CN111876335A

CN111876335A - 一种可降解纤维素的真菌及其分离方法和应用

Info

Publication number: CN111876335A
Application number: CN202010762766.9A
Authority: CN
Inventors: 周涛; 贺文俪; 贺亮; 周韵娴; 张馨予
Original assignee: Shenzhen Shunsheng Agricultural Technology Development Co ltd
Current assignee: Shenzhen Shunsheng Agricultural Technology Development Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明适用于微生物工程技术领域，提供了一种可降解纤维素的真菌及其分离方法和应用，该真菌命名为里氏木霉LS‑1，其保藏号为CCTCC NO:M 2020220。另外，该真菌的ITS序列如序列表SEQ ID NO:1所示。该真菌具有较强的降解纤维素的能力，有望在纤维素类农业废弃物的降解中进一步发挥作用。尤其是，该真菌具有较强的降解小麦秸秆的能力，故有望在秸秆类农业废弃物的处理中发挥作用。

Description

一种可降解纤维素的真菌及其分离方法和应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种可降解纤维素的真菌及其分离方法和应用。

背景技术

随着我国农业的蓬勃发展，给环境带来的压力也随之而来，大量的农业废弃物(如秸秆、麸皮等)没有得到正确的处理，此类农业废弃物中大多含有纤维素、半纤维素、木质素等，传统农业中对于纤维素类废弃物的处理方法即为焚烧或弃置不管，造成了极其严重的环境污染和资源浪费，也违背了我国可持续发展的发展理念，不利于建设资源节约型、环境友好型社会。因此，发明新型的、环保的处理农业废弃物的方法是我国农业继续蓬勃发展的重要保障。此时，可以降解纤维素的微生物进入了科学家的眼中，其降解纤维素效率高、污染少、来源广的特点使其迅速被接受并广泛应用。因此，新的、高效的纤维素降解微生物具有广阔的应用价值。

微生物对于纤维素的降解主要是依赖产生纤维素酶发挥作用，而纤维素酶主要是由细菌和丝状真菌产生，但细菌产生的纤维素酶量较低，且主要是葡聚糖内切酶，多数无法分解结晶纤维素。相反的，真菌产的纤维素酶产量较大，且有多种酶活性。因此，筛选具有纤维素降解功能的真菌是一个有很大发展前途的选择。

目前，已经发现的可降解纤维素的真菌大多来自于土壤或植物，而从昆虫共生菌角度发现的可降解纤维素的真菌还比较少。昆虫共生菌与其寄生的昆虫长期保持着互利共生的关系，是一类特殊生境的微生物。昆虫物种的多样性、栖息环境的复杂性、摄食对象的广泛性赋予了其复杂多样却又独特的肠道微生物菌群，昆虫肠道微生物在帮助昆虫消化食物和抵抗病原菌入侵等方面发挥着重要的作用，而此类特殊生境的微生物资源尚未得到充分的开发。因此，从昆虫肠道内分离可降解纤维素的真菌具有广阔的前景。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种可降解纤维素的真菌，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种可降解纤维素的真菌，其命名为里氏木霉LS-1(Trichoderma reesei LS-1)，其保藏号为CCTCC NO:M 2020220，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年6月18日，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述真菌的ITS序列如序列表SEQ I D NO:1所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述真菌的分离方法，其包括以下步骤：

取天牛幼虫的肠道部分；所述天牛幼虫来源于枯死的赤松的树干；

将天牛幼虫的肠道部分置于含有无淀粉滤纸条的富集培养基中进行培养，得到富集培养液；

从富集培养液中吸取上清液，并分别涂布于PDA培养基和MEA培养基上进行培养，然后挑取单菌落纯化，分离得到所述真菌。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述富集培养基包括以下组分：无淀粉滤纸条0.4～0.6g、NKNO₃ 0.4～0.6g、NaCl 0.4～0.6g、K₂HPO₄ 0.8～1.2g， MgSO₄·7H₂O0.4～0.6g。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述PDA培养基包括以下组分：马铃薯提取液600～800mL、葡萄糖15～25g、琼脂15～25g；所述马铃薯提取液是通过将去皮马铃薯与水进行混合后，再经煮沸和过滤制得。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述MEA培养基包括以下组分：麦芽15～25g、蔗糖15～25g、琼脂15～25g、蛋白胨0.8～1.2g。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述真菌在降解纤维素中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述真菌在降解秸秆中的应用。

天牛是鞘翅目多食亚目天牛科昆虫的总称，是严重危害我国林业发展的杀手之一，给我国林业产业带来了巨大的经济损失。天牛在山东省的沿海地区广泛存在，是松属植物(如：黑松、赤松等)严重的蛀干害虫，天牛幼虫钻蛀黑松、赤松等寄主根部、树皮、树干，大量的幼虫造成松树腐烂，最终导致了松树的死亡，目前在山东多个地区引发广泛的病虫害，对森林资源存在着严重的威胁。松属植物树皮、树干中，40％～50％的成分为纤维素，因而，天牛幼虫在蛀食树干后摄入的主要是纤维素，但纤维素并无法在肠道中被吸收直接用于其生长发育，而是在肠道中将纤维素转变为可利用的物质(如：葡萄糖等)才能进行进一步利用，故猜测，天牛幼虫肠道中存在着可以降解纤维素的共生的微生物，将天牛幼虫摄入的纤维素转化为葡萄糖等可以被吸收利用的营养物质，供其生长发育。

本发明实施例提供的一种可降解纤维素的真菌，该真菌命名为里氏木霉LS -1(Trichoderma reesei LS-1)，其具有较强的降解纤维素的能力，有望在纤维素类农业废弃物的降解中进一步发挥作用。尤其是，该真菌具有较强的降解小麦秸秆的能力，故有望在秸秆类农业废弃物的处理中发挥作用。

附图说明

图1为本发明实施例分离得到的真菌LS-1在PDA培养基上的生长情况。

图2～3为本发明实施例分离得到的真菌LS-1的菌丝及孢子显微镜照片(40 倍)。

图4为本发明实施例分离得到的真菌LS-1在rDNA内转录间隔区(ITS) 系统发育树中的位置图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种可降解纤维素的真菌的分离方法，其包括以下步骤：

S1、样品的采集与处理：

在本发明实施例中，样品为天牛幼虫，采集于山东省威海市山东大学(威海)校园内的枯死的赤松树干内。对于天牛幼虫样品的处理如下：

1、将采集到的天牛幼虫用10mL无菌水清洗两次，洗去幼虫体表的木屑及其它附着物杂质，用高温灭菌的滤纸吸去幼虫体表残留的水渍。

2、用10mL的70％的乙醇再次清洗幼虫，将幼虫浸泡于70％的乙醇中，并用玻璃棒缓慢搅拌，洗涤1.5min后将幼虫取出，用高温灭菌的滤纸吸去其表面残留的乙醇。

3、用10mL的3.0％的新鲜次氯酸钠溶液洗涤幼虫30s，用高温灭菌的滤纸吸去幼虫体表残余水分。

4、用10mL的无菌水清洗幼虫3次，用高温灭菌的滤纸吸去幼虫体表残余水分。将洗净后的幼虫放置于无菌的培养皿中。

5、将灭菌的解剖刀在酒精灯火焰上反复灼烧3次，冷却后，将天牛幼虫解剖，取其肠道部分至灭菌的研钵内，备用。

S2、真菌的富集、分离、纯化与初筛：

1、向上述含有天牛幼虫肠道部分的研钵中加入3mL已灭菌的生理盐水，用研磨棒充分研磨，使之混匀，静置、沉淀，备用。

2、从上述研钵中取上清液1mL接入盛有100mL富集培养基(配制方法：将无淀粉滤纸条0.5g，NKNO₃ 0.5g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，加水定容至1000mL，控制其pH为7.0)的锥形瓶中，放置于恒温摇床中，28℃， 160r/min培养，每间隔24小时观察培养基中滤纸条崩解情况。

3、样品富集培养7天后，选择滤纸条崩解程度较高、崩解速度较快的锥形瓶，在其中取1mL菌液，加入9mL无菌水中，稀释为10^-1梯度，按照此方法继续依次稀释10^-2、10^-3、10^-4浓度，从各个浓度中吸取0.2mL，分别涂布于已添加抑菌剂(萘啶酮酸)的PDA培养基(配制方法：将去皮马铃薯200g，加水1000mL，煮沸25min，用两层纱布滤去马铃薯残渣，向700mL滤液中加入20g葡萄糖， 20g琼脂，加水定容至1000mL，并控制其pH为7.0)和MEA培养基(配制方法：将麦芽20g，蔗糖20g，琼脂20g，蛋白胨1g，加水定容至1000mL，并控制其pH为7.0)上，每种培养基、每个梯度各2个平行，28℃恒温培养箱中倒置培养。

4、每隔24小时观察培养基上菌落生长情况，待有菌落长出后，用接菌环从菌落的边缘挑取少量菌丝，转接于新的PDA培养基上，反复纯化3次，获得 1株纯培养真菌菌株。

5、将分离得到的真菌用6mm直径的打孔器取菌块，转接于刚果红纤维素培养基(配制方法：将刚果红0.2g，纤维素2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，K₂HPO₄ 0.5g，明胶2.0g，琼脂16g，加水定容至1000mL，并控制其pH为7.0)中心处，放置于28℃恒温培养箱培养，每天观察真菌菌落生长状况，若培养基出现透明圈即可初步认定为该种真菌具有降解纤维素的能力。每天观察真菌的生长以及透明圈的出现时间和大小，培养7天，可以根据培养基出现的透明圈的时间和透明圈大小与真菌大小的比例初步判断真菌纤维素降解能力的大小。

6、将分离得到的纯培养真菌菌株打孔，接种于保藏培养基(PDA培养基) 中心，放置于28℃恒温培养箱培养3天，使其铺满整个平板，观察菌株的形态，将保种的平板放置于冰箱4℃保存。

S3、真菌的鉴定：

1、形态学鉴定

通过观察上述分离得到的真菌菌落的形态、颜色，菌丝的形态、繁殖方式、孢子形状等形态学特征，依此来初步判断菌株的种类；其中，该真菌在PDA培养基上的生长情况如附图1所示，其菌丝及孢子显微镜照片(40倍)如附图2～ 3所示。

2、分子生物学鉴定

将上述分离得到的真菌纯化好的平板用封口胶密封，寄送至生工生物工程 (上海)股份有限公司，测定其rDNA内转录间隔区(ITS)序列，采用引物I TS：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(如序列表SEQ ID NO:2所示)， ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(如序列表SEQ ID NO:3所示)，对真菌LS-1的ITS序列进行扩增。测序拼接结果如序列表SEQ ID NO:1所示，具体如下：

TGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAAC ATTTCAGAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGT GCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACT GTATTTCGGGGGCGGCCCGGTGAGGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCC GGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGA ATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTC TGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGA ACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCT AGGGTCGCCGAGAAAGGCTCAGAGCAAAGGTAAAACAGAGCCGCGACG GAAGCCGCGACGGAGAGAAAAAAGAGTTTGAGTTGGTCCTCCGGCGGGC GCCATGGGATCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCAGAGAATCCCGCCGA GGCAACAGATTGGTAACGTTCACATTGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGG TAATGATCCCTCCGC。

在GenBank中选取部分相似度较高，比较有代表性的菌株的基因序列，使用MEGA6.0软件对ITS序列构建系统发育树，采用邻接法建树，如附图4所示。从构建的系统发育树上可以看出，上述分离得到的真菌与已知真菌Trichoderma reesei(NR_138453.1)的相似度为100％，故分离得到的真菌为木霉菌属里氏木霉，将其命名为：Trichodermareesei LS-1(里氏木霉LS-1)。同时，将该真菌于2020年6月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO: M 2020220，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

需要说明的是，上述分离方法中所采用的各种培养基的配方可以根据实际情况进行调整，并不限于此。

譬如，富集培养基可以通过将无淀粉滤纸条0.4g、NKNO₃ 0.4g、NaCl 0.4 g、K₂HPO₄0.8g，MgSO₄·7H₂O 0.4g混合后，再用无菌水定容至1000mL配制而成；富集培养基也可以通过将无淀粉滤纸条0.6g、NKNO₃ 0.6g、NaCl 0.6g、 K₂HPO₄ 1.2g，MgSO₄·7H₂O 0.6g混合后，再用无菌水定容至1000mL配制而成，但不限于此。

PDA培养基可以通过将200g去皮马铃薯与1000mL水进行混合煮沸20min 后，再经过滤，取800mL滤液与葡萄糖15g、琼脂15g混合，并用无菌水定容至1000mL配制而成；PDA培养基也可以通过将200g去皮马铃薯与1000mL水进行混合煮沸30min后，再经过滤，取600mL滤液与葡萄糖25g、琼脂25g混合，并用无菌水定容至1000mL配制而成，但不限于此。

MEA培养基可以通过将麦芽15g、蔗糖15g、琼脂15g、蛋白胨0.8g混合后，再用无菌水定容至1000mL配制而成；MEA培养基也可以通过将麦芽25g、蔗糖25g、琼脂25g、蛋白胨1.2g混合后，再用无菌水定容至1000mL配制而成，但不限于此。

实施例2

该实施例是对上述分离得到的真菌LS-1的纤维素酶活力进行测定，测定方法采用的是DNS法，具体包括以下步骤：

S1、将真菌LS-1接种于PDA培养基上，倒置培养3天，待长出孢子后，用解剖刀在培养基上切出1cm见方的菌块，将菌块接种于盛有250mL发酵培养基(PDB培养基)的锥形瓶中，放置于恒温摇床中，28℃，160r/min培养，发酵7天。将发酵液过滤，4℃条件下，4500r/min离心20min，取其上清液即为粗酶液，放置于4℃条件下备用。

S2、绘制葡萄糖标准曲线。取6只试管，分别编号1～6号，依次向其中加入标准葡萄糖溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，加入蒸馏水稀释至2mL，再各加入DNS显色液2mL，沸水浴中准确煮沸5min，用自来水冷却至室温，在540nm波长处测定每只试管的吸光度，以1号试管调零。以标准葡萄糖含量为横坐标，540nm波长下的吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线，拟合线性回归方程。

S3、取4只试管，分别编号1、2、3、4，1号管为对照管，2、3、4号管为平行对照，将提取的粗酶液从4℃中取出，放置于室温下使其恢复活力，再放入 50℃的水浴锅中预热2min，向4只试管中各加入1mL的粗酶液，然后向2、3、 4号试管中各加入5mL的底物溶液(配制方法：将0.5g羧甲基纤维素钠溶于10 0ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，控制其pH为4.8，加热溶解)，50℃水浴锅中恒温水浴60min后冷却至室温，分别向4只试管中加入2mL DNS显色液(配制方法：准确称取80.53g酒石酸钠，溶于500mL蒸馏水中，加热，趁热向溶液中依次加入由3，5-二硝基水杨酸(DNS)2.79g，NaOH 5.21g配制为2mol/L的溶液，苯酚2.00mL，无水亚硫酸氢钠2.18g，在45℃水浴中缓慢加入并不停地搅拌，始终保持溶液的温度低于48℃，待固体全部溶解后，加入蒸馏水定容至500mL，储存在棕色瓶中，避光保存，室温下放置7天后使用)，摇匀后沸水浴中准确煮沸5min，用自来水冷却至室温后，加蒸馏水定容至10mL，在540nm波长条件下测定各只试管的OD值，对照葡萄糖标准曲线，计算得每只试管中葡萄糖的浓度。酶活力单位即定义为：在温度为50℃，pH值为4.8条件下，每毫升粗酶液每分钟产生1mg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。U＝葡萄糖浓度(g/L)*稀释倍数/反应时间。结果表明，真菌LS-1发酵7天的酶活力4 36U。由此可以说明，本发明实施例分离得到的真菌LS-1具有较强的降解纤维素的能力，有望在纤维素类农业废弃物的降解中进一步发挥作用。

实施例3

该实施例是对上述分离得到的真菌LS-1降解小麦秸秆的能力进行测定，具体包括以下步骤：

提前准备好真菌LS-1的种子液，转接到以小麦秸秆为唯一碳源的秸秆液体培养基(配制方法：将小麦秸秆粉末20g，NH₄NO₃ 1.0g，蛋白胨1.0g，MgSO₄.7 H₂O 0.5g，KH₂PO₄1.0g，加水定容至1000mL，并控制为pH为7.0)中，每2 50mL秸秆液体培养基接种2mL真菌LS-1的种子液，置于28℃、160r/min恒温摇床中培养7天，用尼龙网过滤培养基并反复用大量的蒸馏水冲洗，将培养基中可溶性成分全部洗净，60℃条件下干燥至恒重，称重，通过测定发酵培养7 天后的重量的差异，计算得到真菌LS-1对于小麦秸秆的降解率R％(以小麦秸秆的失重率计)。其中，降解率R％＝(初始小麦秸秆的质量-烘干后剩余培养基质量)/初始小麦秸秆的质量。通过7天的培养，最终计算得真菌LS-1对于小麦秸秆的降解率(失重率)约为32.54％。由此表明，本发明实施例分离得到的真菌LS-1具有较强的降解小麦秸秆的能力，有望在秸秆类农业废弃物的处理中发挥作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市顺盛农业科技发展有限公司

<120> 一种可降解纤维素的真菌及其分离方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 607

<212> DNA

<213> 木霉菌(Trichoderma sp.)

<400> 1

tgatatgctt aagttcagcg ggtattccta cctgatccga ggtcaacatt tcagagtttg 60

gggtgtttta cggctgtggc cgcgccgcgc tcccggtgcg agtgtgcaaa ctactgcgca 120

ggagaggctg cggcgagacc gccactgtat ttcgggggcg gcccggtgag gggccgatcc 180

ccaacgccga ccccccggag gggttcgagg gttgaaatga cgctcggaca ggcatgcccg 240

ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg aattctgcaa 300

ttcacattac ttatcgcatt tcgctgcgtt cttcatcgat gccagaacca agagatccgt 360

tgttgaaagt tttgattcat tttcgagacg cccgctaggg tcgccgagaa aggctcagag 420

caaaggtaaa acagagccgc gacggaagcc gcgacggaga gaaaaaagag tttgagttgg 480

tcctccggcg ggcgccatgg gatccggggc tgcgacgcgc ccggggcaga gaatcccgcc 540

gaggcaacag attggtaacg ttcacattgg ggtttgggag ttgtaaactc ggtaatgatc 600

cctccgc 607

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种可降解纤维素的真菌，其特征在于，所述真菌命名为里氏木霉LS-1，其保藏号为CCTCC NO:M 2020220。

2.根据权利要求1所述的一种可降解纤维素的真菌，其特征在于，所述真菌的ITS序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

3.一种如权利要求1或2所述真菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种真菌的分离方法，其特征在于，每升所述富集培养基包括以下组分：无淀粉滤纸条0.4～0.6g、NKNO₃ 0.4～0.6g、NaCl 0.4～0.6g、K₂HPO₄ 0.8～1.2g，MgSO₄·7H₂O 0.4～0.6g。

5.根据权利要求3所述的一种真菌的分离方法，其特征在于，每升所述PDA培养基包括以下组分：马铃薯提取液600～800mL、葡萄糖15～25g、琼脂15～25g；所述马铃薯提取液是通过将去皮马铃薯与水进行混合后，再经煮沸和过滤制得。

6.根据权利要求3所述的一种真菌的分离方法，其特征在于，每升所述MEA培养基包括以下组分：麦芽15～25g、蔗糖15～25g、琼脂15～25g、蛋白胨0.8～1.2g。

7.一种如权利要求1或2所述真菌在降解纤维素中的应用。

8.一种如权利要求1或2所述真菌在降解秸秆中的应用。