CN115093979B - 一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法 - Google Patents

一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法，属于微生物工程技术领域，所述制备和再生方法包括收集菌丝体、酶解、收集原生质体和再生原生质体。本发明公开的芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法制备过程简单、高效，便于操作，产孢量大，缩短了产孢时间，能够较快获得幼嫩菌丝，并显著提高了可可毛色二孢原生质体制备数及再生率，原生质体制备数达到(2.0～6.0)×107个/mL，再生率最高达到43.2％；本发明公开的分解菌丝体的酶解液制备成本低，无需使用现有技术的崩溃酶，具有高经济效益的特点，适用于工业化大规模生产。

Description

一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法。
背景技术
芒果属漆树科芒果属，是一种美味可口的丰富营养型水果，具有“热带水果之王”的美誉，我国是世界第二大芒果生产国，截至2020年，全国芒果种植面积达524.1万亩，总产量330.6万吨，产值达205.2亿元。芒果蒂腐病由可可毛色二孢侵染所致，是芒果中危害最严重的病害之一，病原菌孢子在芒果花期、幼果期等生长敏感时期从果柄周围侵入，并潜伏在花果中，当果实进入成熟阶段，病原菌便开始快速繁殖并致害，从而引发芒果的腐烂。芒果蒂腐病严重降低芒果的商品价值，制约芒果产业的发展。利用原生质体进行遗传转化，寻找病原菌中的关键基因，验证相应基因功能，对致病机理的挖掘以及新型靶标位点的农药开发具有重要价值，不同种类的真菌细胞壁结构存在较大差异，因此不同真菌间的原生质体提取体系与程序皆存在较大差异。
目前，针对可可毛色二孢原生质体制备，大都沿用丝状真菌的制备方法，提取效率较低，再生率低，步骤繁琐且不经济，同时提取方法缺乏对可可毛色二孢菌的专一性。可可毛色二孢菌丝生长速度较快，可达50mm/day，由于菌丝生长较快，获得新鲜幼嫩菌丝较为困难，增加了原生质体提取的溶壁难度。分生孢子最初生长出来的菌丝，较为新鲜幼嫩，破壁难度低，但可可毛色二孢摇培不能产孢，且在PDA上培养，需要30d，甚至更久才能产生分生孢子，因此，急需一种能够获得快捷高效获得幼嫩菌丝的方法以解决原生质体破壁问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种操作简单、产孢量大、时间短的芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法，包括以下步骤：
S1.收集菌丝体：将可可毛色二孢培养后获得分生孢子，将获得的分生孢子转入PDS液体培养基中培养20～27h，收集菌丝体；
S2.酶解：将步骤S1获得的菌丝体中加入酶解液，在26～30℃的温度下酶解3～4h；其中，所述酶解液为：10～20g/L溶壁酶+10～20g/L蜗牛酶+0.5～1.0mol/L氯化钠溶液；
S3.收集原生质体：过滤酶解液，离心后沉淀中加入预冷的STC溶液重悬，得可可毛色二孢原生质体；
S4.再生原生质体：将步骤S3制备的原生质体接种于再生培养基中，于25～30℃培养2～3d，得再生的原生质体。
进一步地，步骤S1中所述可可毛色二孢培养的方法为：将可可毛色二孢活化后接种于MMS培养基上，16h光照8h黑暗条件下培养8d后获得分生孢子。
进一步地，步骤S1中所述PDS液体培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酸水解蛋白3g，酶水解蛋白3g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
进一步地，步骤S2中所述酶解液为：15g/L溶壁酶+15g/L蜗牛酶+0.7mol/L氯化钠溶液，所述酶解液采用0.22μm的滤膜过滤除菌。
进一步地，步骤S2中所述每0.1g菌丝体中加入0.8～1.5mL的酶解液。
进一步地，步骤S3中所述离心的条件为：4℃、300～700g离心10～15min。
进一步地，步骤S3中所述过滤采用擦镜纸或无尘纸进行过滤酶解液。
进一步地，S4中所述原生质体稀释后进行接种培养，所述稀释采用STC溶液和无菌水稀释，稀释液中原生质体的浓度为0.2×104～1×104个/mL。
进一步地，步骤S4中所述再生培养基为YCS双层培养基，YCS上层培养基为：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉10g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；YCS下层培养基为：蔗糖342g，酵母提取物1g，酶水解酪蛋白1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉12g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
本发明具有以下优点：
(1)本发明公开的制备芒果蒂腐病菌原生质体的方法，酶解菌丝细胞，所获原生质体的制备数高(每0.1g菌丝酶解最高可获得6.0×107个原生质体)，所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形。本发明所选丝状真菌的菌丝体来自于PDS培养24h后，且经过人工切碎处理，为获得高产量的原生质体提供了基础。
(2)本发明公开的酶解液成本低，无需使用现有技术的崩溃酶，具有高经济效益的特点，适用于工业化大规模生产。
(3)本发明公开的YCS双层再生培养基，提高了可可毛色二孢原生质体的再生率，最高为43.2％，明显高于现有的芒果蒂腐病菌原生质体的再生方法，为后续原生质体转化技术研究芒果蒂腐病菌致病分子机制提供了良好的基础。
(4)本发明公开的芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法制备过程简单、高效，便于操作，产孢量大，缩短了产孢时间，能够较快获得幼嫩菌丝，并显著提高了可可毛色二孢原生质体制备数及再生率，原生质体制备数达到(2.0～6.0)×107个/mL，再生率最高达到43.2％。
附图说明
图1为采用本发明方法制备的原生质体显微镜观察示意图。
图2为不同浓度溶剂制备的酶解液产生的原生质体图。
图3为本发明方法再生的芒果蒂腐病菌原生质体图。
图4为不同渗透压稳定剂对原生质体再生数量的影响。
图5为不同的酶解液对原生质体再生数量的影响。
图6为不同的酶解时间对原生质体再生数量的影响。
图7为不同的过滤材料对原生质体再生数量的影响。
图8为不同的培养基对原生质体再生数量的影响。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法，包括以下步骤：
S1.收集菌丝体：将可可毛色二孢活化后接种于MMS培养基上，16h光照8h黑暗条件下培养8d后获得分生孢子，将获得的分生孢子转入PDS液体培养基中培养20h，收集菌丝体；其中，所述PDS液体培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酸水解蛋白3g，酶水解蛋白3g，加ddH2O定容至1L，121℃灭菌20min；所述MMS培养基为：冻干芒果粉10g，甘露醇10g，酵母提取物6g，琼脂15g，酸水解酪蛋白1g，酶水解酪蛋白1g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；
S2.酶解：将步骤S1获得的菌丝体中加入酶解液，所述每0.1g菌丝体中加入0.8mL的酶解液，在26℃的温度下酶解3h；其中，所述酶解液为：10g/L溶壁酶+10g/L蜗牛酶+0.5mol/L氯化钠溶液；所述酶解液采用0.22μm的滤膜过滤除菌；
S3.收集原生质体：采用擦镜纸或无尘纸进行过滤酶解液，离心后沉淀中加入预冷的STC溶液重悬，所述离心的条件为：4℃、300g离心10min，得可可毛色二孢原生质体；
S4.再生原生质体：将步骤S3制备的原生质体稀释后进行接种培养，所述稀释采用STC溶液和无菌水稀释，稀释液中原生质体的浓度为0.2×104～1×104个/mL，稀释后接种于再生培养基中，于25℃培养2d，得再生的原生质体；其中所述再生培养基为YCS双层培养基，YCS上层培养基为：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉10g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；YCS下层培养基为：蔗糖342g，酵母提取物1g，酶水解酪蛋白1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉12g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
实施例2：一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法，包括以下步骤：
S1.收集菌丝体：将可可毛色二孢活化后接种于MMS培养基上，16h光照8h黑暗条件下培养8d后获得分生孢子，将获得的分生孢子转入PDS液体培养基中培养27h，收集菌丝体；其中，所述PDS液体培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酸水解蛋白3g，酶水解蛋白3g，加ddH2O定容至1L，121℃灭菌20min；所述MMS培养基为：冻干芒果粉10g，甘露醇10g，酵母提取物6g，琼脂15g，酸水解酪蛋白1g，酶水解酪蛋白1g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；
S2.酶解：将步骤S1获得的菌丝体中加入酶解液，所述每0.1g菌丝体中加入1.5mL的酶解液，在30℃的温度下酶解4h；其中，所述酶解液为：20g/L溶壁酶+20g/L蜗牛酶+1.0mol/L氯化钠溶液；所述酶解液采用0.22μm的滤膜过滤除菌；
S3.收集原生质体：采用擦镜纸或无尘纸进行过滤酶解液，离心后沉淀中加入预冷的STC溶液重悬，所述离心的条件为：4℃、700g离心15min，得可可毛色二孢原生质体；
S4.再生原生质体：将步骤S3制备的原生质体稀释后进行接种培养，所述稀释采用STC溶液和无菌水稀释，稀释液中原生质体的浓度为0.2×104～1×104个/mL，稀释后接种于再生培养基中，于30℃培养3d，得再生的原生质体；其中所述再生培养基为YCS双层培养基，YCS上层培养基为：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉10g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；YCS下层培养基为：蔗糖342g，酵母提取物1g，酶水解酪蛋白1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉12g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
实施例3：一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法，包括以下步骤：
S1.收集菌丝体：将可可毛色二孢活化后接种于MMS培养基上，16h光照8h黑暗条件下培养8d后获得分生孢子，将获得的分生孢子转入PDS液体培养基中培养25h，收集菌丝体；其中，所述PDS液体培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酸水解蛋白3g，酶水解蛋白3g，加ddH2O定容至1L，121℃灭菌20min；所述MMS培养基为：冻干芒果粉10g，甘露醇10g，酵母提取物6g，琼脂15g，酸水解酪蛋白1g，酶水解酪蛋白1g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；
S2.酶解：将步骤S1获得的菌丝体中加入酶解液，所述每0.1g菌丝体中加入1.2mL的酶解液，在28℃的温度下酶解3.5h；其中，所述酶解液为：15g/L溶壁酶+15g/L蜗牛酶+0.8mol/L氯化钠溶液；所述酶解液采用0.22μm的滤膜过滤除菌；
S3.收集原生质体：采用擦镜纸或无尘纸进行过滤酶解液，离心后沉淀中加入预冷的STC溶液重悬，所述离心的条件为：4℃、500g离心13min，得可可毛色二孢原生质体；
S4.再生原生质体：将步骤S3制备的原生质体稀释后进行接种培养，所述稀释采用STC溶液和无菌水稀释，稀释液中原生质体的浓度为0.2×104～1×104个/mL，稀释后接种于再生培养基中，于28℃培养2.5d，得再生的原生质体；其中所述再生培养基为YCS双层培养基，YCS上层培养基为：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉10g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；YCS下层培养基为：蔗糖342g，酵母提取物1g，酶水解酪蛋白1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉12g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
实施例4：
1.分生孢子的收集
将可可毛色二孢接种于PDA培养基中，于28℃培养36h。打取5mm菌饼于MMS培养基上，16h光照8h黑暗条件下，培养8d后获得分生孢子。
所述PDA培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉9g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；
所述MMS培养基为：冻干芒果粉10g，甘露醇10g，酵母提取物6g，琼脂15g，酸水解酪蛋白1g，酶水解酪蛋白1g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
2.菌丝体的收集
将获得孢子器碾碎，经双层擦镜纸过滤，获得分生孢子转入PDS液体培养基中摇培以145rpm转速培养24h，24h后菌丝体过铺有三层擦镜纸的漏斗收集菌丝，先用双蒸水冲洗，后使用0.7mol/L NaCl冲洗。
PDS液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酸水解蛋白3g，酶水解蛋白3g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
3.菌丝体细胞壁的酶解：
取0.2g新鲜菌丝体，加入2m L酶解液。于28℃下120～150rpm的摇床中酶解3～4h，得到原生质体酶解液，并于显微镜下观察原生质体产生情况，产生的原生质体如图1所示、不同浓度溶剂制备的酶解液产生的原生质体数量如图2所示，原生质体制备数最高可达6.0×107个/mL，且所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形，利于原生质体的再生。
所述的酶解液配制：溶壁酶15g/L、蜗牛酶15g/L、溶剂为0.4mol/L NaCl溶液、0.5mol/LNaCl溶液、0.6mol/L NaCl溶液、0.7mol/L NaCl溶液，配制好后用直径为0.22μm滤膜过滤除菌。
4.可可毛色二孢原生质体的收集
用4层擦镜纸过滤原生质体酶解液，于4℃、400×g离心10min，弃上清。加入1mL预冷的STC溶液(1.2mol/L山梨醇，10mmol/LTris HCl(pH 7.5)，10mmol/LCaCl2)重悬沉淀；离心，弃上清。再加入10～20m L预冷的STC将沉淀重悬，得到可可毛色二孢原生质体悬液，显微镜下观察以计算原生质体浓度，约为6×107个/mL。
5.可可毛色二孢原生质体的再生
将100μL可可毛色二孢原生质体悬液(浓度约2×107个/m L)分别用STC溶液和无菌水稀释至2×104个/m L；再加入5mL YCS液体制成混合液120rpm避光培养12h，混合液与15mL YCS下层再生培养基混匀后倒平板，于28℃培养，24h后，加入15ml YCS上层再生培养基，培养2～3d直至长出直径约1mm再生菌落；如图3所示，调查再生情况，计算再生率。
再生率(％)＝(STC溶液稀释处理上长出的菌落数目－无菌水稀释处理长出的菌落数目)×100/总原生质体数。
所述的YCS下层再生培养基为：蔗糖342g，酵母提取物1g，酶水解酪蛋白1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉12g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；所述的YCS上层再生培养基为：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉10g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
通过实验计算再生率高达28.6％。
实施例5：
将实施例4中步骤3中的所述酶解液配置中的0.7mol/L NaCl溶液分别替换为0.7mol/LKCl，0.7mol/L甘露醇，0.7mol/L山梨醇，对原生质体的产生情况进行观察。其余步骤均相同。
在显微镜下观察制备出的原生质体，如图4所示，结果发现，以0.7mol/L NaCl，0.7mol/LKCl，0.7mol/L甘露醇和0.7mol/L山梨醇作为渗透压稳定剂其原生质体的制备数量最高分别可达6.0×107个/mL，2.1×107个/mL，4.0×107个/mL，3.8×10 7个/mL。
实施例6：
将实施例4中步骤3中的所述酶解液配置中的酶解液(15g/L溶壁酶+15g/L蜗牛酶)替换为酶解液1(20g/L溶壁酶)、酶解液2(10g/L溶壁酶+15g/L蜗牛酶)、酶解液3(30g/L溶壁酶+15g/L蜗牛酶)、酶解液4(15g/L蜗牛酶)、酶解液5(20g/L蜗牛酶)，对原生质体的产生情况进行观察。其余步骤均相同。
结果如图5所示，从图中可知：分别将可可毛色二孢菌丝体用不同酶解液酶解后，对原生质体形态和产量进行分析。结果发现酶解液、酶解液1、酶解液3的效果好，原生质体制备数可稳定在3×107个/mL以上；且所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形，利于原生质体的再生。虽然崩溃酶+蜗牛酶同样具有相对较高的获得率，但从经济角度出发，本发明的所优选的酶解液成本最为经济。
实施例7：
将实施例4中步骤3中的酶解时间分别替换为1h、2h、3h、4h和5h，对原生质体的产生情况进行观察。其余步骤均相同。
结果如图6所示，从图中可知：结果分析：分别将可可毛色二孢新鲜菌丝体酶解不同时间后，对获得的原生质体在显微镜下观察，结果表明菌丝体在酶解2h后，原生质体产量快速上升；在酶解3.5h时即可获得稳定的原生质体产量，制备数最高可达6.0×107个/mL。
实施例8：
将实施例4中步骤4中用擦镜纸过滤原生质体酶解液分别替换为神奇滤布(miracloth)过滤、无尘纸(Kimtech)过滤、无菌纱布过滤，对原生质体的产生情况进行观察。其余步骤均相同。
结果如图7所示，从图中可知：结果分析：分别将可可毛色二孢原生质体用擦镜纸、神奇滤布(miracloth)、无尘纸(Kimtech)、无菌纱布进行过滤，经离心沉淀，对获得的原生质体在显微镜下观察，结果发现经擦镜纸、神奇滤布(miracloth)、无尘纸(Kimtech)过滤后获得的可可毛色二孢原生质体没有明显差异。采用无菌纱布过滤后的获得的可可毛色二孢原生质体液含有相对较多的杂质。采用神奇滤布(miracloth)过滤在原生质体制备中是广泛应用的方法，但由于其价格昂贵，且到货时效性较差。擦镜纸、无尘纸(Kimtech)是较为容易获得的材料，且经济，因此本发明优选为擦镜纸或无尘纸进行过滤可可毛色二孢原生质体。
实施例9：
将实施例4中步骤5中的YCS双层再生培养基分别替换为YCS上层再生培养基、YCS下层再生培养基、YPD再生培养基和YPS再生培养基，对原生质体的产生情况进行观察。其余步骤均相同。
YCS下层再生培养基为：蔗糖342g，酵母提取物1g，酶水解酪蛋白1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉12g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；
YCS上层再生培养基为：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉10g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
YPD再生培养基：酵母提取物3.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂粉10g，用去离子水定容至1L。
YPS再生培养基：酵母提取物3.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂粉10g，蔗糖342g，用去离子水定容至1L。
结果如图8所示，从图中可知：结果分析：采用不同再生培养基对可可毛色二孢原生质体进行再生，对其再生率进行统计。结果表明，原生质体在YCS双层再生培养基的再生率最高，可以达到43.2％；YCS下层再生培养基21.6％与YCS上层培养基18.9％次之；YPD再生培养基12.3％和YPS再生培养基11.5％的再生率则比较低。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种芒果蒂腐病菌原生质体的制备与再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 收集菌丝体：将可可毛色二孢培养后获得分生孢子，将可可毛色二孢活化后接种于MMS培养基上，16h光照8h黑暗条件下培养8d后获得分生孢子；将获得的分生孢子转入PDS液体培养基中培养24h，收集菌丝体；所述MMS培养基为：冻干芒果粉10g，甘露醇10g，酵母提取物6g，琼脂15g，酸水解酪蛋白1g，酶水解酪蛋白1g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；所述PDS液体培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，酸水解蛋白3g，酶水解蛋白3g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；
S2. 酶解：取步骤S1获得的0.2g菌丝体中加入2mL酶解液，在28℃的温度下酶解4h；其中，所述酶解液为：15g/L溶壁酶+15g/L蜗牛酶+0.7mol/L氯化钠溶液，所述酶解液采用0.22μm的滤膜过滤除菌；
S3. 收集原生质体：用4层擦镜纸过滤原生质体酶解液，于4℃、400×g离心10min，弃上清；加入1mL预冷的STC溶液重悬沉淀；离心，弃上清；再加入10～20m L预冷的STC将沉淀重悬，得到可可毛色二孢原生质体悬液；
S4. 再生原生质体：将100μL步骤S3制备的可可毛色二孢原生质体悬液分别用STC溶液和无菌水稀释至2×104个/m L；再加入5mL YCS液体制成混合液120rpm避光培养12h，混合液与15m L YCS下层再生培养基混匀后倒平板，于28℃培养，24h后，加入15ml YCS上层再生培养基，培养2～3d直至长出直径约1mm再生菌落，得再生的原生质体；所述再生培养基为YCS双层培养基，YCS上层培养基为：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉10g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min；YCS下层培养基为：蔗糖342g，酵母提取物1g，酶水解酪蛋白1g，酸水解酪蛋白1g，琼脂粉12g，加dd H2O定容至1L，121℃灭菌20min。
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