ES2352633A1 - Cepa mutante de lactococcus lactis lactis y método para la producción industrial de acetoína. - Google Patents
Cepa mutante de lactococcus lactis lactis y método para la producción industrial de acetoína. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a la obtención de una bacteria ácido láctica mutante, la cepa L. lactis lactis CML B4, que dispone de una elevada capacidad de producir el compuesto químico acetoína. La bacteria mencionada presenta una actividad enzimática lactato deshidrogenasa reducida, inferior al 10% de la actividad de la cepa madre. Como consecuencia de ello, dicha cepa mutante produce una cantidad de acetoína más de diez veces superior a la producida por la cepa madre, de tipo silvestre, cuando ambas son cultivadas en idénticas condiciones en un medio de cultivo que contiene 10 g/L de glucosa como fuente de carbono. La presente invención se refiere también al desarrollo de un procedimiento eficiente de producción de acetoína mediante fermentación en condiciones aeróbicas basado en la utilización de la cepa de la invención. En las condiciones óptimas de fermentación que originan la máxima producción de acetoína la cepa L. lactis subsp. lactis CML B4 produce hasta 43,06 g de acetoína a partir de 100 g de glucosa en fermentaciones tipo discontinuo (batch), y 72,42 g de acetoína a partir de 200 g de glucosa en fermentaciones tipo semicontinuo (fed-batch).
Description
Cepa mutante de Lactococcus lactis lactis
y método para la producción industrial de acetoína.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de los microorganismos obtenidos por mutación de cepas
salvajes. En concreto, la presente invención se refiere a una nueva
cepa de Lactococcus lactis lactis, derivada de la cepa
silvestre NCIMB702118 y caracterizada por su elevada tasa de
producción de acetoína así como a un procedimiento de producción de
acetoína mediante fermentación por dicho microorganismo.
La acetoína
(3-hidroxi-2-butanona
o acetilmetilcarbinol) es un compuesto orgánico aromatizante que,
junto con el diacetilo (2,3-butanodiona o
dimetilglioxal), es el que confiere el típico aroma a mantequilla
presente en diversos derivados lácteos, tales como la mantequilla,
la nata y algunos quesos.
La acetoína presenta un elevado interés por su
utilización como aroma, con potenciales aplicaciones como aditivo en
diversos sectores industriales, como el alimentario, el farmacéutico
y el cosmético. Aparte de esta utilidad como aditivo aromatizante,
por la estructura química de la molécula, que es de pequeño tamaño y
cuenta con varios grupos funcionales potencialmente reactivos, puede
ser también de interés para la industria química como materia prima
de partida para la síntesis de otras moléculas más complejas
(building blocks) (Werpy, T. y Petersen, G., eds. (2004) Top
Valué Added Chemicals From Biomass. Volume I: Results of Screening
for Potential Candidates firom Sugars and Synthesis Gas. National
Renewable Energy Laboratory, U.S. Department of Energy).
La producción de acetoína puede llevarse a cabo
mediante procedimientos de tipo químico o biotecnológico. Entre los
métodos químicos de producción se encuentran la reducción parcial de
diacetilo en presencia de cinc y ácidos, la oxidación electroquímica
de la metil etil cetona (butanona), y la oxidación selectiva del
2,3-butanodiol. Entre estos métodos, el de mayor
aplicación industrial es el que se realiza mediante la oxidación
electroquímica de la metil etil cetona, compuesto derivado
exclusivamente de materias primas petroquímicas. Si bien estos
procedimientos de tipo químico pueden dar lugar a elevados
rendimientos de acetoína, las severas condiciones de reacción
necesarias y, sobretodo, la utilización de materias primas no
renovables derivadas del petróleo, aconsejan el establecimiento de
nuevos métodos de producción más sostenibles, a partir de materias
primas renovables. Otro problema que presentan, además, los
procedimientos químicos es que conducen a la generación de mezclas
racémicas de los dos isómeros ópticos de la acetoína.
Por otra parte, la acetoína puede producirse
como resultado de la actividad metabólica de ciertos
microorganismos. El ejemplo más conocido es su producción durante la
fermentación llevada a cabo por ciertas cepas de las denominadas
bacterias ácido lácticas, que se encuentran formando parte de los
cultivos iniciadores (starters) utilizados en la fabricación
de diversos derivados lácteos. Las bacterias ácido lácticas son un
grupo de microorganismos Gram-positivos, anaerobios
facultativos, capaces de convertir los carbohidratos en ácido
láctico por medio de un metabolismo homo- o heterofermentativo.
Entre las cepas que han sido descritas como productoras de este
compuesto, las principales pertenecen a los géneros Lactococcus,
Lactobacillus y Leuconostoc.
La ruta metabólica que conduce a la formación de
acetoína ha sido extensamente estudiada en Lactococcus lactis
y se conoce con gran detalle (Boumerdassi, H. y Cols. (1997) Appl.
Environ. Microbiol. 63: 2293-2299; Hugenholtz, J. y
Cols. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:
4112-4114). La enzima
\alpha-acetolactato sintasa cataliza la formación
de \alpha-acetolactato a partir de dos moléculas
de piruvato (con la pérdida concomitante de una molécula de
CO_{2}). El \alpha-acetolactato, que es una
molécula inestable, puede seguir dos rutas alternativas: i) puede
sufrir una descarboxilación oxidativa de tipo químico (en presencia
de oxígeno) para dar diacetilo, o ii) puede originar acetoína por
descarboxilación enzimática catalizada por la
\alpha-acetolactato descarboxilasa (la vía
mayoritaria). El diacetilo formado puede, a su vez, ser transformado
en acetoína mediante la acción de la diacetilo deshidrogenasa o
reductasa, con la consiguiente oxidación del cofactor NADH a
NAD^{+}. Finalmente, la acetoína puede dar lugar a
2,3-butanodiol, en una reacción catalizada por la
acetoína deshidrogenasa o reductasa (que realmente es la misma
enzima que la diacetilo reductasa), con la oxidación de una segunda
molécula de NADH a NAD^{+} (Figura 1).
La ruta principal del metabolismo del piruvato
es la formación de lactato, por medio de una reacción catalizada por
la enzima lactato deshidrogenasa (Neijssel, O.M. y Cols. (1997) J.
Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 83: 12S-19S). Esta
enzima cataliza la reducción de piruvato a lactato utilizando NADH
como cofactor, que se oxida a NAD^{+}. El NADH requerido para esta
reacción es generado durante la glucolisis, y debe ser reoxidado a
NAD^{+} para que esta ruta metabólica pueda seguir funcionando.
Por tanto, en condiciones de anaerobiosis, con elevados flujos
glucolíticos, el lactato es prácticamente el único producto final
que se obtiene como resultado del metabolismo de los azúcares,
resultando en lo que se denomina fermentación homoláctica
(Platteeuw, C. y Cols. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61:
3967-3971). En otras condiciones, tales como las que
ocurren cuando la velocidad del metabolismo glucídico se reduce o en
condiciones aeróbicas, se observa un desplazamiento del metabolismo
hacia una fermentación ácido-mixta o heteroláctica
(Neijssel, O.M. y Cols. (1997) J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. 83:
12S-19S), resultando en la formación de otros
metabolitos (acetato, formato, etanol, acetoína, diacetilo) además
del lactato.
En el campo de la técnica, se ha intentado
conseguir cepas bacterianas con una producción incrementada de
acetoína, mediante la inactivación de la actividad lactato
deshidrogenasa puesto que, ya que la inmensa mayoría del piruvato
celular es transformado en lactato por medio de la enzima lactato
deshidrogenasa, la inactivación de esta enzima debería conducir a
una mayor disponibilidad del piruvato para las demás rutas
metabólicas. Experimentalmente se ha demostrado que la producción de
acetoína aumenta en cepas deficientes en actividad lactato
deshidrogenasa obtenidas tanto por mutagénesis al azar (Boumerdassi,
H. y Cols. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:
2293-2299; Monnet, C. y Cols. (2000) Appl. Environ.
Microbiol. 66: 5518-5520) como por inactivación
dirigida (Platteeuw, C. y Cols. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61:
3967-3971) del gen que codifica esa enzima. Las
cepas resultantes mostraban un significativo incremento (superior a
un orden de magnitud) en la síntesis de acetoína.
La patente europea EP0928333 describe un método
para la obtención de cepas de Lactococcus lactis dobles
mutantes en la lactato deshidrogenasa y en la piruvato formato
liasa, que producen mayores cantidades de
\alpha-acetolactato y su metabolito acetoína.
El estado de la técnica comprende también
estrategias de sobreexpresión de la actividad
\alpha-acetolactato sintasa: esta enzima es la
primera específica de la ruta de biosíntesis de acetoína. En
principio, podría esperarse que su sobreexpresión causara un mayor
flujo del piruvato a través de esta ruta. Sin embargo, el elevado
valor de su K_{m} hacia el piruvato (50 mM) supone una gran
limitación en lo referente a la utilidad real de esta estrategia, y
los resultados experimentales así lo han corroborado. De hecho, la
sobreexpresión de dicha enzima en un factor de hasta 20 veces ha
ocasionado incrementos en la síntesis de acetoína prácticamente
imperceptibles (Platteeuw, C. y Cols. (1995) Appl. Environ.
Microbiol. 61: 3967-3971).
La patente europea EP0663955 trata sobre el
aislamiento de un ácido nucleico que codifica la enzima
\alpha-acetolactato descarboxilasa y la
utilización de éste, empleando técnicas de ingeniería genética, en
la obtención de cepas de Lactococcus lactis con mayores
producciones de acetoína o diacetilo. La patente francesa FR2777905
trata sobre la obtención de bacterias sobreproductoras de
\alpha-acetolactato y/o diacetilo, empleando
procedimientos de obtención de mutantes en las enzimas lactato
deshidrogenasa y \alpha-acetolactato
descarboxilasa.
Alternativamente, se utiliza en el estado de la
técnica, la sobreexpresión de la actividad NADH oxidasa: Un factor
primordial en la regulación de los flujos a través de las diferentes
rutas del metabolismo del piruvato es el estado redox celular, en
concreto, la relación NADH/NAD^{+}. Valores elevados de esta
relación favorecen la formación de lactato. Valores reducidos
incrementan la participación de otras rutas alternativas, entre
ellas la de formación de acetoína. La NADH oxidasa, que interviene
en el control de esta relación, catalizando la oxidación de NADH a
partir del oxígeno molecular se ve fuertemente incrementada en
condiciones de aerobiosis, que son las condiciones en las que se
observa la mayor producción de acetoína. Sin embargo, la capacidad
máxima celular de actividad NADH oxidasa es limitada y en las
condiciones óptimas de funcionamiento los niveles de esos compuestos
continúan siendo muy exiguos. Intentos de incrementar dicha
actividad enzimática en L. lactis por sobreexpresión, bien
del propio gen de este microorganismo (Hoefnagel, M.H.N. y Cols.
(2002) Microbiology 148: 1003-1013), bien de un gen
heterólogo (Hugenholtz, J. y Cols. (2000) Appl. Environ. Microbiol.
66: 4112-4114; López de Felipe, F. y Cols. (1998) J.
Bacteriol. 180: 3804-3808), han resultado en
incrementos en la producción de acetoína, alcanzándose niveles
similares a los obtenidos en cepas deficientes en la actividad
lactato deshidrogenasa.
Los procedimientos descritos arriba, resultan,
en general, en la obtención de niveles modestos de acetoína, nunca
superiores a 30-35 mM, e insuficientes por tanto
para su aplicación en la producción industrial de este compuesto
químico. Sin embargo, en la patente europea EP0430406 se describe un
procedimiento para la producción de acetoína y diacetilo por
bacterias ácido lácticas mediante fermentación que resulta en
concentraciones finales de acetoína, de hasta 8,4 g/L (95 mM), si
bien ello sólo se consigue mediante la adición al medio de cultivo
de sustancias muy caras como porfirina de hierro o tejidos animales
que la contienen, hemoproteína (hemina o catalasa) o sangre, o sales
de ciertos metales como el cobre que generan el problema de
gestionar los residuos contaminantes resultantes. En ausencia de
tales aditivos la producción de acetoína por las bacterias
utilizadas es inferior a 0,2 g/L (2,3 mM).
El estado de la técnica enseña además
procedimientos para la obtención de acetoína que comprenden la
utilización de microorganismos diferentes de L. lactis. Por
ejemplo, en la solicitud de patente europea EP1820848 se describe
una cepa de la bacteria Bacillus pumilus que produce grandes
cantidades de acetoína, hasta 63 g/L en medios de cultivo que
contienen 200 g/L de glucosa o hasta 58,1 g/L en medios con 180 g/L
de sacarosa. La solicitud de patente de Estados Unidos US20080182306
describe una cepa mutante de la bacteria Bacillus subtilis y
un método para la obtención de acetoína mediante fermentación, con
el que se consiguen alcanzar concentraciones de este compuesto de
hasta 55 g/L en el caldo de fermentación, partiendo de medios de
cultivo conteniendo alrededor de 120 g/L de glucosa. En el estado de
la técnica también se encuentra referencia a un estudio sobre la
optimización de la producción de acetoína por una cepa de
Bacillus subtilis (Xiao, Z.J. y Cols. (2007) Appl. Microbiol.
Biotechnol., 74: 61-68), utilizando un medio de
cultivo conteniendo subproductos agroindustriales, melazas e
hidrolizado de soja concretamente. Con este medio se describen
producciones máximas de acetoína cercanas a 38 g/L. Estos métodos
requieren una prolongada fermentación microbiana, de entre 50 y 60
horas , un tiempo excesivamente prolongado que conlleva tanto una
reducción en las productividades como que los procesos puedan
difícilmente ser considerados como muy eficientes.
El campo de la técnica carece, por tanto, de un
procedimiento eficiente de producción biotecnológica sostenible de
acetoína, que permitiera la obtención de elevadas concentraciones de
acetoína estereoespecífica con elevados rendimientos y
productividades, que permita la producción de acetoína a nivel
industrial, partiendo de materias primas renovables y aprovechando
las características que hacen a este tipo de procesos cumplir
ampliamente con los criterios de sostenibilidad actualmente
vigentes.
Para solucionar esta carencia, la presente
invención propone una cepa bacteriana con una elevada capacidad de
producción de acetoína y un procedimiento eficiente de fermentación
utilizando dicha cepa, con rendimientos y productividades también
elevados, y susceptible de ser empleado industrialmente.
Figura 1. Rutas del metabolismo del piruvato en
la bacteria Lactococcus lactis.
La demanda industrial de acetoína como aditivo
alimentario y cosmético, hace deseable un método altamente eficiente
de producción. Los métodos microbiológicos destacan de otros métodos
de producción por su elevada eficiencia, por ello los inventores han
generado mediante mutagénesis una nueva cepa bacteriana altamente
eficiente para la producción de acetoína.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es una cepa bacteriana de Lactococcus lactis lactis, derivada
de la cepa silvestre NCIMB702118, caracterizada porque su actividad
lactato deshidrogenasa se encuentra en un rango de entre
0,50-0,75 U/mg y que ha sido depositada en la
Colección Española de Cultivos Tipo bajo el número CECT 7512.
Este microorganismo perteneciente al grupo de
las bacterias ácido lácticas, cuya capacidad de producir acetoína es
sorprendentemente elevada, presenta una reducida actividad
enzimática lactato deshidrogenasa como consecuencia de un proceso de
mutagénesis aleatoria. Taxonómicamente, la cepa de la presente
invención (de aquí en adelante también referida como "cepa CML
B4") se clasifica dentro del género Lactococcus, especie
lactis, subespecie lactis. Por lo tanto, la cepa de la
presente invención, es concretamente la L. lactis lactis CML
B4.
La cepa CML B4 deriva de la cepa de tipo
silvestre L. lactis lactis NCIMB 702118, depositada en la
National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria del
Reino Unido (anteriormente conocida como NCDO2118 y de aquí en
adelante "cepa NCIMB 702118" o "cepa madre"). La mutación
aleatoria que la distingue afecta a la actividad de la enzima
lactato deshidrogenasa (Tabla 1). Esta mutación se induce mediante
un procedimiento de mutagénesis al azar utilizando mutágenos de tipo
químico, como el metanosulfonato de etilo (EMS) u otros, aunque la
forma de obtención no queda limitada a este procedimiento y
cualquier otro de los disponibles en el estado de la técnica puede
ser igualmente válido, incluyendo procedimientos de tipo físico,
químico, mediante técnicas recombinantes de ingeniería genética u
otras.
La selección de las cepas que contienen un
defecto en la actividad lactato deshidrogenasa se realiza en un
medio de cultivo sólido, de baja capacidad tamponante, conteniendo
sales de tetrazolio y de acuerdo con el procedimiento descrito en la
patente francesa FR2777905. En este medio las colonias derivadas de
cepas con un defecto en la actividad lactato deshidrogenasa
adquieren una coloración rojo/parda, por contraposición a la
coloración blanca/rosada de las colonias derivadas de cepas con la
actividad lactato deshidrogenasa intacta.
La cepa de la presente invención, presenta una
actividad de la enzima lactato deshidrogenasa que se encuentra en un
rango de entre 0,50-0,75 U/mg, es decir, inferior al
20% y, preferiblemente, inferior al 10%, de la actividad de dicha
enzima en la cepa madre (tabla 1).
En una realización particular de la presente
invención, la cepa CML B4, presenta además una actividad enzimática
NADH oxidasa que se encuentra en un rango de entre
0,60-0,70 U/mg, es decir, incrementada más de tres
veces, y preferiblemente al menos cinco veces, con respecto a la de
la cepa madre (Tabla 1).
La diferencias con la cepa madre descritas
arriba resultan en la producción de una cantidad de acetoína más de
diez veces superior a la producida por la cepa madre en las mismas
condiciones (Tabla 2). Por lo tanto, en una realización particular,
la cepa de la presente invención presenta una producción de acetoína
que se encuentra en un rango de entre 45-461 mM en
el medio de cultivo, para un procedimiento de fermentación en
discontinuo que contiene concentraciones iniciales de glucosa
comprendidas entre 10 y 100 g/L, respectivamente. A modo de ejemplo,
en un medio de cultivo estándar de los utilizados para cultivar
bacterias del género Lactococcus, tal como el medio
denominado M17, que contiene un 1% (peso/volumen) de un carbohidrato
como la glucosa, mientras la cepa madre produce una cantidad de
acetoína que alcanza en el medio de cultivo una concentración final
de entre 2 y 4 mM, la cepa superproductora produce hasta 45 mM de
acetoína (Tabla 2).
En otra realización particular, la cepa de la
presente invención presenta una producción de acetoína de 70 g/l en
el medio de cultivo, en un procedimiento de fermentación
semicontínuo que contiene 200 g de glucosa.
La presente invención provee al experto con un
procedimiento eficiente de producción de acetoína mediante
fermentación microbiana. Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención es un procedimiento de producción de acetoína, que
comprende la fermentación de carbohidratos por la cepa CML B4 en
condiciones de aerobiosis.
Dicho procedimiento se inicia con la inoculación
del medio a fermentar con la cepa CML B4 y comprende los pasos
de
- (a)
- Precultivo de la cepa CML B4.
- (b)
- Inoculación de un medio rico en carbohidratos con el precultivo obtenido en (a)
- (c)
- Fermentación de los carbohidratos del medio inoculado en (b) a 25-35ºC; pH 5,5-7,0 y concentración de oxígeno disuelto de 30-100%
- (d)
- Separación del medio fermentado en (c) de las células.
- (e)
- Opcionalmente, purificación de la acetoína vertida al medio durante la fermentación (c)
\vskip1.000000\baselineskip
Cualquier medio nutritivo conteniendo fuentes
asimilables de carbono y de nitrógeno, que permita el crecimiento de
la cepa CML B4 y la producción elevada de acetoína por ésta puede
ser utilizado. Entre las fuentes de carbono asimilables se pueden
utilizar, por ejemplo, sin que sea limitante, la glucosa, la
fructosa, la sacarosa, la lactosa, la galactosa y las melazas, bien
puras o en combinación. Entre las fuentes de nitrógeno asimilables
se incluyen por ejemplo, pero sin estar restringidas a ellas, el
extracto de carne, el extracto de levadura, los hidrolizados de
proteínas o peptonas de carne, de soja, de caseína y de proteínas de
lactosuero, y el líquido de maceración del maíz, que pueden ser
utilizadas en solitario o en combinación.
Si fuera necesario, porque no son proporcionadas
por alguno de los anteriores nutrientes, el medio nutritivo puede
suplementarse con otros nutrientes y factores de crecimiento, tales
como vitaminas y sales minerales, para asistir en el crecimiento del
microorganismo y promover la producción de acetoína. Las vitaminas
que pueden emplearse incluyen entre otras la piridoxamina, la
biotina, el ácido nicotínico, el pantotenato cálcico, la riboflavina
y el ácido lipoico, que pueden añadirse bien mediante mezclas
artificiales de composición conocida o bien a través del empleo de
preparaciones y extractos nutritivos complejos de origen natural
conteniendo tales vitaminas, como por ejemplo el extracto de
levadura u otros. Las sales minerales pueden seleccionarse
preferentemente del grupo formado por el fosfato y las sales de
potasio y magnesio.
El medio nutritivo puede también suplementarse
adicionalmente, si fuera necesario por la excesiva formación de
espumas durante el cultivo, con un agente antiespumante o un
tensioactivo, como por ejemplo los basados en silicona, aceites
vegetales, polietilenglicol y otros, de acuerdo a los métodos
conocidos.
El cultivo de la cepa CML B4 en el medio
nutritivo se puede llevar a cabo por medio de cualquier tecnología
estándar de cultivo aeróbico. Los métodos de cultivo en medios
nutritivos líquidos son los preferidos, particularmente los cultivos
en frascos agitados o en reactores del tipo de fermentadores o
quimiostatos.
El cultivo se puede realizar generalmente en un
intervalo de temperaturas comprendido entre 15ºC y 40ºC,
preferiblemente entre 25ºC y 35ºC, y el pH del medio se encuentra
generalmente entre 5 y 7,5, preferiblemente en el intervalo
6-7. El control del pH del medio, cuando sea
necesario su mantenimiento constante a un valor fijo, se puede
realizar mediante la adición al medio de cultivo de un agente
tamponante elegido entre cualquiera de los habitualmente utilizados
para tal fin, o mediante la adición de una base o un ácido, según
sea requerido uno u otro, para contrarrestar las acidificaciones o
alcalinizaciones, respectivamente, que el cultivo microbiano pudiera
ocasionar.
Las características aerobias del cultivo se
pueden garantizar mediante el aporte al medio de cultivo de oxígeno,
bien en forma de aire, oxígeno puro o mezclas de diferente
composición de ambos. En el caso de cultivos en frascos agitados, el
suministro de oxígeno se realiza mediante la agitación de los
recipientes de cultivo a una frecuencia comprendida entre 100 y 500
rpm, preferiblemente en el intervalo 200-300 rpm. En
el caso de la utilización de reactores de cultivo, el suministro de
oxígeno se puede realizar mediante el flujo a través del medio de
cultivo de una corriente de aire, oxígeno puro o mezclas de
diferente composición de ambos, tal que la concentración de oxígeno
disuelto esté comprendida en el intervalo 10-100%,
preferiblemente entre el 30 y el 90%, de la concentración de
saturación. La agitación del medio de cultivo en el reactor se puede
realizar con ayuda de un agitador de palas, operando a una velocidad
de giro entre 250 y 1000 rpm, preferiblemente en el intervalo
500-750 rpm.
La acetoína se acumula en el medio de cultivo
durante un periodo de 15-40 horas, preferiblemente
entre las 20 y 30 horas, desde el inicio del cultivo, que coincide
con el momento de la inoculación. Cuando se alcanza la máxima
producción de acetoína, que ocurre cuando el microorganismo ha
consumido la totalidad del carbohidrato disponible como fuente de
carbono, la fermentación se puede considerar concluida.
Una vez concluida la fermentación, las células
de la cepa CML B4 deben ser en primer lugar separadas del medio de
cultivo líquido. Tal separación se puede realizar preferentemente
mediante procedimientos físicos, tales como sedimentación por
centrifugación, filtración o cualquier otro de los disponibles en el
estado de la técnica.
La acetoína producida, que se encuentra disuelta
en el medio de fermentación, puede ser a continuación purificada o
utilizada directamente tal como se presenta en disolución acuosa, en
este último caso bien sin posterior modificación o bien tras
realizar un proceso de concentración. La purificación, en caso de
realizarse, puede llevarse a cabo empleando alguna de las técnicas
que el estado de la técnica ofrece, bien en solitario bien
combinando varias de ellas, entre las que se encuentran, entre
otras: destilación, precipitación, cristalización, pervaporación,
extracción liquido-líquido, extracción en fase
sólida, extracción con fluidos supercríticos, métodos
cromatográficos y otros.
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La acetoína producida mediante el procedimiento
que se describe en esta invención puede ser utilizada directamente,
como tal, como aditivo aromatizante por ejemplo en las industrias
alimentaria, cosmética o farmacéutica. Alternativamente, la acetoína
puede ser utilizada también en la industria química como molécula
precursora en la síntesis de otros productos químicos.
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La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitativos
de su alcance.
Microorganismos: Los microorganismos que se
utilizaron fueron bacterias ácido lácticas de las cepas L.
lactis subsp. lactis NCIMB 702118, cepa de tipo
silvestre, y L. lactis subsp. lactis CML B4, cepa
mutante derivada de la anterior y poseedora de una deficiencia en la
actividad enzimática lactato deshidrogenasa.
Medio de cultivo: Los cultivos de las cepas
empleadas se realizaron en medio M17 (Terzaghi, B.E. y Sandine, W.E.
(1975) Appl. Microbiol. 29; 807-813) o medio M17
doblemente concentrado, suplementados con diferentes concentraciones
de glucosa, entre 10 y 100 g/L, como fuente de carbono y energía. La
composición del medio M17 es la siguiente (en g/L): triptona, 2,5;
peptona de carne, 2,5; peptona de soja, 5,0; extracto de carne, 5,0;
extracto de levadura, 2,5; glicerofosfato sódico, 19,0; sulfato de
magnesio, 0,25; y ácido ascórbico, 0,50.
Los experimentos de producción de acetoína se
realizaron empleando dos tipos de cultivos.
A. Cultivos en frascos agitados: Los cultivos en
frascos agitados se realizaron en matraces erlenmeyer de 100 mL
conteniendo 20 mL de medio M17 suplementado con 10 g/L de glucosa.
Las condiciones de incubación fueron una temperatura de 30ºC y una
velocidad de agitación de 250 rpm. Los cultivos se iniciaron con la
inoculación del medio con una colonia crecida durante tres días en
placa conteniendo el mismo medio y solidificado con agar al 1,5%
(p/v).
B. Cultivos en fermentador: Los cultivos en
fermentador se realizaron en un fermentador de laboratorio Biostat
B-plus de la marca Sartorius, equipado con un
reactor de 2 L y una unidad de control de los diferentes parámetros
de fermentación. El reactor contenía 1 L de medio M17 doblemente
concentrado. En los cultivos en modo discontinuo la concentración
inicial de glucosa fue de 100 g/L. En los cultivos en modo
semicontínuo la concentración inicial de glucosa fue de 100 g/L y,
una vez consumida ésta, se les adicionó otros 100 g de glucosa por
cada litro inicial de medio. Las condiciones de fermentación fueron
una temperatura de 30ºC y una velocidad de agitación de 500 o 750
rpm. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo fija en un
valor del 30% con respecto a la concentración de saturación del
medio, mediante el suministro de un caudal de aire de 2 L/min, en
solitario o enriquecido con oxígeno puro, y cuya composición se
estableció automáticamente en cada momento según las necesidades. El
pH del medio durante la fermentación se fijó en diferentes valores
de experimento en experimento, y se mantuvo constante mediante la
adición automática de NaOH 5 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante la realización de los trabajos se han
utilizado las siguientes técnicas analíticas:
Medida de la concentración de acetoína: Su
determinación se realizó mediante el método de Westerfeld
(Westerfeld, W.W. (1945) J. Biol. Chem. 161:
495-502), modificado por Speckman y Collins
(Speckman, R.A. y Collins, E.B. (1982) Appl. Environ. Microbiol. 44:
40-43). A 5 mL de muestra, o de una dilución
apropiada de la misma, se añadió 1 mL de una solución de
\alpha-naftol al 5% (p/v) en NaOH 2,5 M y se
incubó durante 15 min. A continuación se añadió 1 mL de creatina al
1% (p/v) y se incubó durante otros 10 min para dejar desarrollar el
color. Transcurrido este tiempo, se midió la absorbancia del
sobrenadante a 535 nm y se comparó con una curva de calibrado
realizada con diferentes concentraciones de acetoína pura como
patrón. El ensayo mide conjuntamente las concentraciones de acetoína
y diacetilo, pero la presencia de este último es prácticamente
residual en las muestras analizadas.
Obtención de extractos celulares: El medio de
cultivos realizados durante 24 h se centrifugó a 13.000 rpm durante
15 min a 4ºC para separar las células bacterianas del medio líquido.
Después de lavar las células en tampón fosfato sódico 50 mM (pH
7,0), las bacterias se resuspendieron en el mismo tampón
concentradas 20 veces. A esta suspensión celular se añadió un
volumen igual de bolitas de vidrio (glass beads) y todo el
conjunto se sometió a tres rondas de agitación de 30 segundos con
agitador de tubos operando a la velocidad máxima, separadas por
periodos de reposo de 1 min en hielo. La suspensión resultante se
centrifugó a 13.000 rpm durante 15 min a 4ºC para eliminar los
restos celulares insolubles y las bolitas, y el sobrenadante se
empleó como extracto celular para realizar los ensayos de actividad
lactato deshidrogenasa y medida de la concentración de proteína.
\newpage
Medida de la actividad lactato deshidrogenasa:
Se realizó según el procedimiento descrito por Boumerdassi y Cols.
(Boumerdassi, H. y Cols. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:
2293-2299), mediante la medida de la disminución de
la absorbancia a 340 nm resultante de la oxidación del NADH. El
ensayo se realizó a 30ºC en tampón Tris-maleato 50
mM (pH 7,0) conteniendo 100 \muL de extracto celular, piruvato
sódico 10 mM, fructosa-1,6-difosfato
1 mM, y NADH 0,15 mM. Las actividades enzimáticas fueron corregidas
mediante la sustracción de las actividades NADH oxidasa,
determinadas bajo las mismas condiciones, pero en ausencia del
sustrato piruvato sódico. Una unidad de actividad lactato
deshidrogenasa es la cantidad de enzima que bajo las condiciones de
ensayo reduce 1 \mumol de piruvato a lactato por minuto.
Medida de la actividad NADH oxidasa: Se realizó
mediante la medida de la disminución de la absorbancia a 340 nm
resultante de la oxidación del NADH. El ensayo se realizó a 30ºC en
tampón Tris-maleato 50 mM (pH 7,0) conteniendo 100
\muL de extracto celular, y NADH 0,15 mM. Una unidad de actividad
NADH oxidasa es la cantidad de enzima que bajo las condiciones de
ensayo oxida 1 \mumol de NADH a NAD^{+} por minuto.
Medida de la concentración de biomasa: La
concentración de biomasa (en mg/mL) se determinó mediante la medida
de la absorbancia a 600 nm de suspensiones celulares
convenientemente diluidas. La absorbancia a 600 nm se relacionó con
la concentración de biomasa de la suspensión celular tras lavado de
ésta con agua y medida del peso seco de la suspensión resultante por
calentamiento a 80ºC hasta peso constante.
Medida de la concentración de proteína: La
concentración de proteína en los extractos celulares se determinó
mediante el método de Bradford (Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem.
72: 248-254), utilizando lisozima como patrón.
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Una colonia de la cepa de tipo silvestre L.
lactis subsp. lactis NCIMB 702118 se cultivó a 30ºC (250
rpm) en un frasco conteniendo 10 mL de medio M17 suplementado con
glucosa al 1% durante 24 horas. Las células se lavaron a
continuación en tampón fosfato potásico 100 mM (pH 7,5) dos veces y
se resuspendieron en 1 mL del mismo tampón. A esta suspensión
celular se añadieron 120 \muL del mutágeno químico metanosulfonato
de etilo y se incubó a 25ºC con suave agitación durante 15 min.
Transcurrido este tiempo las células se lavaron con 10 mL del mismo
tampón fosfato dos veces, se resuspendieron en 10 mL de medio M17
con glucosa al 1% y la suspensión se incubó a 30ºC con agitación
durante 1 hora. Finalmente, cantidades apropiadas de esta suspensión
o de diluciones suyas, tales que dieran lugar a
400-500 colonias por placa, se extendieron sobre
placas del medio de selección. El medio de selección empleado fue un
medio derivado del medio M17 con una menor capacidad tamponante, ya
que contenía tan sólo un 5% (0,95 g/L) del glicerofosfato sódico de
éste, y que además estaba suplementado con 10 g/L de
2,3,5-trifenil tetrazolio. En este medio las cepas
con una actividad lactato deshidrogenasa de tipo silvestre forman
colonias de color ligeramente rosado, mientras que las cepas con una
actividad lactato deshidrogenasa reducida forman colonias de color
rojo/pardo.
Se analizaron alrededor de 26.000 colonias,
obteniéndose cuatro colonias de color rojo/pardo en el medio de
selección, que se aislaron y analizaron para determinar su actividad
lactato deshidrogenasa y su capacidad de producción de acetoína. De
estas cuatro colonias se seleccionó finalmente la cepa L.
lactis subsp. lactis CML B4 puesto que era la que
mostraba los mayores niveles de producción de acetoína. En las
tablas 1 y 2 se muestra una comparación entre esta cepa mutante y la
cepa de tipo silvestre original.
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Un fermentador conteniendo 1 L de medio M17
doblemente concentrado suplementado con 100 g de glucosa fue
inoculado con 20 mL de un precultivo de 16 horas de la cepa CML B4
en medio M17 suplementado con glucosa a 10 g/L. La fermentación se
realizó a 30ºC; pH 5,5; concentración de oxígeno disuelto, 30%;
velocidad de agitación, 500 rpm. El valor de pH se mantuvo constante
mediante la adición de NaOH 5 M.
La concentración de acetoína máxima en el medio,
alcanzada a las 27 horas de cultivo, fue de 260 mM, con una
producción total de 25,20 g a partir de 100 g de glucosa, lo que
representa un rendimiento del 51,5% con respecto al máximo teórico
para esa cantidad de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fermentador conteniendo 1 L de medio M17
doblemente concentrado suplementado con 100 g de glucosa fue
inoculado con 20 mL de un precultivo de 16 horas de la cepa CML B4
en medio M17 suplementado con glucosa a 10 g/L. La fermentación se
realizó a 30ºC; pH 6,0; concentración de oxígeno disuelto, 30%;
velocidad de agitación, 500 rpm. El valor de pH se mantuvo constante
mediante la adición de NaOH 5 M.
La concentración de acetoína máxima en el medio,
alcanzada a las 27 horas de cultivo, fue de 298 mM, con una
producción total de 30,20 g a partir de 100 g de glucosa, lo que
representa un rendimiento del 61,7% con respecto al máximo teórico
para esa cantidad de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fermentador conteniendo 1 L de medio M17
doblemente concentrado suplementado con 100 g de glucosa fue
inoculado con 20 mL de un precultivo de 16 horas de la cepa CML B4
en medio M17 suplementado con glucosa a 10 g/L. La fermentación se
realizó a 30ºC; pH 6,5; concentración de oxígeno disuelto, 30%;
velocidad de agitación, 500 rpm. El valor de pH se mantuvo constante
mediante la adición de NaOH 5 M.
La concentración de acetoína máxima en el medio,
alcanzada a las 29 horas de cultivo, fue de 425 mM, con una
producción total de 39,32 g a partir de 100 g de glucosa, lo que
representa un rendimiento del 80,3% con respecto al máximo teórico
para esa cantidad de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fermentador conteniendo 1 L de medio M17
doblemente concentrado suplementado con 100 g de glucosa fue
inoculado con 20 mL de un precultivo de 16 horas de la cepa CML B4
en medio M17 suplementado con glucosa a 10 g/L. La fermentación se
realizó a 30ºC; pH 7,0; concentración de oxígeno disuelto, 30%;
velocidad de agitación, 500 rpm. El valor de pH se mantuvo constante
mediante la adición de NaOH 5 M.
La concentración de acetoína máxima en el medio,
alcanzada a las 29 horas de cultivo, fue de 398 mM, con una
producción total de 37,17 g a partir de 100 g de glucosa, lo que
representa un rendimiento del 75,9% con respecto al máximo teórico
para esa cantidad de glucosa.
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Un fermentador conteniendo 1 L de medio M17
doblemente concentrado suplementado con 100 g de glucosa fue
inoculado con 20 mL de un precultivo de 16 horas de la cepa CML B4
en medio M17 suplementado con glucosa a 10 g/L. La fermentación se
realizó a 30ºC; pH 6,5; concentración de oxígeno disuelto, 30%;
velocidad de agitación, 750 rpm. El valor de pH se mantuvo constante
mediante la adición de NaOH 5 M.
La concentración de acetoína máxima en el medio,
alcanzada a las 20 horas de cultivo, fue de 461 mM, con una
producción total de 43,06 g a partir de 100 g de glucosa, lo que
representa un rendimiento del 87,9% con respecto al máximo teórico
para esa cantidad de glucosa.
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Un fermentador conteniendo 1 L de medio M17
doblemente concentrado suplementado con 100 g de glucosa fue
inoculado con 20 mL de un precultivo de 16 horas de la cepa CML B4
en medio M17 suplementado con glucosa a 10 g/L. A las 20 horas de
cultivo, tras agotarse la glucosa incluida inicialmente, se
suministraron al medio otros 100 g de glucosa. La fermentación se
realizó a 30ºC; pH 6,5; concentración de oxígeno disuelto, 30%;
velocidad de agitación, 750 rpm. El valor de pH se mantuvo constante
mediante la adición de NaOH 5 M.
La concentración de acetoína máxima en el medio,
alcanzada a las 28 horas de cultivo, fue de 671 mM, con una
producción total de 72,42 g a partir de 200 g de glucosa, lo que
representa un rendimiento del 74,0% con respecto al máximo teórico
para esa cantidad de glucosa.
Claims (9)
1. Cepa bacteriana de Lactococcus lactis
lactis, derivada de la cepa silvestre NCIMB702118,
caracterizada porque su actividad lactato deshidrogenasa se
encuentra en un rango de entre 0,50-0,75 U/mg, que
ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo bajo el
número CECT 7512.
2. Cepa bacteriana según la reivindicación 1,
cuya actividad NADH oxidasa se encuentra en un rango de entre
0,60-0,70 U/mg.
3. Cepa bacteriana según alguna de las
reivindicaciones 1 ó 2 cuya producción de acetoína se encuentra en
un rango de entre 45-461 mM en el medio de
cultivo.
4. Cepa bacteriana según alguna de las
reivindicaciones 1 ó 2 cuya producción de acetoína es superior a 70
g/l en el medio de cultivo, para cultivos en semicontínuo.
5. Procedimiento de producción de acetoína, que
comprende la fermentación aeróbica de carbohidratos por una cepa
bacteriana según la reivindicación 1.
6. Procedimiento de producción de acetoína según
la reivindicación 5 que comprende los pasos de:
- (a)
- Precultivo de una cepa según la reivindicación 1.
- (b)
- Inoculación de un medio rico en carbohidratos con el precultivo obtenido en (a)
- (c)
- Fermentación de los carbohidratos del medio inoculado en (b) a 15-40ºC; pH 5,5-7,0
- (d)
- Separación del medio fermentado en (c) de las células.
- (e)
- Opcionalmente, purificación de la acetoína vertida al medio durante la fermentación (c).
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7. Procedimiento de producción de acetoína según
alguna de las reivindicaciones 5 ó 6, donde el carbohidrato
utilizado comprende moléculas de glucosa, fructosa o sacarosa.
8. Procedimiento de producción de acetoína según
alguna de las reivindicaciones 5-7, donde el paso
(c) de fermentación se realiza en un rango de saturación de 02 de
entre el 30-100%.
9. Procedimiento de producción de acetoína según
alguna de las reivindicaciones 5-7, donde la
concentración inicial de carbohidrato es igual o superior a 100
g/L.
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| ES200930561A ES2352633B8 (es) | 2009-08-04 | 2009-08-04 | Cepa mutante de lactococcus lactis lactis y método para la producción industrial de acetoína. |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018019656A1 (en) * | 2016-07-19 | 2018-02-01 | Fundacion Tecnalia Research & Innovation | Bacterial strain producing 2,3-butanediol and other metabolites |
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0430406A2 (en) * | 1989-11-28 | 1991-06-05 | Meiji Milk Products Company Limited | Method for the fermentative production of diacetyl and acetoin using lactic acid bacterium |
| WO1998007843A1 (en) * | 1996-08-22 | 1998-02-26 | Chr. Hansen A/S | Metabolically engineered lactic acid bacteria and their use |
| FR2777905A1 (fr) * | 1998-04-23 | 1999-10-29 | Agronomique Inst Nat Rech | Bacteries surproductrices d'alpha-acetolactate, et procede d'obtention |
-
2009
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0430406A2 (en) * | 1989-11-28 | 1991-06-05 | Meiji Milk Products Company Limited | Method for the fermentative production of diacetyl and acetoin using lactic acid bacterium |
| WO1998007843A1 (en) * | 1996-08-22 | 1998-02-26 | Chr. Hansen A/S | Metabolically engineered lactic acid bacteria and their use |
| FR2777905A1 (fr) * | 1998-04-23 | 1999-10-29 | Agronomique Inst Nat Rech | Bacteries surproductrices d'alpha-acetolactate, et procede d'obtention |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BOUMERDASSI, H. et al.: "Effect of Citrate on Production of Diacetyl and Acetoin by Lactococcus lactis ssp. lactis CNRZ 483 Cultivated in the Pressence of Oxygen", J. Dairy Sci., (1997), vol. 80, pp.: 634-639; todo el documento * |
| KLEEREBEZEM, M et al.: "Lactic Acid Bacteria as a Cell Factory: Rerouting of Carbon Metabolism in Lactococcus lactis by Metabolic Engineering" & Enz. Microbiol. Technol. (2000), vol. 26, pp.: 840-848; todo el documento. * |
| LbPEZ DE FELIPE, F et al.: "Pyruvate Flux Distribution in NADH-Oxidase-Overproducing Lactococcus lactis Strain as a Function of Culture Conditions", FEMS Microbiology Letters, (1999), vol. 179, pp.: 461-466; todo el documento. * |
| MONNET C et al.: " Selection and Properties of Lactobacillus Mutants Producing +/--Acetolactate", J. Dairy Sci., (1998), vol. 81, pp.: 2096-2102; todo el documento. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018019656A1 (en) * | 2016-07-19 | 2018-02-01 | Fundacion Tecnalia Research & Innovation | Bacterial strain producing 2,3-butanediol and other metabolites |
| CN109563471A (zh) * | 2016-07-19 | 2019-04-02 | 腾亚研创 | 产生2,3-丁二醇和其他代谢物的细菌菌株 |
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