JPH02195872A

JPH02195872A - ビフィズス菌プロトプラストの調製法

Info

Publication number: JPH02195872A
Application number: JP63201579A
Authority: JP
Inventors: Satoru Ishii; 哲石井; Kenji Aoyama; 顕司青山; En Hashiba; 橋場　炎
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-08-12
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1990-08-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】皮！上生机尻光互本発明は、プロトプラスト化による細胞融合に利用し得
るビフィズス菌のプロトプラストを調製する方法、更に
詳しくは、ビフィドバクテリウム・シェードロンガムの
プロトプラストを調製する方法に関する。

ｌ来■狡歪従来、細菌での遺伝子伝達技術としては、存生生殖によ
る形質導入や染色体または核外ＤＮＡ導入による形質転
換などが用いられており、近年の分子遺伝学の基本技術
として発展してきた。特に、その取扱いの容易さと科学
的知見の豊富さから、大腸菌を素材とした遺伝子伝達技
術は、急速に進展して今日に至っている。

その反面、取扱いも難しく、科学的な背景も乏しい工業
微生物での遺伝子伝達技術については、進展を見せない
ままに経過してきていた。しかし、近年になり、プロト
プラストにポリエチレングリコールとカルシウムを加え
るとプロトプラスト融合が生じることが報告されたこと
により、プロトプラスト化及びプロトプラストから正常
な細胞への再生が可能な細菌では、プロトプラスト融合
法が有効な育種手段となることが示唆されている。

プロトプラストは、原形質体とも称し、細胞膜に包まれ
た原形質の塊で、細胞壁を除いた全細胞内容を指すもの
である。このプロトプラストは、細胞を高張液中で、細
胞壁分解酵素処理によって調製することができる。ｌｌ
製されたプロトプラストは、元の細胞の形の如何にかか
わらず球形を呈し、低張液に移すと吸水によって膨張し
、破裂してしまうが、適当な浸透圧条件下では、細胞と
しての諸活性を維持し、また、高分子物質や粒子の取込
み、細胞融合など、通常の細胞では見られない現象を示
すことが知られている。

プロトプラストを調製する際は、まず、細胞壁を温和な
条件で溶解することが必要であり、したかって、細胞壁
の温和な条件で溶解するのに、細胞壁溶解酵素が用いら
れる。多（の細菌類の場合リゾチームで溶菌されるが、
このリゾチームの作用には、７０膳Ｈ前後のＮａＣ１と
菌種に応じたｐＨと温度の条件が大きく影響する。

また、プロトプラストを安定化す為ためには、等張剤と
２価イオンが必要である。

現在までに、色々な細菌類のプロトプラスト化が試みら
れており、ビフィズス菌のプロトプラスト化についても
以下のように報告されている。

例えば、エクステルカーテらは、ビフィドバクテリウム
・ビフィダム・バー・ペンシルバニクス（Ｂげ１ｄｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕａ　ｂｉｊｉｄｕａ　ｖａｒ、ｐｅｎｎ
ｓｙＬｖａｎｉｃｕＳ）に対し、ショ糖存在下で、リゾ
チームを作用させることにより、プロトプラストを１）
製したと報告している〔ビオヒミカ・エト・ビオフイジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｌｃａ　ａｔ　Ｂｌｏ−ｐ
ｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）２１９゜１４１−１５４．（
１９７Ｇ）　）　。

ウエダらは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムにエン
ド−Ｎ−アセチルムラミダーゼを作用させて、プロトプ
ラストを調製したと報告している〔ジャーナル・オプ・
ジェネラル・アンド・アプライド・ミクロバイオロジ（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌａｎｄ　Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　ｓｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　２９，５０７
（１９８３））　＊森下らは、ビフィドバクテリウム属
に属する微生物に対し、シラ糖、乳糖、マルトース、ラ
フチエロース、あるいはトレハロースの三糖類の存在下
で、Ｎ−アセチルムラミダーゼを作用させることにより
、プロトプラストを製造する方法を特許出願している（
特開昭５９−１３５８８３）。

ナカイらは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムについ
て、シラ糖及びペニシリンＧを含有する培地で嫌気的に
生育させて、プロトプラストを調製したと報告している
〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド
・ミクロバイオロジ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　ｕｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ）３０．１８７（１９８４））　。

小此木らは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物に
対し、ラフィノース、メレジトース、あるいはマルトト
リオースの三糖類及びマグネシウムイオンの存在下で、
Ｎ−アセチルムラミダーゼを作用させることにより、プ
ロトプラストを製造する方法を特許出願している〔特開
昭６ｌ−２８０２６７）。

しかし、プロトプラスト化に当たっては、それぞれの菌
種毎に、最適の条件設定が必要であり、また、プロトプ
ラストの再生についても同様に、最適の条件設定が必要
であり、したがって、高収率でビフィズス菌のプロトプ
ラストを製造し、かつ、高率でビフィズス菌のプロトプ
ラストを再生する方法について未だに確立されておらず
、ビフィズス菌の育種及び改良に関しては、他の微生物
に比べて著しく遅れているという問題があった。

なお、ビフィズス菌は発酵乳、乳酸菌飲料、菓子などの
食品、整腸剤、栄養剤あるいは飼料などに広く利用され
ている微生物である。

が　°　しよ゛とする本発明者らは、ビフィドバクテリウム・シェードロンガ
ムのプロトプラストを調製するに際し、細胞壁溶解酵素
としてリゾチーム及びα−アミラーゼを併用して菌体懸
濁液を処理することにより、良好な球状のプロトプラス
トを形成することに成功し、このプロトプラストを再生
することにも成功した。

したがって、本発明は、プロトプラスト融合に利用し得
るビフィドバクテリウム・シュードロンガムのプロトプ
ラストを調製するための方法を提供することを課題とす
る。

以下本発明の詳細な説明する。

１　を　ン　るための本発明の特徴は、ビフィドバクテリウム・シュドロンガ
ムの菌体懸濁液をリゾチーム及びα−アミラーゼを併用
して同時に処理するか、もしくはリゾチームで処理した
後α−アミラーゼで処理することにより、ビフィズス菌
のプロトプラストを得ることにある。

本発明において、ビフィドバクテリウム・シュードロン
ガムの細胞壁溶解酵素（以下溶菌酵素という）として、
リゾチームとα−アミラーゼを上述のように併用する理
由は、次に示す各種酵素とりゾチームの併用による溶菌
効果を試験した結果に基づいている。

溶菌試験：まず、供試酵素としてリゾチーム、Ｎ−アセチルムラミ
ダーゼＳＧ及びアクロモペプチダーゼを選択し、上記ビ
フィズス菌〔ビフィドバクテリウム・シェードロンガム
ＳＢ↑２９０８（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０１３８号）〕に対
する溶菌効果を調べた結果、リゾチームを用いた場合に
のみ顕著に浸透圧安定細胞数が減少することを認めた。

しかし、位相差顕微鏡による観察では球状のプロトプラ
ストを認めることはできなかった。

そこで、次にリゾチームと他の酵素との併用による溶菌
効果を調べた。結果は表１に示すとおりである。

また、表中の記号は下記を示す。

−・−一−〜−−・−・プロトプラスト形成せず、±　
・−・・−−−−−−・・・−プロトプラスト５０％以
下形成、＋　−・・−・−・・・・・−プロトプラスト
５０〜９０％形成、＋＋−・−・−・−プロトプラスト
９０％以上形成、Ａ　・・−・・・・・・−・・−細胞
の凝集表１にみられるとおり、リゾチームとの併用によ
る各種酵素の溶菌効果は、酵素をリヅチーム前処理又は
後処理もしくは同時処理にそれぞれ併用した場合につい
て綜合的に判断すると、リゾチームをα−アミラーゼと
併用し、且つ両者で同時処理するか、もしくはリゾチー
ムで処理した後α−アミラーゼで処理すると向上するこ
とがわかる。

特に、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムのプロ
トプラスト化には、溶菌効果としてリゾチームとα−ア
ミラーゼを併用して同時処理することの優位性が認めら
れる。

次に、リゾチームとα−アミラーゼを上述のようにして
併用してビフィドバクテリウム・シュードロンガムをプ
ロトプラスト化するに当っては、同時処理する場合には
りゾチームを２００〜１　、０００ｐ　ｇ／ｓ　１、好
ましくは８００ｐｇ／曽１の濃度で、α−アミラーゼを
少くとも、５００　／Ｊ　ｇ／ｍ　ｌの濃度で上記ビフ
ィズス菌の菌体懸濁液に添加することが好ましく、処理
時間も２時間程度が好ましい。

添付の第１図並びに第２図は、リゾチームとα−アミラ
ーゼの同時処理に際してリゾチームの添加濃度と処理時
間が浸透圧安定細胞出現率に及ぼす影響をそれぞれ示し
たものである。これら図にみられるごとく、リゾチーム
の添加濃度は８００ｐｇ／１）処理時間は２時間が適当
であると判断される。なお、リゾチームと同時に添加す
るα−アミラーゼの添加濃度に関しては、０から２　ｍ
ｇ／　　の範囲でその影響を調べたが、浸透圧安定細胞
出現率は無添加の場合に対し変化はみられなかった。し
かし、α−アミラーゼ添加の有無は、プロトプラストの
形状に大きく関与しており、無添加の場合は、球状を示
す細胞は全く認められない、また、検鏡観察の結果によ
ると、α−アミラーゼの添加濃度は５００ｐｇｕｙｓ　
ＩＩが適当と判断される。

また、本発明においては、上記ビフィズス菌のプロトプ
ラスト化をラフィノースと塩化マグネシウムの存在下で
行うことにより、良好なプロトプラストを形成すること
ができる。この場合、ラフィノースは０．２〜０．３Ｍ
、塩化マグネシウムは１〜５ａＭ、好ましくは３ｍＭを
菌体懸濁液中に存在させることが好ましい。

以下実施例を示して本発明によるビフィズス菌のプロト
プラストの調製法を具体的に説明する。

実施例４０％のトマトジュース浸出液を含むＣＡＭ培地を用い
て、ビフィドバクテリウム・シュードロンガムＳ　Ｂ　
Ｔ２９０Ｂ（徽工研菌寄第１０１３８号）を３７℃の温
度に一夜培養した。

次いで、培養により得られた菌体を３ｓ＋Ｈの塩化マグ
ネシウムと０．３Ｈのラフィノースを含む３０＋ｗＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）に懸濁させた。この
菌体懸濁液に８００ｐｇ／１ａｌｌのリソ゛チームと５
００ｐｇ／ｓ　１のα−アミラーゼを同時に添加してプ
ロトプラスト化を行なった。

プロトプラストの形成は９０％以上であり、また、プロ
トプラストの再生も可能であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による方法においてリゾチームの添加
濃度が浸透圧安定細胞出現率に及ぼす影響を示したもの
であり、第２図はりゾチームの処理時間が上記出現率に
及ぼす影響を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ビフィドバクテリウム・シェードロンガム（Ｂｉ
ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕ
ｍ）のプロトプラストを形成する際に、細胞壁溶解酵素
としてリゾチーム及びα−アミラーゼを併用して菌体懸
濁液を同時に処理するか、もしくはリゾチームで処理し
た後α−アミラーゼで処理することを特徴とするビフィ
ズス菌プロトプラストの調製法。
（２）リゾチーム２００〜１，０００μｇ／ｍｌ及びα
−アミラーゼ５００μｇ／ｍｌ以上の濃度で、菌体懸濁
液を同時に処理する請求項（１）に記載のビフィズス菌
プロトプラストの調製法。
（３）０．２〜０．３Ｍラフィノース及び１〜５ｍＭ塩
化マグネシウムの存在下に、菌体懸濁液を処理する請求
項（１）又は（２）に記載のビフィズス菌プロトプラス
トの鋼製法。