CN115927010A - 一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物病原菌及病害研究技术领域，具体涉及一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法及其应用。本发明所述方法通过将诱捕到玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子在密闭湿润的环境中培养，促进玉米大斑病菌对玉米苗的侵染；然后将被侵染玉米苗依次在本发明所设定时间的湿润条件和干燥条件下存放，诱导玉米大斑病菌快速产生和释放孢子，得到的玉米大斑病菌孢子的活力和致病力均有显著提升，接种3～4天的短时间内可见明显的侵染性水浸状病症，有效解决玉米大斑病菌菌丝及孢子长期保种及菌株继代培养而导致的生长能力和产孢能力退化的技术问题；同时，本发明所述的方法，操作简单，重复性强，成功率高，在实验室室内条件下即可完成。
Description
技术领域
本发明属于植物病原菌及病害技术领域，具体涉及一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法及其应用。
背景技术
玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)是玉米生产上的重要病原菌，由其侵染玉米引起的玉米大斑病广泛分布于世界各玉米栽培地区，大斑病的发生能导致玉米叶片枯黄，影响玉米叶片光合作用，最终导致玉米产量下降。在大发生年份一般减产15-20％，严重时减产50％以上。
本领域试验研究发现由于玉米大斑病菌的寄主专一性，使得玉米大斑病菌在PDA培养基及含玉米叶汁的特殊平板培养基连续继代培养3代后，以及在采用常规真菌PDA斜面及滤纸片低温保存后，会出现了菌丝生长能力和产孢能力明显退化的现象，给该菌的致病性、药剂敏感性、基础生物学、分子生物学以及病害防治等方面的试验研究带来诸多困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法及其应用，所述方法可以提高玉米大斑病菌的活力和致病力，解决玉米大斑病菌长期保存菌丝生长能力和产孢能力退化的问题。
本发明提供了一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法，包括如下步骤：
1)将诱捕到玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子接种至玉米苗上，于密闭保湿环境内进行第一培养，得到接种玉米苗；
2)将所述接种玉米苗于密闭保湿环境外进行第二培养，得到菌丝侵染和病斑扩展玉米苗；
3)将所述菌丝侵染玉米苗的离体叶片在湿润条件下存放3～5天后，在干燥条件下存放2～3天，得到病斑上有玉米大斑病菌孢子的叶片。
优选的，步骤1)所述植物种子包括高粱种子。
优选的，步骤1)所述玉米苗包括4～5叶期玉米苗；所述接种的位置包括玉米苗的可见叶上和/或心叶内。
优选的，所述第一培养的温度为23～27℃；光照强度为1000～1500LX；时长为6～7天。
优选的，所述密闭保湿环境由装有水的密封透明装置提供，所述密封透明装置中的水层高度为1～1.5cm。
优选的，所述第二培养的温度为23～27℃；空气相对湿度≥60％；光照强度为1000～1500LX；时长为3～7天。
优选的，步骤3)所述湿润条件包括保鲜膜覆盖的湿润滤纸。
优选的，步骤3)所述干燥条件的空气湿度为50％～60％。
本发明还提供了上述技术方案所述方法在玉米大斑病菌菌种保存和扩繁、玉米大斑病菌的科学研究，玉米大斑病病害防治和玉米育种中的任意一项或多项中的应用。
本发明还提供了一种玉米大斑病菌菌种的保存方法，将上述技术方案所述方法中获得的所述病斑上有玉米大斑病菌孢子的叶片置于牛皮纸容器中，4～6℃保存。
有益效果：
本发明提供了一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法，所述方法通过将诱捕到玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子在密闭湿润的环境中培养，促进玉米大斑病菌对玉米苗的侵染；然后将被侵染玉米苗依次在本发明所设定时间的湿润条件和干燥条件下存放，诱导玉米大斑病菌快速产生和释放孢子，得到的玉米大斑病菌的活力和致病力均得到显著提升，接种3-4天的短时间内可见明显的侵染性水浸状病症。室内条件下病菌侵染及玉米苗病叶诱导产孢的过程极大减少了外界杂菌的干扰，有助于病菌长期保存。本发明方法有效解决了玉米大斑病菌菌丝及孢子长期保种及菌株继代培养而导致的生长能力和产孢能力退化的技术问题。
同时，本发明所述的方法，操作简单，重复性强，成功率高，在实验室室内条件下即可完成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中玉米大斑病菌FJ20-M、FJ07-M、FJ14-I和FJ12-I的菌落图(从左至右)；
图2为实施例1中玉米大斑病菌FJ20-M无孢子图；
图3为实施例1中高梁粒种子对玉米大斑病菌FJ20-M菌丝诱捕的菌落图；
图4为实施例1中诱捕到有活力菌丝的高梁粒种子展示图；
图5为实施例1中诱捕有活力菌丝的高粱粒种子接种在玉米苗心叶内的展示图；
图6为实施例1中玉米接种苗在透明塑料盒内进行培养的展示图；
图7～8为实施例1中带有菌丝侵染的水浸状斑块的玉米叶片；
图9～10为实施例1中诱导产生玉米大斑病菌孢子的病叶；
图11～12为实施例1中诱导产生的玉米大斑病菌的孢子在100和400倍显微镜下的形态；
图13为实施例1中诱导产生的玉米大斑病菌的孢子对玉米苗的侵染力及其病叶上的病斑形状；
图14为实施例1中分离得到的玉米大斑病菌在PDA培养基上的菌落图；
图15为测试例2中实验组1中玉米大斑病菌孢子在接种4天后的玉米苗状态图；
图16为测试例2中实验组2中玉米大斑病菌孢子在接种3天后的玉米苗状态图；
图17为测试例2中实验组2中玉米大斑病菌孢子在接种7天后的玉米苗状态图；
图18为测试例2中实验组1中玉米大斑病菌孢子在接种7天后的玉米苗状态图；
图19为对比例1中将玉米大斑病菌以PDA培养基上培育的菌丝块为接种体接种在玉米苗上的形态图。
具体实施方式
本发明提供了一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法，包括如下步骤：
1)将诱捕到玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子接种至玉米苗上，于密闭保湿环境内进行第一培养，得到接种玉米苗；
2)将所述接种玉米苗于所述保湿环境外进行第二培养，得到菌丝侵染和病斑扩展玉米苗；
3)将所述菌丝侵染玉米苗的离体叶片在湿润条件下存放3～5天后，在干燥条件下存放2～3天，得到病斑上有玉米大斑病菌孢子的叶片。
本发明优选采用植物种子对玉米大斑病菌活力菌丝进行诱捕。本发明所述诱捕的步骤优选包括：将玉米大斑病菌菌株接种至固体培养基上，距离所述菌株1～3cm处放置灭菌后的植物种子，暗培养，得到诱捕到玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子。
本发明对所述玉米大斑病菌的菌株类型没有特殊限定，任意玉米大斑病菌菌株均可。本发明所述固体培养基优选包括PDA培养基或PSA培养基，更优选为PDA培养基。本发明对所述PDA培养基的来源没有特殊限定，常规购买或自行配制均可。本发明所述植物种子与所述菌株的距离优选为2cm。本发明所述植物种子优选包括高粱种子、小麦种子、大麦种子或玉米种子，更优选为高粱种子；所述高粱种子具有丰富的营养，不易失水干燥，且个体均匀，能持续为玉米大斑病菌提供营养物质，不易受外界杂菌污染；同时，高粱种子相对于大麦等种子更小，易接种于玉米苗心叶内或可见叶上，不易掉落，更易完成对玉米苗的侵染。本发明在进行所述灭菌前，优选还包括将种子浸泡12～24h，更优选为24h。本发明对所述植物种子的灭菌方式没有特殊限定，采用本领域常规灭菌方式即可。本发明所述暗培养的时间优选为5～10天，更优选为7天；温度优选为20～28℃，更优选为25℃。
所述诱捕后，本发明将诱捕到玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子接种至玉米苗上，于密闭保湿环境中进行第一培养，得到接种玉米苗。本发明所述玉米苗优选包括4～7叶期玉米苗，更优选为4～5叶期玉米苗。本发明所述接种的位置优选包括玉米苗的可见叶上和/或心叶内，更优选为心叶内。本发明所述玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子接种的数量优选为1～2个，更优选为1个。
在本发明的一个实施例中，所述湿润空气氛围由密封容器获得，优选包括装有水的密封透明装置，所述密封透明装置中的水层高度优选为1～1.5cm，更优选为1.5cm。本发明对所述密封透明装置的大小没有特殊限定，与玉米苗大小适应即可。本发明所述密闭保湿环境不仅能够保证玉米苗的水分需求，同时能够促进玉米大斑病菌菌丝对玉米苗的侵染。本发明所述第一培养的温度优选为23～27℃，更优选为24～25℃；空气相对湿度优选＞85％，更优选为90％；光照强度优选为1000～1500LX，更优选为1000LX，时长优选为6～7天，更优选为7天。
所述第一培养后，本发明将所述接种玉米苗于保湿环境外进行第二培养，得到有菌丝侵染和病斑扩展玉米苗。本发明所述第二培养的温度、光照强度和相对湿度优选与所述第一培养保持一致，在此不再赘述。本发明所述第二培养的时长优选为3～7天，更优选为5天。本发明所述第二培养过程中优选还包括对玉米苗进行喷水，所述喷水的频率优选为早、晚各一次。本发明对所述喷水的量没有特殊限定，以叶面湿润为宜。
所述第二培养后，本发明优选将所述菌丝侵染和病斑扩展玉米苗叶片剪下，在湿润条件下存放3～5天。本发明所述湿润条件优选包括保鲜膜覆盖的湿润滤纸，即，将所述带有水浸状斑块的叶片剪下放置于湿润滤纸上后，以保鲜膜覆盖以保持其湿润条件。本发明对所述湿润滤纸的湿润程度没有特殊限定，将滤纸浸湿即可。本发明在所述湿润条件下存放的时间优选为4天。
所述湿润条件下存放3～5天后，本发明将湿润条件下存放的叶片在干燥条件下存放2～3天，得到病斑上有玉米大斑病菌孢子的叶片。本发明所述干燥条件优选为移除保鲜膜和湿润滤纸的自然条件。本发明所述干燥条件下存放的时间优选为3天。本发明所述叶片的斑块上含有玉米大斑病菌孢子，所述玉米大斑病菌孢子的活力和致病力得到显著增强。本发明将被侵染玉米苗依次在所设定时间的湿润条件和干燥条件下存放，可以诱导玉米大斑病菌快速产生并释放孢子。
得到所述病斑上含有玉米大斑病菌孢子的叶片后，本发明优选还包括对玉米大斑病菌孢子进行扩繁，得到玉米大斑病菌，本发明所述玉米大斑病菌孢子的扩繁方法优选包括如下步骤：
将所述病斑上含有玉米大斑病菌孢子的叶片后剪成小块后，置于含有无菌水的培养瓶中进行洗脱，得到玉米大斑病菌孢子悬浮液；
得到所述玉米大斑病菌孢子悬浮液后，将玉米大斑病菌孢子悬浮液接种于玉米苗上进行第三培养后，分离，得到所述玉米大斑病菌。
本发明优选将所述病斑上含有玉米大斑病菌孢子的叶片后剪成小块后，置于含有无菌水的培养瓶中进行洗脱，得到玉米大斑病菌孢子悬浮液。本发明所述侵染有斑块的叶片小块的长度优选为1～1.5cm，本发明所述培养瓶优选为三角瓶。本发明所述洗脱的温度优选为20～23℃，更优选为20℃；转速优选为150～200r/min，更优选为180r/min；时间优选为3～10min，更优选为5min。本发明所述玉米大斑病菌孢子悬浮液中接种用的玉米大斑病菌孢子的浓度优选为1×105个/mL。
得到所述玉米大斑病菌孢子悬浮液后，本发明优选将玉米大斑病菌孢子悬浮液接种于玉米苗上进行第三培养。本发明优选采用喷雾的方式将所述玉米大斑病菌孢子悬浮液接种于玉米苗上。本发明所述玉米大斑病菌孢子悬浮液的接种量优选为1mL/株玉米苗。本发明所述玉米苗优选包括4～7叶期玉米苗，更优选为4～5叶期玉米苗。本发明所述第三培养的过程优选包括所述第一培养和第二培养的过程，不再进行赘述。
所述第三培养后，本发明优选还包括分离所述第三培养得到的玉米苗叶片上的玉米大斑病菌。本发明对所述分离的方法没有特殊限定，采用本领域中常规分离方法即可，如75％乙醇病组织分离法，参见“方中达.植病研究方法(第三版)[M].中国农业出版社,1998”)。
采用本发明所述方法可以使菌丝生长能力和产孢能力明显退化的玉米大斑病菌重新获得菌丝生长活力以及致病能力，满足玉米大斑病菌菌株尤其是重要菌株的保存和继代需求，为玉米大斑病菌及玉米大斑病病害研究提供重要的技术支持。
基于所述方法的上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述方法在玉米大斑病菌菌种保存、玉米大斑病菌的科学研究，玉米大斑病病害防治和玉米育种中的任意一项或多项中的应用。
本发明还提供了一种玉米大斑病菌菌种的保存方法，将上述技术方案所述方法中获得的所述的病斑上有玉米大斑病菌孢子的叶片置于牛皮纸容器中，4～6℃保存。本发明所述叶片优选为包含有玉米大斑病病斑和周围组织的玉米叶片。本发明对所述叶片的大小没有特殊限定，同时包含有玉米大斑病病斑和周围组织即可。本发明所述保存的温度优选为4℃。本发明所述牛皮纸袋的尺寸没有特殊限定，依据保存叶片常规选择即可。采用本发明所述保存方法可将玉米大斑病菌菌种保存1年以上，满足玉米大斑病菌孢子接种、单孢分离及病组织分离需求。当使用所述保存的玉米大斑病菌菌种时，本发明优选按照上述技术方案所述的玉米大斑病菌孢子的扩繁方法进行扩繁即可，玉米大斑病菌孢子的扩繁方法的步骤不再进行赘述。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法，步骤如下：
玉米大斑病菌活力菌丝诱捕：取产孢能力严重退化的玉米大斑病菌株FJ20-M、FJ07-M、FJ14-I和FJ12-I，上述四株菌株为2018-2020年从玉米大斑病病叶分离，采用滤纸片保存，中间转菌3次，出现菌丝生长缓慢，菌落边缘出现角变，产孢能力严重退化，其中FJ20-M、FJ07-M、FJ14-I和FJ12-I(从左至右)的菌落图如图1所示，在图1中左侧为FJ20-M和FJ07-M的菌落，右侧为FJ14-I和FJ12-I的菌落；FJ20-M菌株无孢子如图2所示。
由图1和图2可以得出：FJ20-M、FJ07-M、FJ14-I和FJ12-I的菌丝生长缓慢，菌落边缘出现角变，产孢能力严重退化或没有产孢能力。
将FJ20-M菌株接种在PDA培养基中间，然后在菌株周围1～3cm距离处放置灭菌的高梁粒种子(预先用水浸泡24h后，再进行高压灭菌消毒)，25℃黑暗条件下共培养5～10天后，完成玉米大斑病菌菌丝诱捕，其中图3为诱捕菌丝的菌落图；挑选能诱捕到有活力菌丝的高梁粒种子(高梁粒种子上长满菌丝)，如图4所示。
2)诱捕活力菌丝高梁粒接种玉米苗：将步骤1)中得到的诱捕有活力菌丝的高梁粒种子接种到4～5叶感大斑病品种“上品”玉米苗心叶内，每株玉米苗放1～2粒高粱粒，如图5所示。接种后的玉米苗连盆钵一起放在透明塑料盒内，盒内加1cm水层，再用另一透明塑料盒对扣保湿，再用浸水的保鲜膜封接触口，如图6所示；将对口的透明塑料盒置于25±2℃，相对湿度在≥60％，1500LX的光照培养室内培养7天后，移除塑料盒，玉米苗早晚喷水1次至叶片湿润，继续培育3-7天后，在其叶片上可见有菌丝侵染的水浸状斑块，如图7～8所示。
3)玉米苗病叶产孢诱导：在室内将步骤2)中得到的有水浸状斑块的玉米叶片剪下，放在透明塑料盒内的一层湿润滤纸上，用保鲜膜覆盖保湿3-5天后，移除保鲜膜和湿润滤纸于未保湿的自然条件下存放干燥2-3天，病叶经上述时间的湿干交替处理后，能诱导产生形态清晰、致病力强的玉米大斑病菌孢子，如图9～12所示，其中图9～10为诱导产生玉米大斑病菌孢子的病叶，图11～12为诱导产生的玉米大斑病菌的孢子在100倍镜和400倍镜下的形态。
4)玉米大斑病菌分离：
将步骤3)中获得的玉米大斑病菌孢子的病叶病斑部剪成长度为1～1.5cm的小块，置于含无菌水的三角瓶中，20℃，180r/min下振荡5min，以洗脱病叶上的孢子，制备孢子悬浮液，孢子悬浮液中孢子的浓度为1×105个/mL；将孢子悬浮液采用喷雾的方式接种在4～5叶期玉米苗上，每株玉米苗的接种量为1mL；将接种后的玉米苗放到透明塑料盒内，并用另一透明塑料盒对扣保湿(盒子内的空气相对湿度大于85％)，置于25±2℃，相对湿度为60％，光照强度为1500LX的光照培养室内培养7天后，移除塑料盒，玉米苗早晚喷水1次，继续培育3-7天后，在玉米苗叶上可见明显的、扩展的、长梭形典型病斑出现，示病斑典型且数量多如图13所示；
将上述叶片上的病斑采用常规的75％乙醇病组织分离法分离，具体为：将病斑组织病健交界处组织剪成大小约1～1.5cm小块，用无菌水清洗2次后，体积百分含量为75％的乙醇浸泡消毒30～45s，再用无菌水清洗2次后，移入PDA培养基中培养，7天后便可在PDA培养基上重新获得有活力、菌丝生长正常、产孢好、致病力强的玉米大斑病菌菌株，如图14所示。
实施例2
采用实施例1中的方法得到有活力、菌丝生长正常、产孢好、致病力强的玉米大斑病菌菌株，区别在于采用的是FJ07-M菌株。
实施例3
采用实施例1中的方法得到有活力、菌丝生长正常、产孢好、致病力强的玉米大斑病菌菌株，区别在于采用的是FJ14-I菌株。
实施例4
采用实施例1中的方法得到有活力、菌丝生长正常、产孢好、致病力强的玉米大斑病菌菌株，区别在于采用的是FJ12-I菌株。
测试例1
比较采用实施例1～4中方法处理前、后玉米大斑病菌菌株的产孢能力，具体方法如下：
1)将实施例1～4处理前的玉米大斑病菌FJ20-M、FJ07-M、FJ14-I和FJ12-I分别置于PDA培养基上进行培养，具体条件为黑暗，25℃培养12天，分别得到FJ20-M、FJ07-M、FJ14-I和FJ12-I四株菌株的菌落；在PDA培养基的菌落上取0.5cm2的菌块10块，置于1个含有3mL无菌水的试管中，20℃，180r/min条件下震荡5min，如有孢子产生便可得到玉米大斑病菌分生孢子，每株菌株9个生物学重复。
2)将实施例1中6株带有玉米大斑病菌孢子的玉米苗的病叶部分剪成长度为1～1.5cm的小块后，置于含20mL无菌水的三角瓶中，20℃，180r/min下振荡5min，以洗脱病叶上的孢子，每株菌株9个生物学重复。实施例2～4中的带有玉米大斑病菌孢子的玉米苗均按照上述操作进行。
将步骤1)和2)中的样本制备成载玻片，在100倍显微镜下观察步骤1)和步骤2)中每个生物学重复下的孢子数，结果如表1所示：
表1采用实施例1～4中方法处理前后玉米大斑病菌FJ20-M、FJ07-M、FJ14-I和FJ12-I的产孢量
由表1可以得出，与未处理的玉米大斑病菌相比，采用本发明方法处理后的玉米大斑病菌的产孢能力明显获得提升。
实施例5
将实施例1～4中得到的含有玉米大斑病菌孢子的玉米苗的病叶剪下，放入牛皮纸信封内，与4℃低温条件下保存。
测试例2
将按照实施例5中的方法保存2个月的实施例1中的含有玉米大斑病菌孢子的玉米苗的病叶按照实施例1中步骤4)的方法制备成孢子的浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液；比较获得的孢子悬浮液与采用当年新分离菌株PDA培养获得的孢子悬浮液接种效果的比较，具体步骤如下：
实验组1：2022年从当年种植的具有典型玉米大斑病病症的病叶上获得分离物，经菌丝和孢子形态观察和接种试验，确认为玉米大斑病菌。将该病菌采用PDA培养基培养，并于28℃黑暗条件下培养16天后，再用无菌水洗脱培养基平板上的孢子，获得孢子悬浮液，孢子浓度为1×105个孢子/mL；
实验组2：实施例1中获得的孢子浓度为1×105个孢子/mL的FJ20-M菌株的孢子悬浮液。
将实验组1和实验组2中获得的孢子悬浮液以喷雾的方式接种到4～5叶期玉米苗上，结果发现实验组1中玉米大斑病菌孢子在接种4天未见明显的病斑，如图15所示；实验组2中玉米大斑病菌FJ20-M菌株孢子在接种3天内可见较多明显的侵染性水浸状病斑，如图16所示。接种7天后，实验组2中玉米苗上的病斑尺寸和数量明显优于实验组1中玉米苗上的病斑，详情分别如图17～18所示，其中图17为实验组2中的玉米苗，图18为实验组1中的玉米苗；且实验组2玉米苗病叶上的病斑呈典型长梭形，病斑扩展明显。接种14天后，试验1组的平均株发病率为44％，发病株第2心叶的平均病斑数2.3个(1～4个)，而试验2组的平均株发病率达100％，发病株第2心叶的平均病斑数5.5个(1～18个)。
由以上结果可以得出：采用本发明方法可诱导获得强致病力的玉米大斑病菌孢子，采用此法也可进行玉米大斑病菌在寄主上的扩繁和继代培养。
测试例3
将实施例1分离获得有活力的FJ20-M菌株用PDA培养基培养，并于28℃黑暗条件下培养12天后(0.5cm2的菌块10块，置于1个含有3mL无菌水的试管中，20℃，180r/min条件下震荡5min，100倍下每视野孢子数均在6个以上)，用无菌水洗脱培养基平板上的孢子，制备孢子浓度为1×105个孢子/mL孢子悬浮液，以喷雾的方式接种到不同抗性水平玉米品种(如表2所示)4～5叶期苗上。接种后的玉米植株，采用本发明的第一培养条件(培养7天)结合第二培养条件(培养7天)，于接种后14天调查病情，结果如表2所示。
人工接种品种抗性分级标准：病情指数DI≦35为抗(R)，病情指数DI在35.01～45.00之间为中抗(MR)，病情指数DI在45.01～55.00之间为中感(MS)，病指DI>55为感病(S)；
病情指数＝Σ(各级病叶数×相对病级数值)/(调查总叶数×9)×100；
表2实施例1分离获得有活力的菌株接种不同抗性水平玉米品种后的发病效果
备注：在表2中的抗性水平S表示感病、MS表示中度感病，MR表示中度抗病，R表示抗病。
由表2发现采用此孢子悬浮液接种不同玉米品种，均能引起玉米发病，表明从实施例1重新分离获得的菌株有活力，其菌落形态完好，产孢量大，致病能力强，并能区分品种的抗性差异。
对比例1
采用实施例1中的方法进行玉米大斑病菌菌株的培养，区别在于，以在PDA培养基培养的菌丝块(0.5cm2)替代携带有活力菌丝的高梁粒种子作为玉米苗接种体，菌丝块的培养条件为28℃黑暗条件下培养16天。
结果发现，在将菌丝块接种3天后，菌丝块干缩，菌丝生长停止，无法完成对玉米叶片的侵染，如图19所示。
由以上实施例可以得出：采用本发明中的方法可以提高玉米大斑病菌的活力和致病力，解决玉米大斑病菌孢子因长期保种及菌株继代培养而造成的菌株活力和产孢能力退化的问题。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种提升玉米大斑病菌活力和致病力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将诱捕到玉米大斑病菌活力菌丝的植物种子接种至玉米苗上，于密闭保湿环境内进行第一培养，得到接种玉米苗；
2)将所述接种玉米苗于密闭保湿环境外进行第二培养，得到菌丝侵染和病斑扩展玉米苗；
3)将所述菌丝侵染和病斑扩展玉米苗的离体叶片在湿润条件下存放3～5天后，在干燥条件下存放2～3天，得到病斑上有玉米大斑病菌孢子的叶片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述植物种子包括高粱种子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述玉米苗包括4～5叶期玉米苗；所述接种的位置包括玉米苗的可见叶上和/或心叶内。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一培养的温度为23～27℃；空气相对湿度＞85％；光照强度为1000～1500LX；时长为6～7天。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述密闭保湿环境由装有水的密封透明装置提供，所述密封透明装置中的水层高度为1～1.5cm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养的温度为23～27℃；空气相对湿度≥60％；光照强度为1000～1500LX；时长为3～7天。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述湿润条件包括保鲜膜覆盖的湿润滤纸。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述干燥条件的空气湿度为50％～60％。
9.权利要求1～8任一项所述方法在玉米大斑病菌菌种保存和扩繁、玉米大斑病菌的科学研究、玉米大斑病病害防治和玉米育种中的任意一项或多项中的应用。
10.一种玉米大斑病菌菌种的保存方法，其特征在于，将权利要求1～8任一项所述方法中获得的所述的病斑上有玉米大斑病菌孢子的叶片置于牛皮纸容器中，4～6℃保存。
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