CN109628332A - 木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法 - Google Patents

木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，包括如下步骤：将树舌灵芝菌株活化后，取优质菌株接种于液体菌株活化培养基中进行扩大培养，选取9d的菌丝体制备其原生质体；将菌丝体依次经过滤、无菌水冲洗、渗透压稳定剂冲洗后，加入巯基乙醇30mL，进行震荡处理，待菌丝断裂后，过滤，再用0.7 mol/L MgSO4溶液冲洗，离心，弃上清液取沉淀，吸干水分后，按菌丝体重量：溶壁酶酶液=1：10的比例将菌丝体沉淀和浓度为1.0%的溶壁酶酶液置于离心管中，摇匀后，酶解3.0h，过滤，获得的滤液离心后得到的沉淀即为树舌灵芝菌丝体的原生质体。本发明的原生质体制备率高达9.15×106个/mL。

Description

木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法
技术领域
本发明涉及原生质体的制备方法，具体涉及一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法。
背景技术
能源问题一直是全球问题，随着大量不可再生的能源被人类开采使用，能源危机已经威胁到人类的生活和社会的稳定。发掘、研究可再生能源已经成为可持续发展战略重要的待解决问题。
木质纤维素是目前地球上分布最广泛、蕴藏最丰富的可再生资源，其干重比例占世界植物干重的30%～50%。目前，很多含有大量纤维素的物质被遗弃，如植物进行光合作用时产生的纤维素物质，人类因为社会活动留下的废弃物等等。在我国常见的便是农业中的稻草、秸秆等，城市中的垃圾、废纸等，这些都是丰富的可再生资源，因为其主要成分天然纤维质原料的结晶性和木质化限制了其可利用性。目前对于木质纤维素的降解方法有三种：（1）物理方法需要很多操作复杂且精细的仪器，费时费力；（2）化学方法成本较高，需要强酸、强碱、高压等条件，（3）而微生物降解具有耗能低、操作简单、污染较小和成本低等特点。对于微生物降解来说，能够降解木质纤维素的微生物有很多并且存在于自然界每一个角落，如细菌、真菌、放线菌及某些病毒。它们可以分解自然界生物质固废能源使其可以得到人们的利用，而这其中便包含纤维素，它们可以使这些生物聚合物可以得到资源化利用。而在降解木质纤维素时从效率和速率来看，真菌的效果一般远大于细菌。近年来对于丝状真菌降解木质纤维素取得了进展，如刘起丽，郭宏伟等研究得出复合菌系比单一菌系降解效果更加充分的结论。而到目前为止筛选出的降解菌株活性较低，均不能用于大规模生产，因此对丝状真菌进行诱变育种成为木质纤维素降解菌研究的主要方向。诱变育种可以提高菌种突变率在短时间获得优良的菌株，做到提高单一或几个生产性状。目前大型真菌的诱变育种多选择原生质体为试验材料，是否能够获得大量有活性的原生质体成为诱变育种中最关键的环节。因此大型真菌的原生质体的制备研究具有重大的实践价值。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，包括如下步骤：
S1、菌株活化培养
在超净工作台中，先将储存在试管中的树舌灵芝菌株的菌丝体用接种耙取出，再将其接种到装有改良PDA培养基的平皿上，30℃培养4d～6d，直至菌丝长满平皿后备用；
S2、优质菌株扩大培养
在无菌条件下，选择打孔器将前期培养好的平板，沿菌丝活力好且分布均匀地方打一个直径为5mm的圆块，用镊子接种于装有50 mL的液体菌株活化培养基中，并在其中加入碾碎的玻璃碎片，使菌丝体被打碎，在30℃、摇床转速为155 r/min条件下培养，选取9d的菌丝体制备其原生质体；
S3、原生质体的制备
在无菌条件下，用四层纱布过滤获得菌丝体，先用无菌水冲洗1次，然后用0.7mol/L渗透压稳定剂MgSO4冲洗，再向50mL离心管中加入巯基乙醇30mL，然后将菌丝转入进行震荡处理，待菌丝断裂后用四层滤镜纸过滤，再用0.7mol/L MgSO4冲洗，6500r/min，离心15 min，弃上清液取沉淀，用无菌滤纸尽量吸干水分后，用精密电子天平准确称量菌丝体沉淀的重量，然后按菌丝体重量：复合酶液=1：10的比例量取适量的浓度为1%的复合酶液，在容量为50mL的离心管中摇匀之后，32℃酶解3h，使之充分降解，再用四层擦镜纸过滤，获得的滤液转入到5mL离心管中，6500r/min，离心15 min后得到的沉淀即为树舌灵芝菌丝体的原生质体。
进一步地，所述步骤S1中，改良PDA培养基为在液体菌株活化培养基的配方基础上加入琼脂20g加水定容至1000mL后所得。
进一步地，所述步骤S2中，液体菌株活化培养基通过以下步骤制备所得：取适量大小马铃薯削皮后，准确称量200.0 g，切成小块，煮沸20min后依次加入硫酸镁0.6g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.5g，维生素 B1 0.05 g，过滤取澄清马铃薯汁，加水定容至1000mL。
本发明以一株产漆酶树舌灵芝为试材，提供了一种木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其原生质体制备率高达9.15×106个/mL。
附图说明
图1 为本发明实施例中菌龄对原生质体制备数量的影响。
图2 为本发明实施例中酶液浓度对原生质体制备数量影响。
图3 为本发明实施例中酶解时间对原生质体数目的影响。
图4为本发明实施例中渗透压稳定剂对原生质体数目的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
材料
（1）试验菌株
树舌灵芝由生物工程学院微生物实验室分离并保存。
（2）培养基
改良PDA培养基：在液体菌株活化培养基的配方基础上加入琼脂20g加水定容至1000mL。
愈创木酚筛选培养基：用移液枪吸取0.04%愈创木酚，加入改良PDA培养基中。
液体菌株活化培养基：取适量大小马铃薯削皮后，准确称量200.0 g，切成小块，煮沸20min后依次加入硫酸镁0.6g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.5g，维生素 B1 0.05g，过滤取澄清马铃薯汁，加水定容至1000mL。
试剂
（1）酶制剂
溶壁酶从上海源叶生物科技有限公司购买。
（2）其他试剂
渗透压稳定剂的配制：用精密电子天平分别准确称量KCl、MgSO4·7H2O、蔗糖和甘露醇的质量，将其溶于无菌水中定容，依次配制成质量浓度为0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L的稳渗液。
溶壁酶酶液的配制：称取少量不同质量的溶壁酶溶解在不同浓度渗透压稳定剂中，配制成浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的酶液，然后用孔径为0.22的微孔过滤器过滤去除杂菌备用。
试验方法
菌株活化培养
在超净工作台中，先将储存在试管中的菌株的菌丝体用接种耙取出，再将其接种到装有改良PDA培养基的平皿上，30℃培养4d-6d，直至菌丝长满平皿后备用。
2.2 产酶特性分析
用打孔器沿菌丝活力好且菌丝分布均匀地方打出一个直径为5mm的菌块，用镊子将菌块分别放置到愈创木酚筛选培养基中，菌丝面朝向培养基然后进行30℃培养，24h后定期观察红色圈产生时间，同时测定红色圈直径大小，分析菌株产酶情况。
2.3 优质菌株扩大培养
在无菌条件下，选择打孔器将前期培养好的平板，沿菌丝活力好且分布均匀地方打十个直径为5mm的圆块，用镊子接种于装有50 mL的液体菌株活化培养基中，并在其中加入碾碎的玻璃碎片，使菌丝体被打碎。在30℃、摇床转速为155 r/min条件下培养，分别选取4d、5d、6d、7d、8d和9d的菌丝体制备其原生质体。
2.4 原生质体制备的一般流程
在无菌条件下，用四层纱布过滤获得菌丝体，先用无菌水冲洗1次，然后用0.6mol/L渗透压稳定剂甘露醇冲洗，再向50mL离心管中加入巯基乙醇30mL，然后将菌丝转入进行震荡处理，待菌丝断裂后用四层滤镜纸过滤，再用0.6 mol/L甘露醇渗液冲洗，6500r/min，离心15 min，弃上清液取沉淀，用无菌滤纸尽量吸干水分后用精密电子天平准确称量菌丝体沉淀的重量，按菌丝体重量：复合酶液=1：10的比例加入不同浓度的酶液。在容量为50mL的离心管中摇匀之后，设置不同酶解温度和酶解时间，使之充分降解。再用四层擦镜纸过滤，获得的滤液转入到5mL离心管中，6500r/min，离心15 min后得到的沉淀即为树舌灵芝菌丝体的原生质体。将沉淀适当稀释后，用血球计数板计数。
2.5 单因素试验
按照2.4的试验，在相同实验环境和条件下，利用单因素中的控制变量法对菌龄、酶解时间、酶解浓度、渗透压稳定剂四种单因素对制备原生质体的影响进行分别探究。 （1）不同时期的菌龄对原生质体制备的影响
根据2.4中原生质体制备的步骤进行操作，分别收集培养时间为第4d、第5d、第6d、第7d、第8d和第9d的菌丝体，分析不同菌龄对菌株原生质体制备的影响。
（2）不同酶解时间对原生质体制备的影响
根据2.4中原生质体制备的步骤进行操作，酶解时间设计4个不同处理分别为2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，分析不同降解时间对菌株原生质体制备的影响。
（3）不同溶壁酶浓度对原生质体制备的影响
根据2.4的原生质体制备步骤，分别选择5种不同浓度的降解酶。酶浓度分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％，分析了酶液浓度对原生质体制备的影响。
（4）不同渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
根据2.4的原生质体制备步骤，选择KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇四种渗透压稳定剂并将每种渗透压稳定剂配制成浓度为0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7mol/L，分析不同渗透压稳定剂对优质菌株原生质体制备的影响。
正交试验
根据单因素试验结果，从菌龄、酶解时间、酶解浓度、渗透压稳定剂四个因素中每个因素抽取三个原生质体制备的最佳水平，进行正交试验设计，确定最适合优质菌株原生质体制备的条件。
3 结果与分析
3.1 优质菌株的筛选
采用愈创木酚筛选培养基对树舌灵芝产酶特性进行分析，培养第2d时树舌灵芝与滑子菇开始产生棕红色圈，而猴头菇在第3d时产生棕红色圈，树舌灵芝形成的棕红色圈颜色明显比其他两个菌株形成的棕红色圈颜色深，且直径最大（如表1）。因此树舌灵芝为制备原生质体的出发菌株。
表1 愈创木酚筛选培养基3d时形成有色圈直径大小
菌株 直径大小
树舌灵芝 1.1cm
猴头菇 0.5cm
滑子菇 0.8cm
3.2单因素试验结果
3.2.1不同时期的菌龄对树舌灵芝原生质体制备的影响
菌龄是制备原生质体的首要条件，是原生质体制备条件研究中具有决定作用的因素。菌龄的大小决定着菌种的生理结构和生化水平，进而影响着原生质体的制备数量。分别取培养4d、5d、6d、7d、8d、9d的树舌灵芝菌丝体，以0.6 mol/L甘露醇为渗透压稳定剂，30℃酶解温度，1.0%酶浓度制备原生质体。由图1可知在4d-8d时随着菌龄的天数增长原生质体的数目会持续增长，在8d-9d时随着菌龄的天数增长原生质体的数目会减少，在第8d时原生质体制备数目最多，达到8.2×106个/mL。这种随着菌龄天数增加原生质体数目出现先增大后减少的趋势，与周继阳等对阿魏菇原生质体制备及再生条件的建立的研究结果相同。这种折线趋势的产生原因是菌龄太小会因为生长出菌丝体的数量太少使原生质体的制备数量很少；菌龄太大，会因为菌丝体老化使细胞壁的厚度加大且变得紧密使酶解不充分，也会使原生质体的制备数量减少。想要菌丝体的数量足够且不老化，需取处在对数生长期的菌丝，只有在对数生长期时原生质体的制备数量才最多，这一点在本发明中也有验证。对树舌灵芝来说7d-9d是制备原生质体的最佳菌龄。但在刘玉霞等对白灵菇原生质体制备研究中制备菌株的最佳菌龄为4d-7d，这是因为菌株不同，遗传性状不同，制备原生质体的最佳菌龄也会有所不同。
3.2.2不同酶解浓度对树舌灵芝原生质体制备的影响
食用菌种类的不同决定着其细胞壁的组成成分也不同，从而决定着采用的酶种类，通过查询文献得知溶壁酶制备树舌灵芝原生质体的效果较好。浓度的大小是制备原生质体的重要条件，选择 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%五种不同的溶壁酶浓度进行原生质体制备。从图2可知随着酶浓度不断加大时原生质体的数量也在发生变化。根据酶浓度制备的原生质体数量排序为1.5%>2.0%>1.0%>2.5%>3.0%>3.5%，但是二者并不是成正相关趋势上升，在酶浓度为1.0%-1.5%时酶浓度与原生质体数量成正相关，并且可以明显看出在酶浓度为1.5%时原生质体的产量最高，这是因为随着酶浓度增大，酶解效果会更加充分。这与孙露等对毛木耳原生质体制备与再生条件的研究中实验结果一样，毛木耳原生质体制备的最佳酶浓度为1.5%。而在1.5%-3.5%时酶浓度与原生质体数量成负相关，有三种原因可以解释：（1）这是因为在酶浓度过高时会使原生质体破碎；（2）酶浓度增大时酶液中的杂酶含量会增大，如脱氧核糖核酸酶，这种杂酶会破坏原生质体；（3）酶浓度增大会使树舌灵芝菌丝体发生凝集效应，难以被原生质体化。
3.2.3不同酶解时间对树舌灵芝原生质体制备的影响
选用酶解时间为2.0h、2.5h、3.0h、3.5h，由图3可知在2.0h-4.0h间，2.0-2.5h时原生质体数目较低且增幅较快，较低时是因为酶解时间过短，细胞未被溶壁酶充分降解，随着酶解时间增长制备出的原生质体制备数目迅速增加。酶解时间在2.5h-3.5h时，制备获得的原生质体数目分别为7.7×106个/mL、8.2×106个/mL、6.5×106个/mL，在3h时原生质体制备数目达到最大，为8.2×106个/mL。这与刘敏等在产漆酶杏鲍菇原生质体的研究中的研究结果相接近，杏鲍菇制备原生质体的最适酶解时间为3.0h。在3.0h-4.0h之间原生质体产量随着酶解时间增大而减少。分析减少的原因可能有两个，一个是融壁酶中含有其他杂酶，过长的酶解时间使杂酶与细胞充分接触，破坏原生质体的结构。另一个是因为酶解时间过长使原生质体被过分酶解进而破裂。随着酶解时间的延长，原生质体被破坏的速度会大于制备速度。
3.2.4 不同渗透压稳定剂浓度和种类对原生质体制备的影响
不同种类和浓度的渗透压稳定剂决定了细胞内外渗透压的平衡，决定细胞的稳定性，是制备原生质体的主要因素，酶解过后的细胞失去了细胞壁十分脆弱，如果没有合适的渗透压稳定剂维持细胞内外浓度平衡，原生质体会因为细胞过度失水或是吸水而迅速破裂。另一方面渗透压的种类与浓度对于酶活性的高低等也有着一定影响，因此选用合适的渗透压稳定剂种类与浓度会对原生质体的制备数目产生严重影响。本实施例我们用 KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇作为渗透压稳定剂，并分别将其配制成3个浓度为0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L。由图4可知使用不同渗透压稳定剂，原生质体的制备数目波动较为明显，属于无机盐类渗透压稳定剂的KCl、MgSO 4明显高于属于有机糖醇类渗透压稳定剂的蔗糖、甘露醇，初步可以确定较适合树舌灵芝原生质体制备的渗透压稳定剂为无机盐类。这与周继阳等对阿魏菇原生质体制备及再生条件的建立的研究结果相似，但是在崔宗强与罗信昌对羊肚菌原生质体制备与再生试验中，使用的最佳稳渗液是蔗糖，这是因为菌种的类别不同，生理结构也不同，对有机糖醇类渗透压稳定剂和无机盐类渗透压稳定剂的敏感程度不同。
3.3 正交试验结果分析
表2 正交试验因素和水平表
表3 正交试验结果
3.3.1极差分析
极差数值大小代表各个单因素对原生质体释放的影响，R的数值越高则代表此因素变量对于实验结果影响越大。如表3可知R1>R2>R3>R4可以看出对于树舌灵芝原生质体制备影响较大的是酶解时间，其次是菌龄、酶液浓度、渗透压稳定剂浓度。
3.3.2 最优组合的确定
最优水平和最优组合是根据k值大小来确定的。如表3可知，酶解时间对原生质体制备影响最大的，在酶解时间中K2> K3> K1，所以A2为最佳酶解时间，酶解时间为2.0h，最优组合在4、5、6实验号中；其次影响原生质体制备的是菌龄，在菌龄中K3> K2> K1，K3的数值为8.120×106明显高于K1 、K3，所以B3代表最佳菌龄；在酶液浓度中K1的数值为7.973×106是K1 、K2 、K3中数值最大的，所以C1代表最佳酶液浓度；D中K3为7.927×106数值最大，则D3代表最佳渗透压浓度。综合分析最优因素组合为A2 B3 C1 D3，即酶浓度1%，菌龄9d，酶解时间3h，渗透压稳定剂浓度0.7mol/L。根据正交试验得出的制备原生质体的最优组合重复2.3.2和2.3.4步骤制得树舌灵芝原生质体数目为9.15×106个。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (4)

1.木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、菌株活化培养
在超净工作台中，先将储存在试管中的树舌灵芝菌株的菌丝体用接种耙取出，再将其接种到装有改良PDA培养基的平皿上，30℃培养4d～6d，直至菌丝长满平皿后备用；
S2、优质菌株扩大培养
在无菌条件下，选择打孔器将前期培养好的平板，沿菌丝活力好且分布均匀地方打一个直径为5mm的圆块，用镊子接种于装有50 mL的液体菌株活化培养基中，并在其中加入碾碎的玻璃碎片，使菌丝体被打碎，在30℃、摇床转速为155 r/min条件下培养，选取9d的菌丝体制备其原生质体；
S3、原生质体的制备
在无菌条件下，用四层纱布过滤获得菌丝体，先用无菌水冲洗1次，然后用0.7mol/L渗透压稳定剂MgSO4冲洗，再向50mL离心管中加入巯基乙醇30mL，然后将菌丝转入进行震荡处理，待菌丝断裂后用四层滤镜纸过滤，再用0.7mol/L MgSO4冲洗，6500r/min，离心15 min，弃上清液取沉淀，用无菌滤纸吸干水分后，用精密电子天平准确称量菌丝体沉淀的重量，然后按菌丝体重量：复合酶液=1：10的比例量取适量的浓度为1%的复合酶液，在容量为50mL的离心管中摇匀之后，32℃酶解3h，使之充分降解，再用四层擦镜纸过滤，获得的滤液转入到5mL离心管中，6500r/min，离心15 min后得到的沉淀即为树舌灵芝菌丝体的原生质体。
2.如权利要求1所述的木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，改良PDA培养基为在液体菌株活化培养基的配方基础上加入琼脂20g加水定容至1000mL后所得。
3.如权利要求1所述的木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，液体菌株活化培养基通过以下步骤制备所得：取适量大小马铃薯削皮后，准确称量200.0 g，切成小块，煮沸20min后依次加入硫酸镁0.6g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾0.5g，维生素 B1 0.05 g，过滤取澄清马铃薯汁，加水定容至1000mL。
4.如权利要求1所述的木质纤维素降解菌株原生质体的制备方法，其特征在于：所述复合酶液为溶壁酶酶液。
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