CN104087548A - 一种荷叶离褶伞原生质体制备及再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法。该制备方法如下：将菌龄72-96h的荷叶离褶伞菌丝用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂处理后、用含有质量浓度1%溶壁酶与0.5%蜗牛酶的混合酶液于30℃酶解2.5-3h，然后自制针管过滤器分离，得到荷叶离褶伞原生质体，原生质体得率为4.79×10⁷个/mL即5.76×10⁵个/mg，原生质体再生率为7.81%。本发明溶壁酶和蜗牛酶的混和酶，较单一溶壁酶作用，提高了原生质体制备及再生率，而且降低了成本；本发明采用小针管小面积过滤的方法，较常规方法降低了成本，为利用原生质体技术进行荷叶离褶伞育种奠定基础。

Description

一种荷叶离褶伞原生质体制备及再生方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及荷叶离褶伞原生质体的制备及再生方法。

背景技术

荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科、离褶伞属食用真菌，其菌丝及子实体蛋白质含量高，氨基酸种类齐全，还含有多种维生素，属野生优良食用菌。食用菌的原生质体全能性较易体现，所以原生质体诱变、融合育种技术是目前食用菌高产菌株及新菌株选育手段中最为高效经济的方法之一。而原生质体的成功制备是原生质体诱变、融合育种技术的必要条件。目前国内尚未进行对荷叶离褶伞原生质体制备工艺及方法的研究，因此，采用一种高效经济的方法制备荷叶离褶伞的原生质体具有重要意义。

发明内容

为解决以上技术中的不足，本发明的目的在于提供一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法，其特征是：

（1）    供试菌种

荷叶离褶伞菌种由河西学院食用菌研究所提供，菌种保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌种保藏号CGMCC No1518，菌株号ZY48-1，专利号ZL200510096405.0 ；

（2）溶壁酶和蜗牛酶混合酶液配置

用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使溶壁酶质量浓度为1.6-2.4%、蜗牛酶质量浓度为0.8-1.2%，将1.6-2.4%溶壁酶和0.8-1.2%蜗牛酶按质量份数1：1混合，使混和酶中溶壁酶浓度为0.8%-1.2%，蜗牛酶浓度为0.4%-0.6%，置于8000-10000r/min离心10-15min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用；

（3）荷叶离褶伞液体菌种培养

将荷叶离褶伞菌种接种于PDA固体平板培养基上，置于25℃恒温培养箱内，连续培养5天使菌种活化，得到供试菌落，用直径0.5cm的无菌打孔器取活化后的菌落三块，接种于80mL-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL）中， 在22-25℃、120-150r/min及黑暗条件下连续培养72h-96h，得到活化液体菌种，取上述4mL -5mL活化的菌液加入到盛有80-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL）中，22-25℃、120-150r/min及黑暗条件下培养72h-96h。

（4）荷叶离褶伞原生质体的制备

取2层擦镜纸衬于直径10cm漏斗，置于121℃高压灭菌30min，将（3）步骤所得荷叶离褶伞液体菌种倒入上灭菌漏斗过滤，用无菌水冲洗5遍，用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗涤2遍收集菌丝体，取30mg～80mg菌丝， 加入（2）步骤所得0.12mL～0.32mL的溶壁酶和蜗牛酶混合酶液，置于30℃黑暗酶解2.5-3h，每30min-40min震荡一次，得到原生质体酶解液；准备1mL规格的玻璃针管，在针管中预置脱脂棉，用针管的推进器压紧，最终脱脂棉高度0.5-0.8cm，置于121℃高压灭菌30min，得自制针管过滤器，用1mL移液枪将得到的原生质体酶解液转入自制针管过滤器，用推进器轻轻助推完全，再将0.8-1mL0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂加入自制针管过滤器，用推进器助推完全；将滤液置于3500r-4000r /min离心10-15min，弃上清液，收集沉淀，即得荷叶离褶伞原生质体，用0.5mL0.6mol/L的蔗糖渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2-3次，再用0.24mL～0.64mL的0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂重悬原生质体，得到荷叶离褶伞原生质体精制悬液；

（5）原生质体再生

在无菌条件下，采用无菌操作，用浓度梯度稀释法将（4）步骤所得荷叶离褶伞原生质体稀释至10⁴个/mL，取该悬液80-100μL，涂布原生质体再生培养基上，原生质体再生培养基为：马铃薯200g，麸皮30g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨3g，蔗糖20g，0.6moL/L蔗糖渗稳剂，琼脂20g，水1000mL，pH值自然； 25℃恒温黑暗培养10-15天统计原生质体再生率。

本发明的优点和产生的积极效果：

采用质量浓度为1%溶壁酶和0.5%蜗牛酶的混和酶有助于发挥酶的互补作用，降低了用量(250mg/mL)，较单一溶壁酶作用，提高了原生质体制备及再生率，而且降低了成本，为利用原生质体技术进行荷叶离褶伞育种奠定基础。

常规原生质体过滤方法常采用多层镜头纸过滤，因为接触面积较大，使大量原生质体粘在过滤擦镜纸上，使原生质体损耗较大，与常规原生质体过滤方法相比，本发明的针管过滤器，面积小（直径=0.5cm），可以通过针管推进器的推压使原生质体在很小的面积过滤下来，大大减少原生质体损耗，从而提高了制备率，这样我们只需酶解较少的菌丝（30mg）就能获得大量原生质体，酶消耗少（1.8mg），大大降低了科研中荷叶离褶伞原生质体的制备费用。原生质体释放量达到4.79×10⁷个/mL即5.76×10⁵个/mg，原生质体再生率为7.81%，处于较高水平。

附图说明

图1 为原生质体针管过滤器照片。

图2为菌龄对原生质体制备及再生的影响。

图3为酶解时间对原生质体制备及再生的影响。

图4 为渗稳剂对原生质体制备及再生的影响。

图5 为荷叶离褶伞原生质体（400×）图 。  

图6 为荷叶离褶伞原生质体（1000×）图。

具体实施方式

本发明的菌种

荷叶离褶伞菌种( 保藏号CGMCC1518，菌株号ZY48-1，专利号ZL200510096405.0)由河西学院食用菌研究所提供。

本发明的试剂

溶壁酶（广东省微生物研究所）；蜗牛酶（北京百泰生化技术公司）；纤维素酶(美国bettery公司)；其他试剂均为国产分析纯。

酶液的配置

用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使溶壁酶质量浓度为2%、蜗牛酶质量浓度为1%，将2%溶壁酶和1%蜗牛酶按体积比1：1混合，使混和酶中溶壁酶浓度为1%，蜗牛酶浓度为0.5%，置于10000r/min离心10min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用；

用1mL 0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶蜗牛酶，使蜗牛酶终浓度为1%、置于10000r/min离心10min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用。

用1mL 0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶，使溶壁酶质量浓度为1%、置于10000r/min离心10min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用；

用1mL 0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使混合酶中溶壁酶终浓度为1%、蜗牛酶终浓度为1%，置于10000r/min离心10min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用。

用1mL 0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使混和酶中溶壁酶终浓度为2%、蜗牛酶终浓度为1%，置于10000r/min离心10min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用。

荷叶离褶伞菌丝原生质体制备方法

将荷叶离褶伞菌种接种于PDA固体平板培养基上，置于25℃恒温培养箱内，连续黑暗培养5天使菌种活化，得到供试菌落，用直径0.5cm的无菌打孔器取活化后的菌落3块，将3块菌落均接种于80mL马铃薯葡萄糖液体培养基于250mL三角瓶中， 置于25℃、120r/min及黑暗条件下连续培养72h，得到活化液体菌种；取上述所得活化菌液4mL加入到80mL马铃薯葡萄糖液体培养基于250mL三角瓶，置于25℃、120 r/min及黑暗条件下，连续培养48h-168h得到荷叶离褶伞液体菌种，无菌条件下，用灭菌2层擦镜纸过滤得到的荷叶离褶伞液体菌种，用无菌水冲洗5遍，用渗透压稳定剂洗涤2遍收集菌丝体。

在无菌条件下，取30mg菌丝， 加入上述所得0.12mL的酶液，置于30℃及黑暗条件下酶解0.5-3h，每30min震荡一次，得到原生质体酶解液；用1mL移液枪将得到的原生质体酶解液转入自制针管过滤器，用推进器轻轻助推完全，再将1mL渗透压稳定剂加入自制针管过滤器，用推进器助推完全；将滤液置于3500r/min离心10min，弃上清液，收集沉淀，即得荷叶离褶伞原生质体。用0.5mL0.6mol/L渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2次，再用2倍酶解液体积的渗透压稳定剂重悬原生质体，得到荷叶离褶伞原生质体精制悬液。（整个过程在无菌条件下进行。）原生质体适当稀释后用血球计数板计数。原生质体得率(n/mg)=原生质体个数(n) / 菌丝质量(mg)

上述步骤中自制针管过滤器见图1，做法为：准备1mL规格的玻璃针管，先在针管中放入0.5cm厚脱脂棉，用针管的推进器压紧，灭菌备用。

荷叶离褶伞菌丝原生质体再生方法

在无菌条件下，采用无菌操作，用浓度梯度稀释法将荷叶离褶伞原生质体稀释至10⁴个/mL，取该悬液100μL，涂布原生质体再生培养基上。原生质体再生培养基：马铃薯200g，麸皮30g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨3g，蔗糖20g，0.6moL/L的渗透压稳定剂，琼脂20g，水1000mL，pH值自然。25℃恒温恒湿黑暗培养10天统计原生质体再生率。

原生质体再生率（%）= 原生质体再生个数(n)/涂板原生质体个数(n)×100%

荷叶离褶伞菌丝原生质体制备及再生条件优化

原生质体制备及再生中渗透压稳定剂的筛选

0.6 mol/L的 MgSO₄、NaCl、蔗糖和甘露醇做为渗透压稳渗剂，用60h菌龄的荷叶离褶伞菌丝体，用1%溶壁酶+0.5%蜗牛酶的混合酶液，置于30℃黑暗条件下酶解2h，制备原生质体并再生，统计原生质体制备率、再生率。

实验结果表明（图2），添加硫酸镁的培养基不凝固，以蔗糖作为渗稳剂时，原生质的制备率最高，NaCl作渗透压稳定剂原生质制备率最低。在其它条件等同的情况下，0.6mol/L的蔗糖和甘露醇做渗透压稳定剂的再生率都较高，NaCl做渗透压稳定剂的再生率最低，比较各渗透压稳定剂的制备率和再生率乘积发现选用0.6mol/L的蔗糖时，二者乘积最大。故荷叶离褶伞原生质体制备与再生的最适渗透压稳定剂为0.6mol/L蔗糖。

原生质体制备及再生中酶解时间的筛选

酶解时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，用60h菌龄的菌丝体，用0.6mol/L蔗糖为渗透压稳定剂，用1%溶壁酶+0.5%蜗牛酶混合酶液，置于30℃黑暗酶解，制备原生质体并再生，统计原生质体制备率、再生率。

实验结果表明（图3），原生质体制备率在一定的酶解时间范围内，随时间延长产量显著提高，当达到2.5h时，酶解产量较高，之后增加不明显，3.0h时达到最大，之后随着时间延长，原生质体制备率呈下降趋势。原生质体再生率2.5h时达最大，之后随着时间延长，原生质体再生率呈下降趋势。比较不同酶解时间的原生质体制备率和再生率的乘积，也发现酶解时间为2.5h时，二者乘积最大。故荷叶离褶伞原生质体制备与再生的最适酶解时间为2.5h。

原生质体制备及再生中荷叶离褶伞菌丝菌龄的筛选

菌龄选用48h、72h、96h、120h、144h、168h的菌丝体，0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂，1%溶壁酶+0.5%蜗牛酶混合酶液，在温度30℃条件下黑暗酶解2.5h，制备原生质体并再生，统计原生质体制备率、再生率。

由图4可见，96h菌龄的原生质体制备率最高，其次是72h>120h >48h>144h>168h，原生质体再生率在72h菌龄最高，其次是48h >96h >120h>144h >168h。以二者的乘积作为参考指标，比较各菌龄的原生质体制备率和再生率乘积发现菌龄为72h时，二者乘积最大。因而，选择72h为荷叶离褶伞原生质体制备及再生的最佳菌龄。

原生质体制备中酶及酶浓度的筛选

酶液分别采用1%蜗牛酶、1%溶壁酶、1%溶壁酶+0.5%蜗牛酶、1%溶壁酶+1%蜗牛酶和2%溶壁酶+1%蜗牛酶混合酶液，0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂，用菌龄72h的菌丝体，在温度30℃及黑暗条件下酶解2.5h，制备原生质体，统计原生质体制备率。

实验结果表明（表1），用6种酶系统分别处理菌丝体，其原生质体制备率不同，依大小排序依次为：1%溶壁酶+0.5%蜗牛酶＞1%溶壁酶+1%蜗牛酶＞1%溶壁酶＞1%蜗牛酶＞2%溶壁酶+1%蜗牛酶；说明组合酶效果比单一酶好；1%溶壁酶+0.5%蜗牛酶原生质体制备率最高。

综上所述，荷叶离褶伞原生质体制备再生的最佳条件为：0.6mol/L蔗糖稳渗剂、2%溶壁酶与1%蜗牛酶1：1等体积混合酶液、菌龄72h、30℃酶解2.5h，原生质体得率为4.79×10⁷个/mL 即5.76×10⁵个/mg，原生质体再生率为7.81%。图5为制备的荷叶离褶伞原生质体（400×）照片、图6为制备的荷叶离褶伞原生质体（1000×）照片。

Claims (1)

1.一种荷叶离褶伞原生质体的制备及再生的方法，其特征是：

（1）供试菌种

荷叶离褶伞菌种由河西学院食用菌研究所提供，菌种保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌种保藏号CGMCC No1518，菌株号ZY48-1，专利号ZL200510096405.0 ；

（2）溶壁酶和蜗牛酶混合酶液配置

用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂溶解溶壁酶和蜗牛酶，使溶壁酶质量浓度为1.6-2.4%、蜗牛酶质量浓度为0.8-1.2%，将1.6-2.4%溶壁酶和0.8-1.2%蜗牛酶按质量份数1：1混合，使混和酶中溶壁酶浓度为0.8%-1.2%，蜗牛酶浓度为0.4%-0.6%，置于8000-10000r/min离心10-15min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，备用；

（3）荷叶离褶伞液体菌种培养

将荷叶离褶伞菌种接种于PDA固体平板培养基上，置于25℃恒温培养箱内，连续培养5天使菌种活化，得到供试菌落，用直径0.5cm的无菌打孔器取活化后的菌落三块，接种于80mL-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL）中， 在22-25℃、120-150r/min及黑暗条件下连续培养72h-96h，得到活化液体菌种，取上述4mL -5mL活化的菌液加入到盛有80-100mL马铃薯葡萄糖液体培养基三角瓶（250mL）中，22-25℃、120-150r/min及黑暗条件下培养72h-96h；

（4）荷叶离褶伞原生质体的制备

取2层擦镜纸衬于直径10cm漏斗，置于121℃高压灭菌30min，将（3）步骤所得荷叶离褶伞液体菌种倒入上灭菌漏斗过滤，用无菌水冲洗5遍，用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗涤2遍收集菌丝体，取30mg～80mg菌丝， 加入（2）步骤所得0.12mL～0.32mL的溶壁酶和蜗牛酶混合酶液，置于30℃黑暗酶解2.5-3h，每30min-40min震荡一次，得到原生质体酶解液；准备1mL规格的玻璃针管，在针管中预置脱脂棉，用针管的推进器压紧，最终脱脂棉高度0.5-0.8cm，置于121℃高压灭菌30min，得自制针管过滤器，用1mL移液枪将得到的原生质体酶解液转入自制针管过滤器，用推进器轻轻助推完全，再将0.8-1mL0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂加入自制针管过滤器，用推进器助推完全；将滤液置于3500r-4000r /min离心10-15min，弃上清液，收集沉淀，即得荷叶离褶伞原生质体，用0.5mL0.6mol/L的蔗糖渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2-3次，再用0.24mL～0.64mL的0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂重悬原生质体，得到荷叶离褶伞原生质体精制悬液；

（5）原生质体再生

在无菌条件下，采用无菌操作，用浓度梯度稀释法将（4）步骤所得荷叶离褶伞原生质体稀释至10⁴个/mL，取该悬液80-100μL，涂布原生质体再生培养基上，原生质体再生培养基为：马铃薯200g，麸皮30g，磷酸二氢钾1g，蛋白胨3g，蔗糖20g，0.6moL/L蔗糖渗稳剂，琼脂20g，水1000mL，pH值自然； 25℃恒温黑暗培养10-15天统计原生质体再生率。