CN101921738A

CN101921738A - 高活性纤维素酶的制备方法

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Publication number: CN101921738A
Application number: CN2010102381194A
Authority: CN
Inventors: 钟伟松
Original assignee: JIANGXI JINWEI BIOLOGICAL PRODUCT CO Ltd
Current assignee: JIANGXI JINWEI BIOLOGICAL PRODUCT CO Ltd
Priority date: 2010-07-24
Filing date: 2010-07-24
Publication date: 2010-12-22

Abstract

本发明公开了一种高活性纤维素酶的制备方法，采用液体发酵工艺，以木霉为生产菌种，进行液体深层发酵，发酵液过滤、浓缩、提取纤维素酶，所述木霉经亚硝酸盐诱变、紫外诱变和微波诱变进行筛选处理；培养基包括如下质量组份组成：固定碳源2-5％，氮源0.5-2％，NaCl 1-2％，MgSO₄·7H₂O 1-2％，KH₂PO₄2-4％，产酶促进剂0-0.1％，余量以水补至100％。本发明采用上述方案酶活力平均达4000μ/ml以上；经5次传代试验培养酶活力变化不大，具有较高遗传稳定性。生产工艺参数易控制，发酵周期短，产酶水平高，采用板框过滤，添加硅藻土作助滤剂，超滤膜浓缩，发酵液收率高，生产出成品酶制剂活性最高可达100000μ/ml以上。

Description

高活性纤维素酶的制备方法

技术领域：本发明涉及纤维素酶的制备方法，特别是一种高活性纤维素酶的制备方法。

背景技术：纤维素酶(CelluLase)是降解纤维素转化为葡萄糖的各种酶的总称，分为真菌纤维素酶和细菌纤维素酶。纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(BH)，β-葡萄糖苷酶(BG)组成。其广泛应用在纺织、饲料、酿造、食品加工、环保、造纸等行业，能有效改善产品质量，提高产品产量；利用纤维素酶对纤维素纤维织物进行生物整理即酶降解整理；可改善纤维素针织物外观性能，增强纤维素纤维的柔软度，使织物光泽和色泽鲜艳度得到明显改善，应用越来越广，市场需量也越来越大。

纤维素酶的生产方法一般采用固体发酵和液体发酵两种工艺方法；固体发酵工艺虽然固定投资少，但生产稳定性差，难以进行大规模工业化生产。而液体发酵工艺生产稳定性高，培养条件易控制生产效率高，便于大规模生产，但目前其生产的发酵液酶活偏低。

要生产高活性纤维素酶关键是：一是选育高产菌种，作为生产菌种。现有企业大都把木霉作为生产纤维素酶首先菌种，但现有木霉其酶活性不高，一般在1400u/ml左右；纤维素酶活力单位U定义为：在50℃，PH6.0的条件下，每1h产生1ug还原糖所需的酶量为一个纤维素酶活力单位，用1u/ml表示。

二是发酵工艺路线，培养基选定，发酵时间，温度等；发酵后发酵液的过滤，浓缩等的提取工艺等均对纤维素酶的活性存在较大影响。如中国专利号为200510009000.9的《高活性纤维素酶及其制造方法》，其以担子菌CGMCCNO.1294作为生产菌种，以棉花\棉短绒或棉纺织品下脚料经物理和化学方法处理后作为碳源，生产出的纤维素酶活力为40000u/g，但采用该方法生产工艺还较复杂，使用碳源还需进行物理与化学处理。生产用菌种不够普及，甚至难以得到，生产出的纤维素酶活力也不很高。

中国专利申请号为200810204253.5《从菌糠中制备纤维素的方法》，菌糠也是以农作物桔杆和工业废料栽培食用菌后的培养基，其是对菌糠培养基进行纯化处理再进行制备纤维素酶。

目前国内外科技工作者对生产纤维素酶的菌种也进行了大量研究，普遍是以木霉为生产用菌，而对木霉进行诱变以使其酶活提高，如青岛大学管斌等利用紫外线，亚硝基胍对里氏木霉进行诱变处理，选育得到的菌株，使酶活力得到提高；而在发酵工艺及提取工艺技术路线等均未涉及。还有如南京理工大学学报(2004、1-58)唐仕荣的“复合物理场对微生物的诱变作用”利用紫外、微波复合诱变制备突变菌种，提高了酶活力。

发明内容：本发明就是要提供一种高活性纤维素酶的制备方法，其对现有的木霉生产菌种进行诱变筛选，改进液体发酵和提取工艺，制备出高活性的纤维素酶。

本发明的技术方案采用液体发酵工艺，以木霉为生产菌种，进行液体深层发酵，发酵液过滤、浓缩、提取纤维素酶，所述木霉经亚硝酸盐诱变、紫外诱变和微波诱变进行诱变筛选处理。

所述木霉经亚硝酸盐诱变和紫外诱变、或亚硝酸盐诱变和微波诱变进行筛选处理；所述发酵的培养基包括如下质量组份组成：固定碳源2-5％，氮源0.5-2％，NaCl 1-2％，MgSO₄7H₂O1-2％，KH₂PO₄2-4％，产酶促进剂0-0.1％，余量以水补100％；所述的固定碳源包括麸皮和稻草粉。

所述的高活性纤维素酶的制备方法，其培养基由下列质量组份组成：

固定碳源以质量比为麸皮∶稻草粉为2∶12％

氮源蛋白胨或酵母膏 1％

NaCl 1％

MgSO₄7H₂O 1％

KH₂PO₄ 2％

Tween80或聚乙烯醇 0.05-0.08％余量以水补至100％

本发明所述发酵工艺是控制发酵时间72-144h，发酵温度25-35℃，PH为5.0-7.0，通气量为1∶0.6-1，搅拌速度80-130r/min。

本发明所述过滤为板框过滤，以滤布为过滤介质，控制过滤压力为0.2-0.3MPa；过滤液温度30-40℃。所述浓缩采用聚丙烯中空纤维超滤膜进行浓缩，发酵液浓度浓缩20-25倍。所述聚丙烯中空纤维超滤膜截留分子量为20000-30000。

本发明过滤时于发酵液中添加入发酵液体积量1-2％的硅藻土作助滤剂。

本发明高活性纤维素酶的制备方法，所述亚硝酸盐诱变是采用甲基磺酸乙酯诱变，将甲基磺酸乙酯缓冲溶液和木霉菌种孢子悬液等比例混合，于25-35℃下振荡处理0.5-3h，终止诱变反应；诱变后的菌种接种于培养基上培养72-140h制得突变木霉菌种；

所述紫外诱变将突变木霉菌种制成孢子悬液，置于培养皿中于20-30W紫外灯下照射时间20-160S诱变，稀释10-20倍，并接种于筛选培养基上，25-35℃下培养72-140h，制得正突变木霉菌种；

所述微波诱变，将上述正突变木霉菌种制成孢子悬液，采用低温分散法于2450MHZ微波炉，微波下辐射时间20-160S诱变，然后稀释10-20倍，并接种于筛选培养基上，25-35℃下培养72-140h制得高突变木霉菌种，把高突变木霉菌种采用摇瓶发酵复筛制得木霉生产菌种产品。

本发明高活性纤维素酶的制备方法，其甲基磺酸乙酯诱变于30℃温度下振荡处理时间为2h；紫外诱变于30W紫外灯下30cm距离照射时间为60S；微波诱变于微波炉功率800W下辐射时间为80S。

本发明高活性纤维素酶的制备方法，所述摇瓶发酵复筛是将50ml发酵培养基装于250ml摇瓶中，接种高突变木霉菌种孢子一环，置于摇床150rpm、25-35℃培养72-96h，制备木霉生产菌种。

本发明采用本技术方案以木霉为生产纤维素酶的菌种，同时采用亚硝酸盐诱变法，紫外线诱变法，微波诱变法三种方法相结合，对木霉菌种进行生产突变菌株诱变筛选；获得了生长旺盛，酶活力高木霉菌种，酶活力平均达4000u/ml以上；且诱变出的菌种稳定性好，采用蔡氏培养基斜面进行5次传代试验培养后其纤维素酶活力变化不大，具有较高遗传稳定性。

在利用木霉作为生产菌种的基础上，对发酵生产纤维素酶的发酵时间，温度，通气量，搅拌控制等，工艺路线进行了系统化研究生产，参数易控制，生产发酵周期短，产酶水平高，发酵液提取采用板框过滤控制，添加硅藻土作助滤剂，超滤膜浓缩，使发酵液浓度浓缩至20倍以上，发酵液收率高，生产出成品酶制剂活性最高可达100000u/ml以上。

本发明木霉生产菌种遗传稳定性试验按如下方式进行：将经组合诱变生产的本发明高突变木霉菌种在蔡氏培养基斜面上进行5次传代试验培养。每移接1次，同时进行转接入摇瓶培养基进行培养产酶试验，成熟后测其酶活性，结果见表1。

表1遗传稳定性试验结果

从表1中可以看出，经5次传代接种培养后，木霉生产菌种纤维素酶活力变化不大，且从外观观察孢子布满整个斜面的时间、孢子大小、颜色、密度也基本无变化，有较高遗传稳定性。

本发明生产出纤维素酶产品经中国广州分析测试中心检测达到或高于国家质量标准，检测结果如表(1)

表(1)

分析项目	测定结果
		形状	黄色至棕褐色染液体
PH	6.5-7.5
		温度范围	45-60℃
酶活力	100000u/ml
		检测方法	测活性用邻苯三酚自氧化法，测蛋白用LOWRY酚试剂法

注：样品状态为水剂，检测类型：送检。

具体实施方式：本发明实施例中菌种、培养基及酶活测定说明如下：

质量份或质量百分比浓度

1、菌种：木霉ZC-001，为引进出发菌。经检测木霉ZC-001酶活力为1400U/mL。

2、试管斜面培养基：10％麸皮浸出汁；蔡氏培养基(g/1000ml)；NaNO₃3、KC10.5、FeSO₄0.01、KH₂PO₄1.0、MgSO₄7H₂O 0.5、蔗糖20、琼脂2，ph值6.7。培养基在121℃下湿热灭菌30min。

将菌种接种于培养基上，30℃培养4d后即96h使用或4℃冰箱中保存，斜面菌种每月转接1次。

摇瓶培养基(g/1000ml)：麸皮10，豆饼2，蛋白胨4，KH₂PO₄1，酵母粉0.5，NaCl 0.3，MgSO₄7H₂O 0.3，PH值6.0。培养基在121℃下湿热灭菌30min。

筛选培养基(g/1000ml)：蛋白胨12，CMC20，KH₂PO₄1，MgSO₄7H₂O 1，NaCl 2，刚果红0.2，琼脂16，PH值6.0。培养基在121℃下湿热灭菌30min。

3、纤维素酶活力单位U定义为：在50℃、PH6.0的条件下，每1h产生1μg还原糖所需的酶量为一个纤维酶活力单位，用1U/ml表示。

实施例1质量份或质量百分比浓度

1)生产菌种确定以木霉ZC-001为引进出发生产菌，即生产菌种，一般选里氏木霉菌种，经检测酶活力为1400.0u/ml；先后采用亚硝酸盐诱变，所述亚硝酸盐诱变是采用甲基磺酸乙酯诱变，取1ml 0.2mol/l甲基磺酸乙酯缓冲溶液和木霉ZC-001生产菌种孢子悬液等比例混合置于试管中，加塞密闭，30℃下振荡处理0.5-3h，加入2ml 2Wt％Na₂SO₄溶液终止诱变反应；诱变后的菌种接种于筛选培养基上，30℃培养96h观察透明圈，挑选透明圈大的菌株摇瓶发酵后测定酶活，即制得突变木霉菌种；

再进行紫外诱变是将突变木霉菌种用生理盐水稀释制成孢子悬液，放置培养皿中1Cm厚，于30W紫外灯下30cm距离照射时间60S诱变后，稀释10倍，将诱变后的菌株接种于筛选培养基上，30℃下培养96h后观察透明圈，挑选透明圈大的菌株摇瓶发酵后测定酶活，制得正突变木霉菌种；

最后进行微波诱变，是将上述正突变木霉菌种用生理盐水稀释制成孢子悬液，采用低温分散法于2450MHZ微波炉，800W功率的微波下辐射时间80S诱变，然后稀释10倍，将诱变后的菌株接种于筛选培养基上，30℃下培养96h后观察透明圈，挑选透明圈大的菌株摇瓶发酵后测定酶活，制得高突变木霉菌种。发生正突变率高、酶活力最高的高突变木霉菌种，酶活为3368U/ml，比正突变木霉菌种提高81.9％，比突变木霉菌种提高237.6％，比木霉ZC-001提高345.7％。把高突变木霉菌种采用摇瓶发酵复筛即制得木霉生产菌种产品。

2)发酵工艺确定。

在带搅拌装置的发酵容器罐中进行，将上述诱变后确定的木霉生产菌种，采用液体发酵工艺，进行液体深层培养发酵，发酵液经过滤，浓缩，提取纤维素酶，液体发酵的培养基包括下列质量百分比的组份组成。

固定碳源是麸皮∶稻草粉质量比为2∶12％

氮源蛋白胨 1％

NaCl 1％

MgSO₄.7H₂O 1％

KH₂PO₄ 2％

产酶促进剂Tween80 0.07％

余量以水补至100％

控制液体发酵时间120h，发酵温度30℃，发酵液PH＝6.0，通气量1∶0.6-1，在发酵早期即对数生长期控制通气量为1∶0.6，产酶时期通气量控制在1∶1；所述的通气量是指单位时间内通入发酵容器内的气体体积，在确定上述条件的情况下，控制发酵容器的搅拌速度110r/min，制备获得发酵液。

经上述发酵工艺制备得到的发酵液，对其进行综合试验验证，产出的发酵液酶活在4500u/ml以上。

3)提取工艺确定

经发酵工艺制备的发酵液，用板框过滤法将液体深层培养的发酵液除去木霉菌，培养基残渣以及大颗粒固形物等杂质。从而获得本发明产品高活性纤维素酶。

板框过滤法以滤布为过滤介质，在0.25MPa的压力下，过滤液温度35℃，为提高过滤速度及分离效果，在需过滤的发酵液中添加入发酵液总体积1.5％的硅藻土作为助滤剂，并不断搅拌使过滤速度加快，过滤获得滤液再经浓缩处理，浓缩处理采用截留分子量30000的聚丙烯中空纤维超滤膜进行浓缩，使滤液浓缩至原滤液浓度20倍的高活性纤维素酶溶液，该纤维素酶溶液即为本发明产品高活性纤维素酶，产品经中国广州分析测试中心送样检测，酶活力达100000u/ml。见表(1)

下面实施例2-4中除下述例中改变的参数数据外，其余方法及步骤除注明外均和实施例1相同。实施例2-4的培养基和反应条件

表2

注：实施例2-4中发酵培养基组成余量均为用水补至100％。实施例2的生产菌种木霉是经亚硝酸盐诱变和紫外诱变组合进行生产制得

Claims

1.一种高活性纤维素酶的制备方法，采用液体发酵工艺，以木霉为生产菌种，进行液体深层发酵，发酵液过滤、浓缩、提取纤维素酶，其特征是所述木霉经亚硝酸盐诱变、紫外诱变和微波诱变进行诱变筛选处理。

2.依据权利要求1所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是所述木霉经亚硝酸盐诱变和紫外诱变、或亚硝酸盐诱变和微波诱变进行筛选处理；所述发酵的培养基包括如下质量组份组成：固定碳源2-5％，氮源0.5-2％，NaCl 1-2％，MgSO₄7H₂O 1-2％，KH₂PO₄2-4％，产酶促进剂0-0.1％，余量以水补100％；所述的固定碳源包括麸皮和稻草粉。

3.依据权利要求1所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是所述培养基由下列质量组份组成：

固定碳源以质量比为麸皮∶稻草粉为2∶12％

氮源蛋白胨或酵母膏 1％

NaCl 1％

MgSO₄7H₂O 1％

KH₂PO₄ 2％

Tween80或聚乙烯醇 0.05-0.08％

余量以水补至100％

4.依据权利要求1所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是所述发酵工艺是控制发酵时间72-144h，发酵温度25-35℃，PH为5.0-7.0，通气量为1∶0.6-1，搅拌速度80-130r/min。

5.依据权利要求1所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是所述过滤为板框过滤，以滤布为过滤介质，控制过滤压力为0.2-0.3MPa；过滤液温度30-40℃。

6.依据权利要求1所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是所述浓缩采用聚丙烯中空纤维超滤膜进行浓缩，发酵液浓度浓缩20-25倍；所述聚丙烯中空纤维超滤膜截留分子量为20000-30000。

7.依据权利要求1所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是过滤时于发酵液中添加入发酵液体积量1-2％的硅藻土作助滤剂。

8.依据权利要求1所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是所述亚硝酸盐诱变是采用甲基磺酸乙酯诱变，将甲基磺酸乙酯缓冲溶液和木霉菌种孢子悬液等比例混合，25-35℃下振荡处理0.5-3h，终止诱变反应；诱变后的菌种接种于培养基上培养72-140h制得突变

9.依据权利要求8所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是亚硝酸盐诱变于30℃温度下振荡处理时间为2h；紫外诱变于30W紫外灯下30cm距离照射时间为60S；微波诱变于微波炉功率800W下辐射时间为80S。

10.依据权利要求8所述的高活性纤维素酶的制备方法，其特征是所述摇瓶发酵复筛是将50ml发酵培养基装于250ml摇瓶中，接种高突变木霉菌种孢子一环，置于摇床150rpm、25-35℃培养72-96h，制备木霉生产菌种。