CN104263658A - 一种里氏木霉菌株及其应用 - Google Patents

一种里氏木霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)，其保藏号为：CGMCC No.9644。另外，本发明还公开了所述里氏木霉菌株在生产纤维素酶中的应用。本发明所述的里氏木霉菌株具有更强的纤维素酶生产能力，蛋白分泌能力更强，相比于出发菌株，其滤纸酶活最高值提高了13～31％。

Description

一种里氏木霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种里氏木霉菌株及其应用。
背景技术
纤维素是自然界中分布最广、数量最多的的生物质资源，也是最廉价的可再生资源。目前，利用可再生的纤维素资源生产多种生物燃料和生物基产品已成为克服能源危机的有效途径之一。在生产多种生物燃料和生物基产品的流程中，纤维素降解是整个过程至关重要的一步。纤维素的降解方法主要有化学水解法和酶水解法两种。与化学水解法相比，纤维素酶降解纤维素反应条件温和、特异性高、环境友好等特点，因而受到广泛关注。
当前，纤维素酶生产中面临着纤维素酶酶活低、生产周期长、诱导物成本高等瓶颈问题。纤维素酶的生产主要采用液体发酵培养，由于液体发酵过程中涉及的影响因素较多，再考虑到生产菌株本身的特性及诱导物的种类，所以纤维素酶合成过程及其复杂。因此，为了解决这个瓶颈问题，一方面是从菌株本身角度考虑，提高菌株的产纤维素酶的能力；另一方面，通过调控外部的培养条件、添加诱导物等方式提高产酶缩短生产周期。而从上述两个方面来讲，改善菌株的本身生产性能是降低纤维素酶生产成本的根本解决方式。
发明内容
本发明目的在于提供一种高产纤维素酶的里氏木霉菌株。
本发明的另一个目的在于提供里氏木霉菌株在生产纤维素酶的应用。
本发明提供的技术方案为：
一种里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)，其保藏号为：CGMCC No.9644，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年09月09日。
本发明提供所述里氏木霉菌株在生产纤维素酶中的应用。
本发明所述的里氏木霉菌株具有以下的有益效果：本发明所述的里氏木霉菌株具有更强的纤维素酶生产能力，蛋白分泌能力更强，相比于出发菌株，其滤纸酶活最高值提高了13～31％，蛋白含量提高了9～31％。
附图说明
图1为本发明所述的致死率曲线，横坐标为诱变实验的反应时间，单位为分钟(min)，纵坐标为致死率，单位为％；
图2为本发明所述的突变菌株DES1-DES19以及出发菌株Rut C30的滤纸酶活的柱状图，横坐标为菌株编号，纵坐标为滤纸酶活，单位为IU·ml-1；
图3(a)为本发明所述的实施例三中高产菌株DES-15和出发菌株Rut C30在发酵过程中滤纸酶活的变化曲线，横坐标为发酵时间，单位为小时(h)，纵坐标为滤纸酶活，单位为IU·ml-1，图3(b)为本发明所述的实施例三中高产菌株DES-15和出发菌株Rut C30在发酵过程中蛋白含量的变化曲线，横坐标为发酵时间，单位为小时(h)，纵坐标为滤纸酶活，单位为IU·ml-1，图3(a)和图3(b)中，方块代表出发菌株Rut C30，三角形代表高产菌株DES-15；
图4(a)、图4(b)、图4(c)、图4(d)、图4(e)分别代表实施例三中高产菌株DES-15在第1个、第2个、第3个、第4个和第5个时间点的菌丝照片，图4(f)、图4(g)、图4(h)、图4(i)和图4(j)分别代表实施例三中出发菌株Rut C30在第1个、第2个、第3个、第4个和第5个时间点上的菌丝照片，第1个时间点为发酵过程中的第1个24小时，以后每隔24小时取一次样，并拍摄菌丝照片。
生物保藏说明
高产菌株DES-15：分类命名：里氏木霉，(Trichoderma reesei)，保藏号为：CGMCC No.9644，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年09月09日；
出发菌株Rut C30：分类命名：里氏木霉，(Trichoderma reesei)，保藏号为：CICC13052，该菌株购自于中国工业微生物菌种保藏中心。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例一利用出发菌株Rut C30诱变得到高产菌株DES-15
本发明所述的高产菌株DES-15是通过硫酸二乙酯诱变得到的，进行6组诱变实验，6组诱变实验的反应时间分别为5min、10min、20min、30min、40min和50min，其他条件均一致。
诱变实验的具体过程为：将出发菌株Rut C30接于PDA平板中在30℃下培养5-7天，至孢子铺满平板为止。用磷酸缓冲液(pH7.0)冲洗孢子，3层擦镜纸过滤得到孢子悬液，将孢子悬液稀释到106个/ml。将10ml稀释后的孢子悬液中加入0.2ml硫酸二乙酯(简称DES)，室温摇床中反应一定时间(转速为100rpm)，反应结束后加入1ml 25％的硫代硫酸钠终止反应。
将DES处理后的孢子悬液梯度稀释，稀释到10-4、10-5和10-6稀释倍数的孢子悬液100μl涂于PDA平板中，于30℃培养箱中培养，培养结束后，统计6组诱变实验的PDA平板上的菌落数。以接有出发菌株Rut C30的平板为对照组，依据下列公式计算出每组诱变实验的致死率，绘制致死率曲线(如图1所示)，其中反应时间为横坐标，以致死率为纵坐标。致死率的计算公式为：
致死率(％)＝[(对照组菌落数-诱变实验菌落数)/对照组菌落数]×100％。
从图1中可知，随着反应时间的增加，致死率也增加了。当致死率达到80％时，获得正突变菌株的可能性最高。因此，选择致死率为80％，即从第6组诱变实验(反应时间为50min)所得到的突变菌株中进行筛选。
实施例二高产菌株DES-15的筛选
从长出菌落的平板(第6组诱变实验的)随机挑取菌株60株，接于新的PDA平板纯化培养。将随机挑选的60株菌株接入发酵培养基中培养6天后进行滤纸酶活的测定。发酵条件为：26℃，170rpm，初始pH 4.5。发酵培养基成分为：微晶纤维素33g/L，玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，碳酸钙2.5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L。所得发酵液4℃离心，收集上清液进行滤纸酶活测定。图2中最左侧一项表示出发菌株Rut C30的滤纸酶活，另外还展示了菌株DES1-DES19的滤纸酶活，从图2中可知，菌株DES-15为酶活提高最多的菌株，即本发明所述的高产菌株，将其用于后续研究。
实施三出发菌株Rut C30和高产菌株DES-15的酶活比较
分别采用出发菌株Rut C30和高产菌株DES-15进行以下实验，两个菌株的实验条件完全一致。
将菌株的孢子悬液接于种子培养基中，170rpm，30℃培养24h；长好的种子再接于含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为3％。种子培养基成分为：微晶纤维素20g/L，玉米浆干粉17g/L，葡萄糖2g/L。发酵培养基成分与种子培养基成分一致。发酵罐控制条件为：pH 5.0，温度26℃，溶氧30％，压力为0.05Mpa。在一系列的发酵时间点取样，离心收集上清液进行滤纸酶活和蛋白含量测定。由图3(a)和图3(b)可以看出，在整个发酵过程中高产菌株DES-15的滤纸酶活和蛋白含量均高于出发菌株Rut C30，高产菌株DES-15的滤纸酶活最高值出现在124h，出发菌株的滤纸酶活最高值出现在120h。另外，为了进一步说明高产菌株DES-15在生产纤维素酶方面的优越性，还将高产菌株的酶活最高值、蛋白浓度与出发菌株Rut C30的酶活最高值、蛋白浓度进行比较，并计算滤纸酶活提高率(具体数值见表1)和蛋白质含量提高率(具体数值见表2)。
实施例四
分别采用出发菌株Rut C30和高产菌株DES-15进行以下实验，两个菌株的实验条件完全一致。发酵过程中，种子培养基和发酵培养基的成分与实施例三一致。发酵过程中，发酵罐内的pH值控制为4.0，其他条件与实施例三相同。实验显示，整个发酵过程中，高产菌株DES-15的滤纸酶活和蛋白含量均高于出发菌株Rut C30，二者滤纸酶活最高值都出现在124h。将高产菌株的酶活最高值、蛋白浓度与出发菌株Rut C30的酶活最高值、蛋白浓度进行比较，并计算滤纸酶活提高率(具体数值见表1)和蛋白质含量提高率(具体数值见表2)。
实施例五
分别采用出发菌株Rut C30和高产菌株DES-15进行以下实验，两个菌株的实验条件完全一致。种子培养基的成分为：微晶纤维素10g/L，玉米浆干粉17g/L，葡萄糖2g/L；发酵培养基的成分与种子培养基相同。其他发酵条件与实施例三相同。实验显示，整个发酵过程中，高产菌株DES-15的滤纸酶活和蛋白含量均高于出发菌株Rut C30，二者的滤纸酶活最高值都出现在124h。将高产菌株的酶活最高值、蛋白浓度与出发菌株Rut C30的酶活最高值、蛋白浓度进行比较，并计算滤纸酶活提高率(具体数值见表1)和蛋白质含量提高率(具体数值见表2)。
实施例六
分别采用出发菌株Rut C30和高产菌株DES-15进行以下实验，两个菌株的实验条件完全一致。种子培养基的成分为：气爆玉米秸秆30g/l，玉米浆干粉17g/L，葡萄糖2g/L，发酵培养基与种子培养基的成分相同。发酵过程中的其他条件与实施例三相同。实验显示，整个发酵过程中，高产菌株DES-15的滤纸酶活和蛋白含量均高于出发菌株Rut C30，二者的滤纸酶活最高值都出现在124h。将高产菌株的酶活最高值、蛋白浓度与出发菌株Rut C30的酶活最高值、蛋白浓度进行比较，并计算滤纸酶活提高率(具体数值见表1)和蛋白质含量提高率(具体数值见表2)。
实施例七
分别采用出发菌株Rut C30和高产菌株DES-15进行以下实验，两个菌株的实验条件完全一致。种子培养基的成分为：玉米芯30g/l，玉米浆干粉17g/L，葡萄糖2g/L，发酵培养基与种子培养基的成分相同。发酵过程中，其他条件与实施例三相同。实验显示，整个发酵过程中，高产菌株DES-15的滤纸酶活和蛋白含量均高于出发菌株Rut C30，二者的滤纸酶活最高值都出现在124h。将高产菌株的酶活最高值、蛋白浓度与出发菌株Rut C30的酶活最高值、蛋白浓度进行比较，并计算滤纸酶活提高率(具体数值见表1)和蛋白质含量提高率(具体数值见表2)。
表1高产菌株DES-15和出发菌株Rut C30的滤纸酶活的比较
表2高产菌株DES-15和出发菌株Rut C30的蛋白分泌能力的比较
本发明采用滤纸酶活作为纤维素酶活力的测定指标。从表1和表2可知，在上述五个实施例中，高产菌株DES-15的滤纸酶活最高值以及蛋白含量最高值都比出发菌株Rut C30高，可以证明高产菌株DES-15比出发菌株Rut C30的纤维素酶生产能力更强。
实施例八高产菌株DES-15的形态学分析
分别取实施三中的高产菌株DES-15和出发菌株Rut C-30的菌丝样品，比较高产菌株DES-15和出发菌株Rut C-30的形态学特征。
对高产菌株DES-15和出发菌株Rut C-30的菌丝样品的处理和观察方法均一致。从发酵罐中取不同发酵时间的菌丝样品，从第1个24h开始，每间隔24h取一个菌丝样品，共取5个菌丝样品。将菌丝样品吸取10μl至1ml水中稀释，取出稀释后的菌丝样品10μl置于载玻片上，观察菌丝形态并拍照记录。对不同视野的菌丝随机取样，统计菌丝长度、直径、菌丝分枝以及菌丝顶端数。
图4(a)、图4(b)、图4(c)、图4(d)、图4(e)分别代表高产菌株DES-15在第1个、第2个、第3个、第4个和第5个时间点的菌丝照片，图4(f)、图4(g)、图4(h)、图4(i)和图4(j)分别代表出发菌株Rut C30在第1个、第2个、第3个、第4个和第5个时间点上的菌丝照片。将在相同时间点的高产菌株DES-15和出发菌株Rut C30的菌丝照片进行比较，即，图4(a)和图4(f)为一组进行比较，图4(b)和图4(g)为一组，图4(c)和图4(h)为一组，图4(d)和图4(i)为一组，图4(e)和图4(j)为一组。图4(d)和图4(i)中箭头所指示的就是菌丝的顶端，从各组比较的结果可知，在不同的发酵阶段，高产菌株DES-15的菌丝分枝数和顶端数均高于出发菌株Rut C30(各图中的菌丝分枝数和顶端数见表3)，而菌丝长度要短于出发菌株Rut C30。蛋白的分泌主要来自于菌丝顶端，菌丝的分枝数越多，越利于蛋白的分泌。从本实施例也可以确定高产菌株DES-15比出发菌株Rut C30在生产纤维素酶具有更优异的效果，产量更高。
表3高产菌株DES-15和出发菌株Rut C30的菌丝分枝数和顶端数的比较
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (2)

1.一种里氏木霉菌株(Trichoderma reesei)，其保藏号为：CGMCCNo.9644。
2.如权利要求1所述的里氏木霉菌株在生产纤维素酶中的应用。
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