CN105176833A - 一株产纤维素酶的木霉菌株及其应用 - Google Patents

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CN105176833A CN201510484372.0A CN201510484372A CN105176833A CN 105176833 A CN105176833 A CN 105176833A CN 201510484372 A CN201510484372 A CN 201510484372A CN 105176833 A CN105176833 A CN 105176833A
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钟耀华
吕珊珊
侯运华
杨少龙
任美斌
钱远超
闫孟节
钟立霞
张静
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Abstract

本发明公开了一株产纤维素酶的木霉菌株，其是由里氏木霉(T.reesei)RUT-C30紫外诱变获得，该菌株命名为里氏木霉(Trichoderma？reesei)CU7-4，菌株已于2015年07月10日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC？N0.11065。本发明还公开了所述菌株在发酵生产纤维素酶酶液中的应用，实验证实本发明的菌株最高滤纸酶活为8.28IU/mL，是出发菌株的3.43倍；最高总蛋白为4.14mg/mL，是出发菌株的1.92倍，预示该菌株在纤维素酶生产中有较好的应用前景。

Description

一株产纤维素酶的木霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域；具体地说，本发明涉及一株产纤维素酶的木霉菌株及其在发酵生产纤维素酶酶液中的应用。
背景技术
已知里氏木霉(Trichodermareesei)RUT-C30(保藏号为ATCC56765)是经多次诱变程序从野生型菌株里氏木霉(T.reesei)QM6a育种而来，其具有较强的纤维素酶生产能力，并解除了葡萄糖阻遏。但现实中其产纤维素酶的能力仍不能满足大规模工业化需要，尤其是纤维乙醇产业的应用需求。目前报道的里氏木霉(Trichodermareesei)RUT-C30在摇瓶中滤纸酶活仅为2.41IU/mL，总蛋白仅为2.16mg/mL，还需要进一步改良。
紫外线是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一，其被DNA吸收后形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因，尤其是紫外诱变技术操作简便，可以用于大规模的突变筛选。鉴于上述里氏木霉(T.reesei)RUT-C30(保藏号为ATCC56765)的不足，利用紫外诱变技术对里氏木霉(T.reesei)RUT-C30进行高通量大规模的突变筛选，有望获得高产纤维素酶的诱变木霉菌株。
发明内容
针对现有产纤维素酶的菌株的不足，本发明要解决的问题是提供一株高产纤维素酶的木霉菌株及其在发酵生产纤维素酶酶液中的应用。
本发明所述的产纤维素酶的木霉菌株，其特征在于：该菌株命名为里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4，菌株已于2015年07月10日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCN0.11065。
上述突变株里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4的特征为：菌落形态小，在PDA固体平板上菌丝蔓延速度较慢，孢子颜色较浅(见图5)，生孢数量明显变少(见图6)。
本发明所述突变株产纤维素酶的木霉菌株的紫外诱变育种方法：参照常规的紫外诱变育种方法，先寻找最佳诱变时间，在距离20W紫外灯管下30cm处诱变106/mL浓度的里氏木霉(Trichodermareesei)RUT-C30孢子悬液。实验测得在100s时致死率达到90％，确定100s为最佳诱变时间(见图1)。在此条件下用1.5％球磨纤维素-1％葡萄糖-1.5％Triton的双层平板初筛，又经过纯纤维素液体培养和复合发酵培养复筛，并结合在PDA培养基上生孢情况最终确定一株最高产突变株，即为本发明所述突变株——产纤维素酶的木霉菌株，命名为里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4。
本发明所述产纤维素酶的木霉菌株在发酵生产纤维素酶酶液中的应用。
其中：所述产纤维素酶的木霉菌株液体发酵生产纤维素酶酶液方法是：将里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4接种到装有50-100ml葡萄糖基本培养基的300-500ml三角瓶中，30±2℃，在180-200rpm往复式摇床上培养24-36h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按1g﹕120-150ml的比例将湿菌丝接种到发酵培养基中，继续培养120-168h，然后以9000-13000rpm，4℃离心5-10min，收集的上清液即为含纤维素酶的酶液。
实验证实：采用上述方法，在装有100mL5％纤维素复合发酵液的500mL三角瓶中摇瓶培养液7d，该突变株(CU7-4)的最高滤纸酶活为8.28IU/mL，是出发菌株(RUT-C30，滤纸酶活2.41IU/mL)的3.43倍(见图12)；最高总蛋白为4.14mg/mL，是出发菌株(RUT-C30，总蛋白2.16mg/mL)的1.92倍(见图11)。
本发明采用紫外诱变(T.reesei)RUT-C30(ATCC56765)的策略，得到了具有很高的纤维素酶活力的突变菌株里氏木霉(T.reesei)CU7-4CGMCCN0.11065，其液体发酵情况下最高滤纸酶活为8.28IU/mL，是出发菌株的3.43倍；最高总蛋白为4.14mg/mL，是出发菌株的1.92倍。预示该突变菌在生产纤维素酶和降解纤维素中有着非常广泛的应用。
附图说明
本发明提供的里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4菌株已于2015年07月10日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏号为CGMCCN0.11065。
图1.紫外照射RUT-C30致死率。
图2.突变株筛选条件纤维素浓度分析及确立。
图3.突变株筛选条件Triton浓度分析及确立。
图4.CU7-4和对照RUT-C30分单孢比较。
图5.CU7-4和对照RUT-C30在PDA培养基上生孢比较。
图6.CU7-4和对照RUT-C30在PDA培养基上生孢量比较。
图7.CU7-4的传代分析。
图8.葡萄糖标准曲线。
图9.CU7-4和RUT-C30发酵液蛋白电泳结果。
图10.CU7-4和RUT-C30发酵液的纤维素内切酶活性电泳结果。
图11.CU7-4和RUT-C30的总蛋白测定结果。
图12.CU7-4和RUT-C30的滤纸酶活测定结果。
图13.CU7-4和RUT-C30的纤维素内切酶测定结果。
图14.CU7-4和RUT-C30的β-葡萄糖苷酶酶活测定结果。
图15.CU7-4和RUT-C30的纤维素外切酶酶活测定结果。
具体实施方式
实施例1.确定里氏木霉(T.reesei)RUT-C30紫外诱变最佳照射时间
首先用孢子洗脱液洗新鲜的RUT-C30孢子，并用血球计数板计数。然后用孢子洗脱液稀释到1～2×106个/mL。取2mL稀释好的孢子悬液打入平板内，轻轻摇晃使孢子悬液铺满整个平板，然后放到距离20W紫外灯下30cm处。
照射0min(对照)、0.5min、1min、2.5min、5min、15min、30min七个时间梯度。
将诱变好的孢子稀释1000倍到1～2×103个/mL，分别取各个时间段稀释好的孢子液100μL涂布到葡萄糖基本培养基(+0.5％Triton)平板上在30℃恒温培养，三组平行。(在暗室中操作)
培养4天后，统计每个平板上的菌落数，绘出RUT-C30在紫外诱变下的致死率。并确定最佳时间为100s(见图1)。
上述葡萄糖基本培养基(g/L)：葡萄糖20，(NH4)2SO45，KH2PO415，MgSO40.6，CaCl20.6，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O0.0016，ZnSO4·7H2O0.0014，CoCl20.002，琼脂粉20。
实施例2.里氏木霉(T.reesei)RUT-C30突变株筛选条件的摸索
用单因素法确定里氏木霉(T.reesei)RUT-C30突变株的筛选条件，主要确定纤维素双层平板中纤维素的浓度和Triton的浓度。因为里氏木霉(T.reesei)RUT-C30是葡萄糖脱阻遏菌株，所以纤维素双层平板上加了1％葡萄糖。
先把Triton的浓度认为定值为1.5％，确定纤维素浓度。把RUT-C30孢子悬液稀释到1×102个/mL，然后涂布在含1.5％的Triton双层平板上，纤维素浓度分别为(0、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％)各三个平行，放到30℃保温箱培养。培养6天后，观察结果确定1.5％纤维素浓度最好(见图2)。
再确定Triton的浓度。把RUT-C30孢子悬液稀释到1×102个/mL，然后涂布在1.5％的纤维素双层平板上，Triton浓度分别为(0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％)各两个平行，放到30℃保温箱培养。培养6天后，观察结果确定1.5％Triton浓度最好(见图3)。
上述确定出的纤维素培养基(g/L)配方是：球磨纤维素15，葡萄糖10，(NH4)2SO45，KH2PO415，MgSO40.6，CaCl20.6，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O0.0016，ZnSO4·7H2O0.0014，CoCl20.002，Triton15，琼脂粉20。
上述双层平板制备方法：向平板中倒入15ml水琼脂培养基，凝固后，再倒入10mL的纤维素上层培养基，凝固后得到双层平板。
实施例3.里氏木霉(T.reesei)RUT-C30突变株的初筛和复筛
初筛：从纤维素双层平板中挑取透明圈比出发菌株大的突变株，并接种到PDA斜面上，然后编号，放到30℃恒温箱中培养生孢。
复筛：把培养好的突变株，用孢子洗脱液洗出。取1μL点到纤维素双层平板上，30℃恒温箱中培养，并用出发菌株做对照。培养7d后，突变株与出发菌株做对比，进行复筛选出透明圈明显增大的菌株，最终确定编号为CU7-4的里氏木霉(T.reesei)突变株。
单孢纯化：把复筛出突变株孢子悬液稀释到100/mL，取100μL菌液涂布到纤维素双层平板中，30℃恒温箱中培养6d，挑取长出的单菌落并接到PDA平板上，30℃恒温箱(见图4)。
实施例4.里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4和出发菌株RUT-C30复合发酵确定总纤维素酶活。
将里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4和出发菌株RUT-C30的孢子悬液分别接种到100ml(500ml的三角瓶)纤维素复合种子培养基中，30℃100rpm(往复式摇床)培养28h后，每株取10mL菌液分别转接到100ml(500ml的三角瓶)发酵培养基中继续培养，在5d和7d取发酵液，离心测定酶活。将发酵液以13000r/min离心5min，取上清即为粗酶液。
将1×6cm(50±1mg)滤纸折叠放入试管底部，加入1.5mlpH4.8的柠檬酸缓冲液和0.5ml适当稀释的粗酶液，混匀。50℃水浴60min后加入3mlDNS，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，540nm测OD值。空白对照是先加DNS再加酶液。
酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，将每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶量定为一个酶活力单位。
滤纸酶活测定结果显示突变株CU7-4的最高滤纸酶活为8.28IU/mL，是出发菌株(2.41IU/mL)的3.43倍(见图12)。
其中上述葡萄糖标准曲线的制备如下：
取100mg葡萄糖(105℃烘干至恒重)，加到100ml容量瓶中，加dH2O溶解，定容至100ml，即1mg/ml的葡萄糖溶液，摇匀，过夜。取10支25ml刻度试管，洗净，烘干，按表1操作。
OD值的测定采用美国产型号为SPECTRAMAX190的“微板光谱仪”。
表1葡萄糖标准曲线的制备
根据上述方法和表1所示结果，以葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标，OD540为纵坐标作图即为葡萄糖标准曲线。葡萄糖标准曲线如图8。
其中，上述种子培养基(w/v)配方是：2％纤维素，1.5％玉米粉，0.5％(NH4)2SO4，0.6％KH2PO4，0.1％MgSO4，0.25％CaCO3，0.25％甘油，0.2％Tween-80。
发酵培养基(w/v)配方是：5％纤维素，2.7％玉米粉，0.5％(NH4)2SO4，0.6％KH2PO4，0.1％MgSO4，0.25％CaCO3，0.25％甘油，0.2％Tween-80。
上述酶活力测定所需试剂如下：
DNS(3，5二硝基水杨酸)的配制：①NaOH104g溶于1300ml蒸馏水中；②3，5－二硝基水杨酸30g加入①中混匀，加热溶解；③酒石酸钾钠910g溶于2500ml蒸馏水中；④25g重蒸酚，加25g无水亚硫酸钠，加入③中；将以上各步骤的溶液混合，加入1200ml蒸馏水(总体积5000ml)，放在棕色瓶中，暗处放置一周后即可使用。
柠檬酸缓冲液(0.05mol/LpH4.8)：称取一水柠檬酸4.83g，溶于约750mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，用水定容至1000mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。
实施例5.里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4传代稳定性的研究
取里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4孢子悬液1μL点在PDA平板上，放到30℃恒温培养箱培养10d，然后用孢子洗脱液洗脱孢子，即为1代。然后再取洗脱下来的孢子点在PDA平板上生孢，然后洗孢并上述方法以此类推，一直传到10代，每一代孢子都保存下来。
取CU7-4第3、7、10代孢子和出发菌株的孢子悬液各1μL分别接种到1.5％纤维素的双层平板上，30℃恒温7d，观察菌株和水解圈的圈径比(见图7)。
其中上述PDA培养基配方是：去皮土豆200g切成块加水1000ml煮30min后用纱布过滤取滤液，加20g葡萄糖至滤液中溶解后定容至1000ml。加2％琼脂成固体培养基。pH为天然pH。
孢子洗脱液(w/v)配方是：0.95％NaCl，0.05％吐温80。
纤维素培养基(g/L)配方是：球磨纤维素15，葡萄糖10，(NH4)2SO45，KH2PO415，MgSO40.6，CaCl20.6，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O0.0016，ZnSO4·7H2O0.0014，CoCl20.002，Triton15，琼脂粉20。
上述双层平板制备方法：向平板中倒入15ml水琼脂培养基，凝固后，再倒入10mL的纤维素上层培养基，凝固后得到双层平板。
实施例6.里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4和出发菌株RUT-C30酶系组分的测定
将里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4和出发菌株接种到装有100ml(500ml的三角瓶)纤维素复合种子培养基中，30℃100rpm(往复式摇床)培养28h后，每株取10mL菌液分别转接到100ml(500ml的三角瓶)发酵培养基中继续培养，在7d和9d取发酵液，离心测定酶活。将发酵液以13000r/min离心5min，取上清即为粗酶液。
然后进行酶系组分的测定。
1)总纤维素酶活：将1×6cm(50±1mg)滤纸折叠放入试管底部，加入1.5mlpH4.8的柠檬酸缓冲液和0.5ml适当稀释的粗酶液，混匀。50℃水浴60min后加入3mlDNS，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，540nm测OD值。空白对照是先加DNS再加酶液。
酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，将每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶量定为一个酶活力单位。
里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4的最高滤纸酶活为8.28IU/mL，是出发菌株(2.41IU/mL)的3.43倍(见图12)。
2)纤维素内切酶酶活：取2mL含1％CMC-Na的柠檬酸缓冲溶液，加入0.5mL适当稀释的粗酶液，混匀。50℃水浴30min后加入3mlDNS，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，540nm测OD值。空白对照是先加DNS再加酶液。
酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，将每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶量定为一个酶活力单位。
里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4的最高纤维素内切酶酶活为158.44IU/mL，是出发菌株(38.6IU/mL)的4.10倍(见图13)。
3)β-葡萄糖苷酶酶活：取100μl适当稀释的粗酶液，加入50μl10mmol/L对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)柠檬酸Buffer溶液(pH4.8)，混匀，50℃水浴30min后加入150μl10％Na2CO3终止反应。405nm测OD值。同时以未加酶液的管为空白对照。
酶活的定义：在50℃、pH4.8条件下，每毫升酶液每分钟产生对硝基酚(pNP)的微摩尔数。
里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4的最高β-葡萄糖苷酶酶活为16.18IU/mL，是出发菌株(2.32IU/mL)的6.97倍(见图14)。
4)纤维素外切酶酶活：取100μl适当稀释的粗酶液，加入50μl10mmol/L对硝基苯基-D-纤维二糖苷(pNPC)柠檬酸Buffer溶液(pH4.8)，混匀，50℃水浴30min后加入150μl10％Na2CO3终止反应。405nm测OD值。同时以未加酶液的管为空白对照。
酶活的定义：在50℃、pH4.8条件下，每毫升酶液每分钟产生对硝基酚(pNP)的微摩尔数。
里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4的最高纤维素外切酶酶活为2.63IU/mL，是出发菌株(0.27IU/mL)的9.74倍(见图15)。
5)总蛋白：取20μl适当稀释的粗酶液，加入200μlBradford，反应5min，595nm测OD值，同时用水做空白对照，在10min内完成。
里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4的最高总蛋白为4.14mg/mL，是出发菌株(2.16mg/mL)的1.92倍(见图11)。
其中，上述种子培养基(w/v)配方是：2％纤维素，1.5％玉米粉，0.5％(NH4)2SO4，0.6％KH2PO4，0.1％MgSO4，0.25％CaCO3，0.25％甘油，0.2％Tween-80。
发酵培养基(w/v)配方是：5％纤维素，2.7％玉米粉，0.5％(NH4)2SO4，0.6％KH2PO4，0.1％MgSO4，0.25％CaCO3，0.25％甘油，0.2％Tween-80。
DNS(3，5二硝基水杨酸)的配制：①NaOH104g溶于1300ml蒸馏水中；②3，5－二硝基水杨酸30g加入①中混匀，加热溶解；③酒石酸钾钠910g溶于2500ml蒸馏水中；④25g重蒸酚，加25g无水亚硫酸钠，加入③中；将以上各步骤的溶液混合，加入1200ml蒸馏水(总体积5000ml)，放在棕色瓶中，暗处放置一周后即可使用。
实施例7.里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4和出发菌株发酵液SDS-PAGE和native-PAGE的检测。
1)取里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4和出发菌株第七天复合发酵液进行SDS-PAGE检测。
凝胶的制备：将电泳槽玻璃板洗净，按照使用说明装配好灌胶用的凝胶模具；根据所配制的分离胶的浓度，将去离子水，分离胶缓冲液，1％TEMED溶液，10％SDS溶液，30％凝胶储备液和10％过硫酸按按比例加入轻轻混合均勾后灌制分离胶；将凝胶溶液缓慢加入凝胶模具内，注意避免气泡的产生；轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1-5mm的无水乙醇层，使凝胶表面变得平整；室温放置30-40min，使凝胶聚合，聚合后，吸尽分离胶上面得无水乙醇层；根据所配制的堆积胶得浓度，将适量的去离子水，堆积胶缓冲液，1％TEMED溶液，10％SDS溶液，30％凝胶储备液和10％过硫酸铵轻轻混合均匀灌制堆积胶；将堆积胶溶液加至分离胶得上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板得顶端；将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板得顶端平齐，同时必须确保梳子齿的末端没有气泡；等待约30min，待凝胶聚合后，小心拔出梳子；将凝胶放入电泳槽内，在内外电泳槽中加入电泳缓冲液，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中，待用。本专利中使用12％分离胶和5％堆积胶。
蛋白样品的制备和上样：将蛋白质样品与蛋白loadingbuffer混匀，沸水浴5min；10,000rpm，4℃离心2min，以去除蛋白质碎片和其他杂质；用微量注射器将样品加入上样孔中，要注意避免带入气泡，以免样品污染相邻的上样孔。
电泳：采用20mA恒流电泳。
染色和脱色：电泳完成后，将凝胶轻轻从玻璃板上剥离开来，放入盛有少量考马斯亮蓝染液的容器中；置于摇床上上缓慢振荡1-2h染色；弃去染色液，将凝胶在水中漂洗数次；加入脱色液，置于摇床上上缓慢振荡，不时更换脱色液，直至凝胶上条带清晰可见(见图9)。
里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4的最高总蛋白为4.14mg/mL，是出发菌株(2.16mg/mL)的1.92倍(见图11)。
上述12％分离胶：H2O3.5mL；30％母液3mL；缓冲溶液(pH8.8)0.9mL；10％SDS75μL；10％APS60μL；TEMED5μL。
5％浓缩胶：H2O2.1mL；30％母液0.5mL；缓冲溶液(pH6.7)0.37mL；10％SDS25μL；10％APS25μL；TEMED5μL。
分离胶缓冲液：3MTris-HCl，pH8.5；
堆积胶缓冲液：0.5MTris-HCl，pH6.7；
电泳缓冲液：6gTris，28.8g甘氨酸，l0gSDS，pH8.3，定容到1L；
考马斯亮蓝染液：1g考马斯亮蓝R-250，500ml无水乙醇，100ml冰醋酸，加水定容到1L；
脱色液：500ml无水乙醇，100ml冰醋酸，加水定容到1L。
2)取里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4和出发菌株第七天复合发酵液进行native-PAGE检测。
凝胶的制备：将电泳槽玻璃板洗净，按照使用说明装配好灌胶用的凝胶模具；根据所配制的分离胶的浓度，将去离子水，分离胶缓冲液，1％TEMED溶液，30％凝胶储备液和10％过硫酸按按比例加入轻轻混合均勾后灌制分离胶；将凝胶溶液缓慢加入凝胶模具内，注意避免气泡的产生；轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1-5mm的无水乙醇层，使凝胶表面变得平整；室温放置30-40min，使凝胶聚合，聚合后，吸尽分离胶上面得无水乙醇层；根据所配制的堆积胶得浓度，将适量的去离子水，堆积胶缓冲液，1％TEMED溶液，30％凝胶储备液和10％过硫酸铵轻轻混合均匀灌制堆积胶；将堆积胶溶液加至分离胶得上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板得顶端；将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板得顶端平齐，同时必须确保梳子齿的末端没有气泡；等待约30min，待凝胶聚合后，小心拔出梳子；将凝胶放入电泳槽内，在内外电泳槽中加入电泳缓冲液，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中，待用。本专利中使用10％分离胶和5％堆积胶。
蛋白样品的制备和上样：将蛋白质样品与蛋白loadingbuffer混匀，用微量注射器将样品加入上样孔中，要注意避免带入气泡，以免样品污染相邻的上样孔。
电泳：采用20mA恒流电泳。
与底物反应、染色和脱色：电泳完成后，将凝胶轻轻从玻璃板上剥离开来，放入盛有pH4.8柠檬酸缓冲溶液的容器中；置于摇床上缓慢振荡15min；弃去缓冲溶液，再往容器中加入溶有2％CMCNa的柠檬酸缓冲液，没过凝胶，置于50℃恒温箱中反应1h，弃去CMCNa溶液，加入刚果红染液，置于摇床上缓慢振荡30min染色，弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次；加入1MNaCl脱色液，置于摇床上缓慢振荡，不时更换脱色液，直至凝胶上条带清晰可见。(见图10)
里氏木霉(T.reesei)突变株CU7-4的最高纤维素内切酶酶活为158.44IU/mL，是出发菌株(38.6IU/mL)的4.10倍(见图13)。
上述10％分离胶：H2O4mL；30％母液2.5mL；缓冲溶液(pH8.8)0.9mL；10％APS60μL；TEMED5μL。
5％浓缩胶：H2O2.1mL；30％母液0.5mL；缓冲溶液(pH6.7)0.37mL；10％APS25μL；TEMED5μL。
分离胶缓冲液：3MTris-HCl，pH8.5；
堆积胶缓冲液：0.5MTris-HCl，pH6.7；
电泳缓冲液：3gTris，14.4g甘油，定容到1L；
5×样品缓冲液：6％1MTris-HCl(pH6.8)；25％甘油；0.1％溴酚蓝；
刚果红染液：刚果红0.1g；乙醇10mL；蒸馏水90mL。
脱色液：1MNaCl，加水定容到1L。
上述里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4菌株已于2015年07月10日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏号为CGMCCN0.11065。

Claims (3)

1.一株产纤维素酶的木霉菌株，其特征在于：该菌株命名为里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4，菌株已于2015年07月10日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCN0.11065。
2.权利要求1所述产纤维素酶的木霉菌株在发酵生产纤维素酶酶液中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产纤维素酶的木霉菌株液体发酵生产纤维素酶酶液方法是：将里氏木霉(Trichodermareesei)CU7-4接种到装有50-100ml葡萄糖基本培养基的300-500ml三角瓶中，30±2℃，在180-200rpm往复式摇床上培养24-36h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按1g﹕120-150ml的比例将湿菌丝接种到发酵培养基中，继续培养120-168h，然后以9000-13000rpm，4℃离心5-10min，收集的上清液即为含纤维素酶的酶液。
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