JP6999641B2 - 2,3-ブタンジオール及び他の代謝物を産生する細菌株 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子操作によって得られる微生物の分野に属する。特に、本発明は、化学、医薬品及びバイオ燃料産業における広範囲の用途を有する分子である2,3-ブタンジオール及びアセトインを産生する高い能力によって特徴付けられる、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)種に属する新しい乳酸菌株に関する。
2,3-ブタンジオール(2,3-BDO)は、広範囲の化学物質の製造における構成要素としての使用を含む、燃料及び化学の分野において大きい可能性を示す化学物質である。それは、溶媒、不凍剤、液体燃料並びに多数の合成高分子及び樹脂の製造のための単量体として用いることができる。それは、エタノールの発熱量(29,100Jg-1)及びメタノールの発熱量(22,100Jg-1)に類似し、27,200Jg-1の発熱量を有することから、液体燃料及び燃料添加剤として好適となる。さらに、それは、その高オクタン数から、ガソリンにおけるオクタンブースターとして役立ち得る。2,3-BDOは、印刷インク、芳香剤、燻蒸剤、スパンデックス、湿潤剤及び柔軟剤、可塑剤の生産において、また医薬品用担体としてもさらなる有望な用途が見出される。
この欠点を解決することを意図して、本発明は、2,3-BDOを産生する向上した能力を有するRG1細菌株と、前記株を得るための方法と、高い収率及び生産性を有し且つ工業的に実現可能である、前記株を用いる効率的な発酵方法とを提供する。さらに、驚くべきことに、この同じ株は、用いられる培養条件に応じて他の代替的な代謝物、特にアセトイン及び乳酸を産生することが見出されている。
(a)本発明の第2の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH5.0~7.5及び5~100%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
(a)本発明の第2の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH5.0~7.5及び10~90%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
(a)本発明の第2の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH5.5~6.0及び5~100%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
(a)本発明の第2の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH5.5~6.0及び10~90%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
(a)本発明の第2の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH6.5~7.5及び30~100%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
(a)本発明の第2の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH6.0~7.5及び嫌気性条件下において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
本発明は、あくまで例示目的で与えられ、決して本発明を限定するように意図されない以下の実施例により、さらに例示される。
微生物:本発明で用いられる微生物は、L.ラクティスCML B4(スペイン特許第2352633B1号)、L.ラクティスCML B3及びL.ラクティス43103細菌株であった。これらのすべての株は、L.ラクティス野生型株NCIMB 702118に由来する。
L.ラクティス突然変異体株B3の単離
L.ラクティス野生型株NCIMB 702118の単一コロニーを、1%グルコース添加M17培地(Terzaghi BE, Sandine WE,“Improved medium for Lactic Streptococci and their bacteriophages”, Appl. Microbiol., 1975, vol. 29, pp. 807-813;組成物:トリプトン、2.5g/L;肉ペプトン、2.5g/L;大豆ペプトン、5.0g/L;肉抽出物、5.0g/L;酵母抽出物、2.5g/L;グリセロリン酸ナトリウム、19.0g/L;硫酸マグネシウム、0.25g/L;及びアスコルビン酸、0.50g/L)を10mL含有する100mLのエルレンマイヤーフラスコ内において、30℃(250rpm)で24時間培養した。細菌細胞を100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中での遠心分離/再懸濁により2回洗浄し、最後に同じ緩衝液1mLに再懸濁した。これに化学変異原エチルメタンスルホン酸(EMS)の濃縮細胞懸濁液120μLを添加し、得られた懸濁液をゆっくりと振盪させながら25℃で15分間インキュベートした。次に、細胞を再び同じリン酸カリウム緩衝液10mLで2回洗浄し、1%グルコースを有するM17培地10mLに再懸濁し、振盪下で1時間インキュベートした。
L.ラクティス43103株の単離
L.ラクティス43103株は、突然変異体株L.ラクティスB4及びB3のプロトプラストの融合を通したゲノム混合の方法を用いて得た。
異なるpH値でのL.ラクティス43103株によるてんさい糖蜜培地の好気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Bに従い、L.ラクティス43103株を用いて、7.0~5.5の異なるpH値において、炭素源としててんさい糖蜜を含有する炭水化物リッチ培地の一連の好気性発酵を実施した。溶解酸素濃度を30%、攪拌速度を750rpmに設定した。代謝物の産生の結果を表2に示す。
pH5.5並びに溶解酸素濃度及び攪拌速度の異なる値でのL.ラクティス43103株によるてんさい糖蜜培地の好気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Bに従い、L.ラクティス43103株を用いて、pH5.5並びに10~30%の溶解酸素濃度及び500~750rpmの攪拌速度の異なる値において、炭素源としててんさい糖蜜を含有する炭水化物リッチ培地の一連の好気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表3に示し、ここで、過去に30%の溶解酸素及び750rpmで得られた値を参照として含める。
pH5.5でのL.ラクティス43103株による異なる炭素源を含有する培地の好気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Bに従い、L.ラクティス43103株を用いて、pH5.5、10%の溶解酸素濃度及び750rpmの攪拌速度において、炭素源として純粋なグルコース、グルコースシロップ又は純粋なスクロースのいずれかを含有する炭水化物リッチ培地の一連の好気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表4に示す。
pH6.0でのL.ラクティス43103株によるグルコースを含有する培地の好気性フェドバッチ発酵
一般的方法セクションに記載の方法Cに従い、L.ラクティス43103株を用いて、pH6.0、10%の溶解酸素濃度及び750rpmの攪拌速度において、炭素源としてグルコースを含有する炭水化物リッチ培地のフェドバッチモード下で好気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表5に示す。
L.ラクティス43103株によるてんさい糖蜜培地の嫌気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Bに従い、L.ラクティス43103株を用いて、炭素源としててんさい糖蜜を含有する炭水化物リッチ培地の嫌気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表5に示す。
Haessler, T., et al.“Enhanced fed-batch fermentation of 2, 3-butanediol by Paenibacillus polymyxa DSM 365”Bioresource technology 2012 vol.124, pp. 237-244
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Zhang YX, et al.“Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria”, Nature 2002, vol. 415, pp. 644-646
フランス特許第2777905号
スペイン特許第2352633B1号
Terzaghi BE, Sandine WE,“Improved medium for Lactic Streptococci and their bacteriophages”, Appl. Microbiol., 1975, vol. 29, pp. 807-813
1.ラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株を産生するための方法であって、2つのラクトコッカス・ラクティス親株であって、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、(a)アセトイン及び/又は2,3-ブタンジオールを産生する増大した能力と、(b)乳酸を産生する低下した能力とを示す2つのラクトコッカス・ラクティス親株からの2つのプロトプラストを融合するステップを含む方法。
2.ラクトコッカス・ラクティス親株の各々は、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株に突然変異誘発処理を施すことによって得られる、請求項1に記載の方法。
3.突然変異誘発処理は、エチルメタンスルホン酸(EMS)を用いて実施される、請求項2に記載の方法。
4.好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、ラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、アセトインを産生する増大した能力を有し、及び他方は、2,3-ブタンジオールを産生する増大した能力を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
5.プロトプラスト融合ステップを受ける2つのラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、アセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、受託番号CECT 7512下でSpanish Type Culture Collectionに寄託されたラクトコッカス・ラクティスCML B4株である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
6.プロトプラスト融合ステップを受ける2つのラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、2,3-ブタンジオール及びアセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、ラクトコッカス・ラクティスCML B3株である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
7.請求項1~6のいずれか一項に記載の方法によって入手可能なラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株。
8.受託番号CECT 9139下でSpanish Type Culture Collectionに寄託されている、請求項7に記載のラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株。
9.2,3-ブタンジオールを産生する方法であって、請求項7~8のいずれか一項に定義される細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法。
10.以下のステップ:
(a)請求項7~8のいずれか一項に定義される株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH5.5~6.0及び5~100%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、請求項9に記載の2,3-ブタンジオールを産生する方法。
11.ステップ(d)から得られた無細胞発酵培養液中に存在する2,3-ブタンジオールを精製するステップをさらに含む、請求項10に記載の2,3-ブタンジオールを産生する方法。
12.アセトインを産生する方法であって、請求項7~8のいずれか一項に定義される細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法。
13.以下のステップ:
(a)請求項7~8のいずれか一項に定義される株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH6.5~7.5及び30~100%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、請求項12に記載のアセトインを産生する方法。
14.ステップ(d)から得られた無細胞発酵培養液中に存在するアセトインを精製するステップをさらに含む、請求項13に記載のアセトインを産生する方法。
15.乳酸を産生する方法であって、請求項7~8のいずれか一項に定義される細菌株による炭水化物リッチ培地の嫌気性発酵を含む方法。
Claims (6)
- 受託番号CECT 9139下でSpanish Type Culture Collectionに寄託された株である、ラクトコッカス・ラクティス。
- 2,3-ブタンジオールを産生する方法であって、請求項1に記載の細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含み、当該方法が以下のステップ:
(a)請求項1に記載の株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH5.5~6.0及び5~100%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された前記培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、方法。 - ステップ(d)から得られた前記無細胞発酵培養液中に存在する前記2,3-ブタンジオールを精製するステップをさらに含む、請求項2に記載の2,3-ブタンジオールを産生する方法。
- アセトインを産生する方法であって、請求項1に記載の細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含み、当該方法が以下のステップ:
(a)請求項1に記載の株を予備培養するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
(c)20~40℃、pH6.5~7.5及び30~100%の溶解酸素濃度において、ステップ(b)で接種された前記培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
(d)ステップ(c)から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、方法。 - ステップ(d)から得られた前記無細胞発酵培養液中に存在する前記アセトインを精製するステップをさらに含む、請求項4に記載のアセトインを産生する方法。
- 乳酸を産生する方法であって、請求項1に記載の細菌株による炭水化物リッチ培地の嫌気性発酵を含む方法。
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