CN104371934B - 一种里氏木霉突变菌株及其应用 - Google Patents

一种里氏木霉突变菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明利用辐射诱变技术获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株LA2‑7，其保藏编号为CCTCC NO:2014564。该突变株LA2‑7发酵上清液酶活为3282U/mL，比出发菌提高了276％，蛋白含量为12.2g/L，比出发菌提高了237％。此外，突变株LA2‑7的菌落明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝粗、短，分枝多，有利于在生产过程中降低发酵菌液的粘度，进而可以降低搅拌速度，提高溶氧，能有效降低生产成本，应用前景广泛。

Description

一种里氏木霉突变菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种里氏木霉突变菌株及其应用。
背景技术
里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种丝状真菌，属于多细胞的真核微生物，是红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型，分类上隶属于真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、木霉属。里氏木霉广泛分布于自然界，在腐木、种籽、植物残体、有机肥、土壤和甚至是空气中(Montenecourt& Eveleigh,1979,Adv Chem Ser.)。
里氏木霉能表达多种胞外纤维素酶和半纤维素酶，包括外切纤维素酶(CBH1和CBH2)、内切纤维素酶(EG1、EG2、EG3、EG4和EG5等)、beta-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等。通过这些纤维素酶和半纤维素酶的协同作用，将纤维素彻底分解为单糖(Biely &Tenkanen.1998,In Trichoderma and Gliocladium)，因此，木霉产纤维素酶已经是二代纤维素生物乙醇的主要酶制剂来源。
但成本过高已经成为限制纤维素乙醇产业化开发的关键，尤其纤维素酶的成本。当前，每吨纤维素的成本中，纤维素酶的成本超过了2000元。因此筛选高产纤维素酶的菌株是降低生产乙醇成本的关键因素之一。而影响木霉纤维素酶表达的因素很多。首先，培养碳源的影响：纤维素，乳糖和槐糖用来诱导木霉产纤维素酶；葡萄糖和甘油等阻遏纤维素酶的表达。碳源的诱导作用是调控因子来影响表达的，如与诱导表达相关的正调控因子是ACEII和XYR1，而负调控因子是CRE1和ACEI(Ilme′n et al.,1997,Mol.Gen.Genet.；Foreman etal.,2003,J.Biol.Chem.)。其次，菌体(菌丝)形态也是影响分泌表达的关键因素之一。一般认为，丝状真菌是通过顶端分泌来输出胞外蛋白的。因此，高效分泌菌株形态上往往是多分枝的。
然而从自然界中直接筛选到的木霉菌株产酶水平往往很低，不适合商业生产。因此，如何通过现有技术改造木霉菌株提高其胞外蛋白含量，以降低生产成本就成为本领域的研究热点之一。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种里氏木霉突变菌株及其在产纤维素酶方面的应用。所述突变菌株是通过辐射诱变的方法获得的，能高产纤维素酶，进而有效降低纤维素酶的生产成本，有利于其广泛应用。
本发明一方面提供了一株里氏木霉(Trichoderma reesei)突变菌株LA2-7，已于2014年11月12日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2014564。
本发明还提供了上述里氏木霉突变菌株在纤维素酶生产中的应用。
本发明还提供一种生产纤维素酶的方法，是用上述的里氏木霉突变菌株发酵来制备的；
用于发酵的培养基的组成为葡萄糖15.0g/L、乳糖16.0g/L，玉米浆25.0ml/L，(NH4)2SO4 5.0g/L，MgSO4 1.0g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2 0.4g/L，吐温-80 0.2ml/L，微量元素 0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，NaOH 1.0g/L,pH值5.0。其中微量元素溶液(g/L)的组成为：CuSO4·5H2O0.048mol/L，FeSO4·7H2O 0.18mol/L，CoCl2·6H2O 0.034mol/L，MnCl2·4H2O 0.08mol/L。
本发明利用辐射诱变技术获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株LA2-7，该突变株LA2-7发酵上清液酶活为3282U/mL，比出发菌提高了276％，蛋白含量为12.2g/L，比出发菌提高了237％。此外，突变株LA2-7的菌落明显小于出发菌，且菌丝比出发菌的菌丝粗、短，分枝多，有利于在生产过程中降低发酵菌液的粘度，进而可以降低搅拌速度，提高溶氧，能有效降低生产成本，应用前景广泛。
附图说明
图1：出发菌和突变菌的菌落形态比较，其中：A为出发菌L-10，B为突变菌LA2-7；
图2：出发菌和突变菌的菌丝形态比较，其中：A为出发菌L-10，B为突变菌LA2-7。
具体实施方式
下面结合具体的实施方案对本发明进行更详细的描述。但本发明并不受所述实施例的限制。提供实施方案的目的是为了使说明书全面而透彻，并向本领域的技术人员全面传达发明的范围。除另定义外，本发明所使用的所有技术和科学术语均具有作为本发明所属技术领域中普通技术人员通常理解的同样的含义。
实施例1里氏木霉菌株的诱变筛选
1、菌种处理：
将出发菌株里氏木霉L-10(该菌株是本申请的发明人黄亦钧于2010年从青岛市崂山区林场土壤中筛选到的)接种于PDA琼脂平板(马铃薯200-300克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，自来水1000毫升，自然pH)上，28-30℃恒温培养1周至稳定期。待孢子成熟后，往平板上加入5-10ml无菌水洗刷孢子，吸取孢子悬液并计数，依据孢子含量用调整其浓度至105-6个/ml，然后进行后续诱变处理。
2、核辐射诱变筛选：
取上述孢子悬液50ul加入无菌1.5ml离心管中，共100管，送山东省农科院原子能所进行60Co辐射处理，照射剂量分别为1，2，4kGy。诱变后的悬液经适当稀释涂平板，在28‐37℃下倒置避光培养7‐20天。待平板上呈现肉眼可见的菌落是开始第一次筛选，长出菌落转移到另外的平板划线；最后，挑取菌落形态明显小于出发菌的突变体菌分别接种到PDA琼脂平板。
实施例2高产纤维素酶突变菌株的筛选
1、利用24深孔板筛选：
在24深孔板的孔中各加入3-4ml诱导培养基(诱导培养基(TIM)的组成为葡萄糖15.0g/L、乳糖16.0g/L，玉米浆25.0ml/L，(NH4)2SO45.0g/L，MgSO4 1.0g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2 0.4g/L，吐温-80 0.2ml/L，微量元素0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，NaOH 1.0g/L,pH值5.0。其中微量元素溶液(g/L)的组成为：CuSO4·5H2O 0.048mol/L，FeSO4·7H2O0.18mol/L，CoCl2·6H2O 0.034mol/L，MnCl2·4H2O 0.08mol/L)。然后将实施例1中筛选到的突变株分别接种于各个孔中，置于摇床上，培养方法为发酵温度为28℃，摇床转速为200r/min，培养2天；然后25℃培养2天。培养结束后，分别离心取上清进行酶活检测和SDS-PAGE电泳检测。根据检测结果，筛选出酶活和胞外蛋白含量显著高于出发菌的突变菌共7株，分别命名为LA2-1，LA2-2，LA2-3，LA2-4，LA2-5，LA2-6和LA2-7。
(1)酶活测定的方法：CMC法
(2)测定的原理：纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。
(3)测定过程：取三支试管各加入0.5mlCMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5ml待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5ml的DNS试剂，并在第三支试管中补加0.5ml的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml。以第三支试管液为对照在540nm波长条件下测得第一、二试管液的吸光度。根据预先绘制的标准曲线计算出酶活力值。
(4)酶活力计算：
酶活力(IU/ml或IU/g)＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n
式中：180—葡萄糖从微克换算成微摩尔
15—待测液与底物的反应时间
0.5—加入反应的待测酶液量
n—酶样的稀释倍数
2、摇瓶筛选：
将上述出发菌株L-10和7株突变菌(LA2-1，LA2-2，LA2-3，LA2-4，LA2-5，LA2-6和LA2-7)分别接种于500ml三角瓶中(含50mlTIM诱导培养基)，置于摇床上，28℃，200rpm，培养5-7天。培养结束后，分别离心取上清，进行酶活检测(CMC酶活检测法)和蛋白含量测定(考马斯亮蓝检测法)，结果如表1所示。
菌株 酶活(U/ml) 蛋白含量(mg/L)
L-10(CK) 118.7 279.2
LA2-1 195.6 409.3
LA2-2 152.3 301.5
LA2-3 150.4 298.5
LA2-4 183.1 402.8
LA2-5 155.8 327.3
LA2-6 201.8 423.7
LA2-7 233.1 502.9
从表1的结果可以看出，本发明筛选到的7株突变菌，其中突变菌LA2-7的发酵酶活和胞外蛋白含量最高。与出发菌株L-10相比，LA2-7酶活提高了97.5％，蛋白含量提高了80％，取得了显著的技术效果。
申请人将该突变株命名为里氏木霉LA2-7(Trichoderma reesei LA2-7)，并已于2014年11月12日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2014564。
实施例3突变菌里氏木霉LA2-7的纯化
将里氏木霉LA2-7接种于PDA琼脂平板上，28-30℃恒温培养1周至稳定期。待孢子成熟后，往平板上加入5-10ml无菌水洗刷孢子；然后再次吸取适量孢子悬液涂布于PDA平板，最后将平板至于30℃恒温培养，直至长出单菌落；挑取单菌落，即纯化的突变菌里氏木霉LA2-7，划线接种于PDA平板。同时，以出发菌作为对照组，采用上述同样操作进行培养、纯化，挑取单菌落接种于PDA平板。
在PDA平板上培养1周后，经观察发现，出发菌L-10和突变菌里氏木霉LA2-7的菌落形态和菌丝形态均差异显著。如图1所示，突变菌里氏木霉LA2-7的菌落形态明显小于出发菌L-10；如图2所示，突变菌里氏木霉LA2-7的菌丝比出发菌L10的菌丝短、粗，且分枝多。
实施例4突变菌里氏木霉LA2-7的发酵培养
将出发菌L10和突变菌里氏木霉LA2-7分别接种于相同的摇瓶种子培养基(葡萄糖10-30g/L，土豆100-200g/L)，30℃，200rpm摇床培养48h之后，然后分别将发酵液转入7.5L发酵罐(发酵罐中培养基也相同，配方为：葡萄糖30-50g/L，乳糖2.0-10g/L，玉米浆20-50g/L，硫酸铵10-30g/L，硫酸镁5-10g/L，磷酸二氢钾15-30g/L)，温度均控制在25±1℃，pH值均控制在5.0±0.2，其中出发菌L10的搅拌速度为240rpm，突变菌里氏木霉LA2-7的搅拌速度为200rpm，在发酵罐培养15h之后，开始补加乳糖诱导菌体产酶，发酵时间约为170h，制成发酵菌液。
将上述发酵菌液离心，取上清，进行酶活检测(CMC酶活检测法)和蛋白含量测定(考马斯亮蓝检测法)。结果显示，出发菌的发酵上清液酶活为873U/mL，蛋白含量为3.32g/L，突变菌里氏木霉LA2-7的发酵上清液酶活为3282U/mL，比出发菌提高了276％，蛋白含量为12.2g/L，比出发菌提高了237％。从而说明突变菌LA 2-7不仅能显著提高纤维素酶的产量，且能有效降低发酵过程中的搅拌速度。
综上，本发明利用核辐射诱变技术结合摇瓶筛选，获得的突变菌里氏木霉LA2-7能大幅提高纤维素酶的产量，效果显著；而且其菌丝粗、短、分枝多，有利于在生产过程中降低发酵菌液的粘度，进而可以降低搅拌速度，提高溶氧，能有效降低生产成本，应用前景广泛。

Claims (5)

1.一种里氏木霉，其特征在于，所述的里氏木霉为里氏木霉(Trichoderma reesei)突变菌株LA2-7，其保藏编号为CCTCC NO：M2014564。
2.权利要求1所述的里氏木霉在纤维素酶生产中的应用。
3.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述的方法，是将权利要求1所述的里氏木霉接种到发酵培养基中来发酵生产纤维素酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组成为葡萄糖15.0g/L、乳糖16.0g/L，玉米浆25.0ml/L，(NH4)2SO4 5.0g/L，MgSO4 1.0g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl20.4g/L，吐温-80 0.2ml/L，微量元素0.2ml/L，聚丙二醇-2000 0.2ml/L，NaOH 1.0g/L,pH值5.0。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的微量元素溶液的组成为：CuSO4·5H2O0.048mol/L，FeSO4·7H2O 0.18mol/L，CoCl2·6H2O 0.034mol/L，MnCl2·4H2O 0.08mol/L。
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