CN108456712A - 一种玉米大斑病高效抗病鉴定接种体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种玉米大斑病高效抗病鉴定接种体及其制备方法，接种体由以下原料组成：小麦100g、甘露醇2.0～3.0g、玉米叶10～25g，制备步骤包括：1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选；2）玉米大斑病强致病力菌株的保存；3）二级菌种的配制；4）接种体的配制；5）接种体的培养。本发明具有以下优点：获得用于玉米大斑病抗病性鉴定的菌株为强致病力、高纯度、高活力的菌株，为玉米抗病性鉴定的准确性和高效性提供保障；工作效率比平板培养基极大提高；避免小昆虫及杂菌的感染，获得高质量接种体成品；接种体的营养及其培养条件利于玉米大斑病菌分生孢子的产生，产孢速度快、产孢量大，产孢期长。

Description

一种玉米大斑病高效抗病鉴定接种体及其制备方法
技术领域
本发明属于植物病原真菌研究技术领域，具体涉及一种玉米大斑病高效抗病鉴定接种体及其制备方法。
背景技术
玉米大斑病（Northern Corn Leaf Blight)是玉米的一种重要叶部病害。1876年玉米大斑病在意大利首次发现，目前已成为世界性流传病害之一，在我国各地也普遍发生，大斑病的流行，造成玉米植株早衰，雌穗秃尖，普遍给玉米生产造成较大损失，严重地块产量下降30%～50%，甚至更多。目前防治该病害主要以种植抗病品种为主，科学合理品种布局，减少初侵染源，化学防治等综合技术措施。利用抗病种质资源，选育和种植抗病品种是控制玉米大斑病流行的主要有效措施，在抗病品种的选育与利用过程中,抗病性鉴定已成为玉米育种及其区域适应性的一个常规工作，而获得大量玉米大斑病菌分生孢子，或带大量分生孢子的接种体是该工作顺利进行的基础条件。
实验中通常采用高粱粒组织培养基来培养玉米大斑病分生孢子，方法为将培养基平板培养的病菌接种于经高压灭菌的高粱上，培养5～7d菌丝长满高粱粒后，用清水洗刷掉籽粒表面菌丝，转放到方盘类器具内再进行室温黑暗培养；待产孢后即可进行玉米抗病鉴定接种。该方法通常能制备的分生孢子量较少，在瓷盘中开放产孢，极易造成杂菌污染、滋长小昆虫。石妞妞，杜宜新，陈福如等人发明“一种玉米大斑病菌产孢培养基及其应用”（申请号：CN201610567969.6），用该方法培养即产生大量形态一致、成熟度一致的分生孢子。但该方法还是利用平板培养基进行产孢，其产孢、取孢操作过程繁琐，不利于大量分生孢子的获取，不便于进行大面积抗病鉴定操作，不能用带病菌培养基进行接种。
在抗病鉴定试验中，通常采用随机分离得到的玉米大斑病菌作为供试菌株，但有时采用的菌株致病力不强，对抗病鉴定效果不理想；在病菌分离过程中，常采用稀释法进行单孢分离，不能确定是否得到单细胞纯菌株。在病菌的保存中，常采用PDA培养基进行培养后保存，但因PDA培养基营养较高，病菌生长旺盛，保存后菌株的活力容易衰退。采用标记法进行单细胞分离，经致病力鉴定筛选菌株，用低营养培养基作为菌株保存基质，是保证菌株纯度、致病力及活力的保障。
因此，寻找一种无污染、分生孢子量大、致病力强、成本低且制备过程操作简单、可以用带病菌组织进行接种的接种体及其培养方法，对开展大面积玉米大斑病抗病性接种鉴定具有重要意义。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种快速、大量制备玉米大斑病高效抗病鉴定接种体及其方法。
为实现上述目的，本发明玉米大斑病高效抗病鉴定接种体，接种体由以下重量比的原料组成：小麦100g、甘露醇2.0～3.0g、玉米叶10～25g。
进一步地，所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，步骤如下：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株；
2）玉米大斑病强致病力菌株的保存，把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存；
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基中在24～26℃培养6～7d，即得二级菌种；
4）接种体的配制，按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度，配好的培养基装入三角瓶中，以不超过培养瓶二分之一的空间为度，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定，经过121帕高压灭菌45～100min备用；
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～10g二级菌种，在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7～8d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养6～8d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
优选地，所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，所述步骤1）单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤为：在培养皿中倒入10ml薄层PDA培养基，把稀释好的孢子悬浮液布满在培养基上，孢子悬浮液在100倍镜下每视野1～2个孢子的浓度，用封口薄膜把培养皿套口封上，移入26～30℃的培养箱进行培养8～10h；用低倍镜从培养皿反面检查，挑选在视野内只有1个已经萌发的孢子，且其附近没有其它孢子或菌丝存在，用记号笔对着孢子存在的位置在培养皿反面画上一个小点作记号，培养皿继续放在24～26℃的培养箱进行培养3～5d，标记处的孢子长出的菌落即为该病菌的单细胞菌落。
优选地，所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，所述步骤2）中，PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
优选地，所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，所述步骤4）按配方配制原料前，对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。
进一步地，所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，采用带菌接种体接种法，所述具体步骤为：在玉米10～13叶时，把培养好的接种体接种于玉米心叶内，每株接种2～4g菌粒，接种后田间保湿7d，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。
进一步地，所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，采用菌液灌心接种法，所述具体步骤为：把培养好的接种体用加有Tween-20的2%蔗糖溶液洗涤，Tween-20的浓度为0.01%，制成浓度为3×107个孢子/mL 的分生孢子悬浮液，在玉米第10～13叶时用移液枪将菌悬液接种至玉米心叶内，3mL/株，接种前先进行田间浇灌，接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。
进一步地，所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，采用孢子悬浮液喷雾法，所述具体步骤为：把培养好的接种体加水淘洗，纱布过滤，加0.01% 吐温(v/v)配制成孢子悬浮液，悬浮液中分生孢子浓度调至1×105～3×105个孢子/mL，在玉米第10～13叶时将孢子悬浮液对玉米植株进行喷雾接种，每株喷雾7～10ml菌液，接种前先进行田间浇灌，接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。
本发明的实质性特点和显著进步是：
本发明的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体及其制备方法具有以下优点：
（1）分别以甘露醇为碳源，小麦粒中的维生素调节微生物正常代谢，加入的玉米叶促进了玉米大斑病菌的产孢，接种体配方合理有效提高产孢量。
（2）采用标记法进行菌株的单细胞纯化、通过玉米大斑病强致病力菌株的筛选、并用低营养培养基对菌种进行保存，获得用于玉米大斑病抗病性鉴定的菌株为强致病力、高纯度、高活力的菌株，为玉米抗病性鉴定的准确性和高效性提供保障。
（3）用高粱粒作二级菌种培养基，工作效率比平板培养基极大提高。菌种接种到接种体中容易混合均匀，加快接种体菌丝的生长，产孢速度加快。
（4）接种体全程在有盖的三角瓶中进行培养，避免小昆虫及杂菌的感染，获得高质量的接种体成品。
（5）培养期间无需常规制备技术所需要的清水清洗、瓷盘开放产孢，操作技术简单。
（6）接种体的营养及其培养条件利于玉米大斑病菌分生孢子的产生，产孢速度快、产孢量大，产孢期长。
（7）接种体收集孢子比平板培养基收集孢子的操作更为方便、快速、高效。
（8）培养好的接种体能随意放置一段时间而不受污染，并保持产孢状态，便于与需要接种体的工作程序衔接。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，步骤如下：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株，得到高纯度、强致病力、高活力菌株HD12。
其中，单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤为：在培养皿中倒入10ml薄层PDA培养基，把稀释好的孢子悬浮液布满在培养基上，孢子悬浮液在100倍镜下每视野1～2个孢子的浓度，用封口薄膜把培养皿套口封上，移入26～30℃的培养箱进行培养8～10h；用低倍镜从培养皿反面检查，挑选在视野内只有1个已经萌发的孢子，且其附近没有其它孢子或菌丝存在，用记号笔对着孢子存在的位置在培养皿反面画上一个小点作记号，培养皿继续放在24～26℃的培养箱进行培养3～5d，标记处的孢子长出的菌落即为该病菌的单细胞菌落。
2）把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存。其中PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基，24℃培养6d，即得二级菌种。
4）接种体的配制，接种体由以下重量比的原料配方组成：小麦100g、甘露醇2.0g、玉米叶10g。对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度。配好的培养基装入三角瓶中，250ml三角瓶每瓶装100g培养基，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定。配好的培养基，经过121帕高压灭菌50min备用。
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种7～10g二级菌种。在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养7d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
培养好接种体5g加入25mL的无菌水，用木棒将接种体进行充分的搅拌，用血球计数板统计产孢量，其产孢量为3.8×105个/g；将浓度为100倍显微镜下每视野60～80个分生孢子悬浮液10mL，加在装有20%水琼脂平板的9cm培养皿中，于24℃光照条件下培养7h，100倍显微镜下观察，孢子萌发率为92.5%。本发明的接种培养基收集孢子比平板培养基收集孢子的操作更为方便、快速、高效，而且产孢速度快、产孢量大，产孢期长。
实施例2
玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，步骤如下：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株，得到高纯度、强致病力、高活力菌株HD12。
其中，单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤同实施例1。
2）把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存。其中PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基，26℃培养7d，即得二级菌种。
4）接种体的配制，接种体由以下重量比的原料配方组成：小麦100g、甘露醇2.5g、玉米叶25g。对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度。配好的培养基装入三角瓶中，250ml三角瓶每瓶装100g培养基，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定。配好的培养基，经过121帕高压灭菌50min备用。
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～6g二级菌种。在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养8d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养7d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
培养好接种体5g加入25mL的无菌水，用木棒将接种体进行充分的搅拌，用血球计数板统计产孢量，其产孢量为5.1×105个/g；将浓度为100倍显微镜下每视野60～80个分生孢子悬浮液10mL，加在装有20%水琼脂平板的9cm培养皿中，于24℃光照条件下培养7h，100倍显微镜下观察，孢子萌发率为94.7%。本发明的接种培养基收集孢子比平板培养基收集孢子的操作更为方便、快速、高效，而且产孢速度快、产孢量大，产孢期长。
实施例3
玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，步骤如下：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株，得到高纯度、强致病力、高活力菌株HD12。
其中，单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤同实施例1。
2）把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存。其中PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基，26℃培养7d，即得二级菌种。
4）接种体的配制，接种体由以下重量比的原料配方组成：小麦100g、甘露醇3.0g、玉米叶25g。对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度。配好的培养基装入三角瓶中，250ml三角瓶每瓶装100g培养基，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定。配好的培养基，经过121帕高压灭菌50min备用。
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～6g二级菌种。在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养7d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
培养好接种体5g加入25mL的无菌水，用木棒将接种体进行充分的搅拌，用血球计数板统计产孢量，其产孢量为3.9×105个/g；将将浓度为100倍显微镜下每视野60～80个分生孢子悬浮液10mL，加在装有20%水琼脂平板的9cm养皿中，于24℃光照条件下培养7h，100倍显微镜下观察，孢子萌发率为94.5%。本发明的接种培养基收集孢子比平板培养基收集孢子的操作更为方便、快速、高效，而且产孢速度快、产孢量大，产孢期长。
实施例4：
进行对照试验，接种体的制备方法步骤如下：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株，得到高纯度、强致病力、高活力菌株HD12。
2）把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存。其中PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基，26℃培养7d，即得二级菌种。
4）接种体的配制，接种体由以下重量比的原料配方组成：高粱100g。对原料高粱进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮高粱粒水煮25min，水洗沥干备用；把煮好的高粱粒培养基装入三角瓶中，250ml三角瓶每瓶装100g培养基，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定。配好的培养基，经过121帕高压灭菌50min备用。
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种培养基上，每100g培养基接种5～6g二级菌种。在20℃条件下光暗交替各12 h，光照强度为2000lx条件下对其进行培养14d, 菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住。菌瓶放在原培养箱继续培养7d即可得到接种体。
培养好接种体5g加入25mL的无菌水，用木棒将接种体进行充分的搅拌，用血球计数板统计产孢量，其产孢量为2.3×104个/g；将浓度为100倍显微镜下每视野60～80个分生孢子悬浮液10mL，加在装有20%水琼脂平板的9cm培养皿中，于24℃光照条件下培养7h，100倍显微镜下观察，孢子萌发率为91.2%。
对照试验培养基的产孢量、孢子萌发率等明显不如实施例1、2、3。
实施例5：
玉米大斑病菌接种体在玉米抗病性鉴定中的应用：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株，得到高纯度、强致病力、高活力菌株HD12。
其中，单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤同实施例1。
2）把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存。其中PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基，26℃培养7d，即得二级菌种。
4）接种体的配制，接种体由以下重量比的原料配方组成：小麦100g、甘露醇2.5g、玉米叶25g。对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度。配好的培养基装入三角瓶中，250ml三角瓶每瓶装100g培养基，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定。配好的培养基，经过121帕高压灭菌50min备用。
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～6g二级菌种。在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养7d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
6）玉米大斑病菌接种体在玉米抗病性鉴定中的应用：带菌接种体接种。分别于2016和2017年春对76份外引玉米种质资源进行抗病性鉴定,用玉米自交系获白做对照，在玉米11～12叶的大喇叭口期，把培养好的接种体放入玉米喇叭口中，每株接种2～4g菌粒，接种后田间保湿7d。在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，病情分级标准参照中国人民共和国农业行业标准，玉米抗病虫性鉴定技术规范，NY/T1248.2—2006。两次试验结果自交系获白病情指数均达到其相应感病程度9级，抗病鉴定结果有效，76份外引玉米种质资源两次抗病鉴定结果基本一致。
实施例6：
玉米大斑病菌接种体在玉米抗病性鉴定中的应用：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株，得到高纯度、强致病力、高活力菌株HD12。
其中，单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤同实施例1。
2）把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存。其中PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基，26℃培养7d，即得二级菌种。
4）接种体的配制，接种体由以下重量比的原料配方组成：小麦100g、甘露醇2.5g、玉米叶25g。对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度。配好的培养基装入三角瓶中，250ml三角瓶每瓶装100g培养基，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定。配好的培养基，经过121帕高压灭菌50min备用。
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～6g二级菌种。在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养7d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
6）玉米大斑病菌接种体在玉米抗病性鉴定中的应用：菌液灌心接种。分别于2016和2017年春对54份玉米新组合进行抗病性鉴定,用玉米自交系获白做对照，把培养好的接种体用加有Tween-20的2%蔗糖溶液洗涤，制成浓度为3×107 个孢子/mL 的分生孢子悬浮液，在玉米第11～12叶时用移液枪将菌悬液接种至玉米心叶内，约3mL/株。接种前先进行田间浇灌, 接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿。在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，病情分级标准参照中国人民共和国农业行业标准，玉米抗病虫性鉴定技术规范，NY/T1248.2—2006。两次试验结果自交系获白病情指数均达到其相应感病程度9级，抗病鉴定结果有效，54份玉米新组合两次抗病鉴定结果基本一致。
实施例7：
玉米大斑病菌接种体在玉米抗病性鉴定中的应用：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株，得到高纯度、强致病力、高活力菌株HD12。
其中，单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤同实施例1。
2）把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存。其中PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基，26℃培养7d，即得二级菌种。
4）接种体的配制，接种体由以下重量比的原料配方组成：小麦100g、甘露醇2.5g、玉米叶25g。对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度。配好的培养基装入三角瓶中，250ml三角瓶每瓶装100g培养基，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定。配好的培养基，经过121帕高压灭菌50min备用。
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～6g二级菌种。在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养7d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
6）玉米大斑病菌接种体在玉米抗病性鉴定中的应用：孢子悬浮液喷雾法。分别于2016和2017年春对46份骨干玉米自交系进行抗病性鉴定,用玉米自交系获白做对照，把培养好的接种体加水淘洗，纱布过滤，加0.01% 吐温(v/v)配制成孢子悬浮液。悬浮液中分生孢子浓度调至1×105～3×105个孢子/mL。在玉米第11～13叶时将孢子悬浮液对玉米植株进行喷雾接种，每株喷雾7～10ml菌液，接种前先进行田间浇灌, 接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿。在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，病情分级标准参照中国人民共和国农业行业标准，玉米抗病虫性鉴定技术规范，NY/T1248.2—2006。两次试验结果自交系获白病情指数均达到其相应感病程度9级，抗病鉴定结果有效，46份骨干玉米自交系两次抗病鉴定结果基本一致。

Claims (8)

1.一种玉米大斑病高效抗病鉴定接种体，其特征在于：接种体由以下重量比的原料组成：小麦100g、甘露醇2.0～3.0g、玉米叶10～25g。
2.根据权利要求1所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株；
2）玉米大斑病强致病力菌株的保存，把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存；
3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基中在24～26℃培养6～7d，即得二级菌种；
4）接种体的配制，按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度，配好的培养基装入三角瓶中，以不超过培养瓶二分之一的空间为度，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定，经过121帕高压灭菌45～100min备用；
5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～10g二级菌种，在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7～8d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养6～8d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。
3.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于：所述步骤1）单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤为：在培养皿中倒入10ml薄层PDA培养基，把稀释好的孢子悬浮液布满在培养基上，孢子悬浮液在100倍镜下每视野1～2个孢子的浓度，用封口薄膜把培养皿套口封上，移入26～30℃的培养箱进行培养8～10h；用低倍镜从培养皿反面检查，挑选在视野内只有1个已经萌发的孢子，且其附近没有其它孢子或菌丝存在，用记号笔对着孢子存在的位置在培养皿反面画上一个小点作记号，培养皿继续放在24～26℃的培养箱进行培养3～5d，标记处的孢子长出的菌落即为该病菌的单细胞菌落。
4.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。
5.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于：所述步骤4）按配方配制原料前，对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm2的碎片备用。
6.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，其特征在于：采用带菌接种体接种法，所述具体步骤为：在玉米10～13叶时，把培养好的接种体接种于玉米心叶内，每株接种2～4g菌粒，接种后田间保湿7d，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。
7.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，其特征在于：采用菌液灌心接种法，所述具体步骤为：把培养好的接种体用加有Tween-20的2%蔗糖溶液洗涤，Tween-20的浓度为0.01%，制成浓度为3×107个孢子/mL 的分生孢子悬浮液，在玉米第10～13叶时用移液枪将菌悬液接种至玉米心叶内，3mL/株，接种前先进行田间浇灌，接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。
8.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，其特征在于：采用孢子悬浮液喷雾法，所述具体步骤为：把培养好的接种体加水淘洗，纱布过滤，加0.01% 吐温(v/v)配制成孢子悬浮液，悬浮液中分生孢子浓度调至1×105～3×105个孢子/mL，在玉米第10～13叶时将孢子悬浮液对玉米植株进行喷雾接种，每株喷雾7～10ml菌液，接种前先进行田间浇灌，接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。
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