌原生质体。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤二中，采用渗透压稳定剂溶液溶解溶壁酶和蜗牛酶形成所述混合酶解液。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述渗透压稳定剂为浓度0.6M的MgSO4溶液。
桦褐孔菌原生质体的再生方法，包括如下步骤：将原生质体涂布于再生培养基上进行再生培养；
所述再生培养基包含如下浓度的组分：土豆200g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物4g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，琼脂粉15-20g/L，渗透压稳定剂作为溶剂，定容至1000mL，pH自然；
所述渗透压稳定剂为浓度0.6M的MgSO4溶液。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
本发明提供一种桦褐孔菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、菌丝培养：将无菌玻璃纸平铺在PDA平板上备用。将已长满桦褐孔菌的平板边缘生长的菌丝用直径5mm的打孔器打孔，带有菌丝的琼脂块接于带有玻璃纸的PDA平板上，25℃培养6-10天；
步骤二、菌丝酶解：培养好的菌丝用无菌牙签挑起，置于无菌50mL三角瓶中，将混合酶系加入三角瓶中，32-35℃，100rpm酶解3-4h，期间需取出酶解液显微镜下观察原生质体释放情况，混合酶系浓度为20-30mg/mL；混合酶系的质量比溶壁酶：蜗牛酶＝1-3:1；混合酶系需经0.22μm无菌滤器过滤；渗透压稳定剂为0.6M的MgSO4。
步骤三、原生质体收集及再生：酶解后的菌丝体经4层无菌擦镜纸过滤，收集到50mL离心管中，4℃、3000×g离心10min，所得沉淀即为原生质体；得到的原生质体用渗透压稳定剂稀释到适宜的浓度，分别涂布于用渗透压稳定剂配制的再生培养基和用纯水配制的再生培养基中，计算原生质体再生率。
再生培养基包含如下浓度的组分：土豆200g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物4g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，琼脂粉15-20g/L，渗透压稳定剂作为溶剂，定容至1000mL，pH自然。
实施例1
桦褐孔菌菌丝培养
用直径5mm的打孔器在长满桦褐孔菌的平板边缘打孔，带有菌丝的琼脂块接于带有无菌玻璃纸的PDA平板上，25℃培养6-10天(如图1)，即得到用于制备原生质体的菌丝体。
实施例2
桦褐孔菌菌丝酶解及原生质体制备
将长好的菌丝体用无菌牙签挑至无菌50mL三角瓶中备用。称取0.2g溶壁酶及0.1g蜗牛酶于50mL离心管中，在加入0.6M的MgSO4稳渗剂10mL充分溶解，混合酶系添加比例为每克菌丝加10mL酶液，菌丝量不足1g按1g计算添加酶液。溶解后经0.22μm无菌滤器过滤至装有菌丝的三角瓶中，32℃，100rpm酶解3.5h，显微镜下镜检原生质体释放情况，如图2所示，原生质体得到充分释放，经血球计数板计数，浓度可达6.32×106个/mL。
实施例3
原生质体收集及再生
菌丝酶解液用四层无菌擦镜纸过滤，所得滤液收集到50mL离心管中，4℃、3000×g离心10min，所得沉淀即为原生质体；得到的原生质体用渗透压稳定剂稀释到适宜的浓度，分别涂布于用渗透压稳定剂配制的再生培养基和用纯水配制的再生培养基中，计算原生质体再生率。原生质体再生率计算公式：
P＝(N1-N2)/N×100％
式中，N1为渗透压稳定剂配制的再生培养基中的菌落数，N2为纯水配制的再生培养基中的菌落数，N表示原生质体总数。
根据上述公式计算，原生质体的再生率为0.31％。将渗透压稳定剂配制的再生培养基上生长出来的菌落挑取至新的PDA平板上，观察菌落生长情况，如图3所示，再生得到的菌落与出发菌株生长状态一致，无明显差别。
实施例4
不同混合酶解液比例对桦褐孔菌原生质体制备的影响
本实施例方法同实施例2，区别在于酶解液的比例。分别采用溶壁酶：蜗牛酶＝1:1和2:1，加入10mL，0.6M MgSO4溶解并无菌过滤，终浓度为30mg/mL，用于原生质体制备。结果显示，溶壁酶与蜗牛酶比例为1:1时，原生质体浓度为2.01×106个/mL；溶壁酶与蜗牛酶比例为2:1时，原生质体浓度为5.38×106个/mL。
对比例
用无菌牙签将培养6天PDA固体培养基(含0.8％MgSO4)上的菌丝层刮起，置于50mL离心管中，在离心管中加入无菌水以及无菌玻璃珠后漩涡震荡至菌丝断裂成小片段，吸取1mL菌丝片段接种于PDA液体培养基(含0.8％MgSO4)中，静置培养12天，得到桦褐孔菌菌丝膜。
混合酶解液浓度为30mg/mL，溶壁酶与崩溃酶比例为2:1，称取60mg溶壁酶和30mg崩溃酶，加入3mL 0.6M MgSO4，溶解后0.22μm无菌滤膜过滤除菌。用无菌接种铲挑取生长好的菌丝膜置于50mL无菌离心管中，无菌水及渗透压稳定剂各洗两次后，无菌条件下吸干水分，加入混合酶液，32℃，90rpm酶解2h后镜检并统计原生质体浓度，用血球计数板计数，原生质体浓度为3.13×106个/mL。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的桦褐孔菌原生质体制备及再生的方法及菌丝培养方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.菌丝培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将无菌玻璃纸放置于固体培养基的表面上，后将菌丝块接种于所述无菌玻璃纸上，培养，所得菌丝体直接用于原生质体制备。
2.桦褐孔菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将无菌玻璃纸平铺在PDA培养基平板上，将桦褐孔菌菌丝接接种于所述无菌玻璃纸上，培养6-10天；
步骤二、从所述无菌玻璃纸上刮取到培养好的桦褐孔菌菌丝体，酶解分离得到桦褐孔菌原生质体。
3.如权利要求2所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法，其特征在于，步骤一中，获取所述桦褐孔菌菌丝的方法包括如下步骤：
已长满桦褐孔菌的PDA培养基平板边缘生长的菌丝用打孔器打孔获取到带有桦褐孔菌菌丝的块状物，将所述块状物接种于所述无菌玻璃纸上。
4.如权利要求2所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法，其特征在于，步骤二中，酶解的方法包括如下步骤：
将培养好的桦褐孔菌菌丝体刮取，加入混合酶解液后于温度32-35℃和转动条件100rpm下，酶解3-4h。
5.如权利要求4所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述混合酶解液包括质量比1-3:1的溶壁酶和蜗牛酶，混合酶解液的浓度为20-30mg/ml。
6.如权利要求4所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法，其特征在于，步骤二中，分离的方法包括如下步骤：
所得酶解液通过若干层擦镜纸过滤后离心，沉淀即为所述桦褐孔菌原生质体。
7.如权利要求5所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法，其特征在于，步骤二中，采用渗透压稳定剂溶液溶解溶壁酶和蜗牛酶形成所述混合酶解液。
8.如权利要求7所述的桦褐孔菌原生质体的制备方法，其特征在于，所述渗透压稳定剂为浓度0.6M的MgSO4溶液。
9.桦褐孔菌原生质体的再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
将原生质体涂布于再生培养基上进行再生培养；
所述再生培养基包含如下浓度的组分：土豆200g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物4g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，琼脂粉15-20g/L，渗透压稳定剂作为溶剂，定容至1000mL，pH自然；
所述渗透压稳定剂为浓度0.6M的MgSO4溶液。
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