CN103740680A - 里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法及其菌株应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，利用一株保藏编号为CCTCC No：M2013540的里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株发酵生产纤维素酶。所述菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0，最适温度为23～35℃。所述菌株的种子液接种于发酵培养基中，25℃培养104小时，发酵液纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。

Description

里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法及其菌株应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，特别涉及里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法及其菌株应用。 

背景技术：

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。在进行酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。 

纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。 

纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex)和β-葡聚糖苷酶（β-1,4-glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。 

纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。 

1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结 晶纤维素水解。 

菌种选育是纤维素酶生产的基础性工作，国内外许多专家进行了大量研究，为了生产高质量的纤维素酶产品，王家林等（1996）在吸收国内外经验的基础上，先后引进了绿色木霉木10、绿色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基础上，采用了紫外线、特定电磁波辐射、线性加速器，亚硝基胍等物理、化学的诱变方法，获得了高产菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固体培养活力经轻工部食品质量监督检测中心南京站检测表明，滤纸活力为3670u/g,C1-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已达到国际先进水平。此菌种在工厂化生产中性能稳定。张苓花等（1998）采用康氏木霉W-925，J-931，经过浓度为2%硫酸二乙酯和紫外线（15W、30cm、2min）复合诱变后，得到了产酶活性高的Wu-932菌种，该菌种CMC糖化力达到2975，滤纸糖酶活性为531，比出发菌W-925分别提高了100%和81%。化工部饲料添加剂技术服务中心王成书等（1997）采用该中心的里氏木霉A3先进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，30℃培养5-8天，15℃放置7-10天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到了产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。 

纤维素酶的生产工艺主要有两种，即固体发酵和液体发酵，其工艺如下： 

1、影响产酶量和活力的因素：影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。张中良等（1997）采用均匀设计Cl12(1210)，以绿色木霉（T.ViriclePers.expr）为菌种，研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃条件下培养45h可获得最大产酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。王成华等（1997）也研究了其诱变筛选的里氏木霉91-3的产酶条件，结果表明该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为最佳培养基，28-32℃为适宜培养温度，30℃为最佳温度，4%为最佳接种量，96h到达发酵高峰。张苓花等（1998）研究了以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。结果表明，以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35℃，发酵时间72h为最佳发酵条件。 

专利申请号为201010040047，申请人浙江大学,本发明提供了一种生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：将里氏木霉（TriCh。derma reesei)接种至发酵培养基中，发酵后开始流加培养，流加培养过程中，当发酵液l,H值高于4.8时，流加培养基，当发酵液pH值低于4.5时，停止流加培养基，总发酵时间达到192-240小时，停止发酵。本发明方法将不溶性碳源和可溶性碳源有机结合，协同诱导纤维素酶基因的表达。通过流加培养使菌种的 生长与目的代谢产物的形成过程达到协调平衡，解决了单纯以纤维素或可溶性糖为诱导物生产纤维素酶的工艺中存在的问题，有效提高了纤维素酶的发酵水平，而且获得的纤维素酶对纤维素底物的降解性能较强。 

申请号2013102687288一种低温中性纤维素酶的制备方法，所述低温中性纤维素酶以里氏木霉为菌株制备，该制备方法包括：活化菌种，紫外诱变，然后在低温下培养、纯化，并将纯化菌株于10一15℃下发酵制备种子液，将种子液接种于产酶培养基中，10一15℃下培养96一144小时，便获得低温中性纤维素酶；本发明还提供了一种所述低温中性纤维素酶的复配方法。本发明的有益效果为：操作简单，发酵周期短，可降低酶的应用温度，从而降低工业应用的耗能，使其更环保，具有广阔的应用前景；此外，本发明还提供了一种该纤维素酶的复配方法，其可广泛用于造纸纤维的改性，降低造纸工业纤维改性的成本。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种由里氏木霉菌株发酵生产高活力纤维素酶的方法。 

所述生产菌株为里氏木霉(Trichodema reesei)601-17，该菌株于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013540，分类命名为里氏木霉601-17Trichodema reesei601-17，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072。 

本发明提供的菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)CCTCC NO：M2013540可应用于酸性纤维素酶的发酵生产。 

里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述里氏木霉为保藏编号CCTCC NO：M2013540的菌株，具体方法如下：CCTCC NO：M2013540纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-6000rpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到浓缩酶液。 

所述菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0；最适温度为23～35℃。 

所述菌株的种子液接种于发酵培养基中，25℃培养104小时，发酵液纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。 

所述菌株生理生化特征： 

该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.1-0.75mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.0-8.5mm,72h达30-50mm；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2-5ūm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。分生孢子梗呈瓶状，直立，无色，孢子呈球形，绿色，直径20-100ūm。 

该菌株可在麦麸上生长，主要代谢产物为纤维素酶（内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶）。根据《An Introduction industrial mycology》（George Smith1954）、《真菌鉴定手册》（魏景超1982）、《常见与常用真菌》（中科院微生物研究所1973)，鉴定该菌株为：里氏木霉。 

利用里氏木霉菌株，通过紫外诱变、培养、发酵生产纤维素酶的方法如下。 

里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外线照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落； 

诱变选育后的孢子菌落涂布于初筛培养基中，在20-35℃下培养3-5天，挑选初筛菌株并纯化该菌株；纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-6000rpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到浓缩酶液。 

本发明的有益效果为：得到了一株里氏木霉，可应用于发酵产高活力酸性纤维素酶，其制备方法简单，发酵周期短，可大大降低工业应用的耗能，使其更环保，具有广阔的工业应用前景。 

具体实施方式：

菌种初筛：采自津市市保河堤食用菌培植基地中的土样筛选分离出里氏木霉菌株HYX01。里氏木霉菌株接种到斜面活化培养基上，活化菌种；培养活化后的菌种，挑取单菌落制备孢子悬浮液，并用紫外照射孢子悬浮液，诱变得到孢子菌落；适当稀释将孢子浓度调节为103个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。（所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。 

复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％（v/v），30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。（所述复筛培养基 组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。 

复筛选出菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)601-17，保藏编号为CCTCC NO：M2013540。 

培养特征：该菌株产纤维素酶的最适pH3.0-6.0；最适温度为23～35℃。 

遗传稳定性试验：将该菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。 

放大试验 

种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。 

种子罐培养：将种子液以10%（v/v）接种量接入装有7.5L发酵培养基的10L发酵罐中，控制pH值恒定为5.0±0.2，培养温度27±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量（v/v）1:0.8-1.2,培养时间104h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基制备方法为：纤维素粉10%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.025%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.01%、其余为水，pH值5-6，121℃灭菌20min。 

发酵结束后，取发酵上清液（粗酶液）进行酶活力检测，经测定，外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。 

本发明中使用的里氏木霉（Trichoderma reesei）是公知的微生物，诱变后的菌株在4℃环境中可保存2个月，在10-20%的山梨醇溶液中，于零下80℃下可长期保存。 

斜面培养基：马铃薯20%、葡萄糖1%、琼脂2%，其余为水，pH自然，温度28℃。 

例1 

将种子液以10%（v/v）接种量接入装有7.5L发酵培养基的10L发酵罐中，控制pH值恒定为4.0±0.2，培养温度25±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量（v/v）1:1,培养时间100h，溶解氧26%。所述发酵培养基制备方法为：纤维素粉10%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.025%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.01%、其余为水，pH值5-6，121℃灭菌20min。 

发酵结束后，取发酵上清液（粗酶液）进行酶活力检测，经测定，外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到676U/mL、1392U/mL、483U/mL和802U/mL。 

Claims (5)

1.里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述里氏木霉为保藏编号CCTCC NO：M2013540的菌株，具体方法如下：CCTCC NO：M2013540纯化菌株按5％的接种量接种于发酵培养基中，逐级扩大培养制备种子液，培养时间为72-96小时；种子液按发酵液体积5-10％的接种量接种于发酵培养基中，20-35℃培养96-144小时，即里氏木霉发酵生产纤维素酶结束；将发酵液在4000-6000rpm离心，收集所得液体为粗酶液；得到的粗酶液进行超浓缩过滤，得到浓缩酶液。

2.根据权利要求1所述的里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基制备方法为：纤维素粉10%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.025%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.01%、其余为水，pH值5-6，121℃灭菌20min。

3.根据权利要求1或2所述的里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述粗酶液中纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。

4.据权利要求1或2所述的里氏木霉发酵生产纤维素酶的方法，所述菌株产纤维素酶的pH3.0-6.0；温度为23～35℃。

5.要求1-4所述菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)CCTCC NO：M2013540在纤维素酶发酵生产中的应用。