JPS6027389A - 乳酸桿菌属の細菌のプロトプラストの融合、再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、乳酸桿菌属の細菌のプロトプラスト融合及び
再生方法に関する。より詳細には、二種類の乳酸桿菌属
の細菌のプロトプラストに対して融合促進剤及び三糖類
の存在下において、融合処理を施してから、血清成分と
三糖類を含有する乳酸桿菌属細菌用液体培地にて希釈し
、次いで、これをそのまま若しくはインキュベートした
後、血清成分と三糖類を添加した乳酸桿菌属細菌用寒天
培地に簡布し、培養することを特徴とする乳酸桿菌属の
細菌のプロトプラストの融合及び再生方法に係わるもの
である。

乳酸桿菌属の細菌は、ヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズ
などに代表される発酵乳製品の製造、漬物やサイレージ
の製造、あるいは、発酵法による乳酸の生産などの分野
で広範囲に利用されている産業上有用な微生物であるに
もかかわらず、大腸菌や枯草菌に比べて、遺伝子工学上
の技術開発の進展が著しく遅れていることから、これら
の細菌に関しても、新技術の開発が強（切望されている
のが現状である。

本発明者らは、先に、乳酸桿菌属の細菌のプロトプラス
トを調製することに成功したが、さらに、これらの細菌
に関して、産業上有用な遺伝子工学関連技術を開発すべ
く、研究を重ねた結果、従来、報告例のなかった、乳酸
桿菌属の細菌に関するプロトプラストの融合及び再生に
成功して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の目的は、二種類の乳酸桿菌属の細菌
のプロトプラストに対して融合処理を施した後、この融
合細胞を完全に再生するための技術を提供することであ
る。

コノような目的を達成するために採用される本発明の構
成は、二種類の乳酸桿菌属の細菌のプロトプラストに対
して、融合促進剤としての、ポリエチレングリコールな
どと浸透圧調節物質としての、三糖類の存在下にて融合
処理を施した後、血清成分と三糖類、好適には、蔗糖を
含有する乳酸桿菌属細菌用液体培地にて希釈し、次いで
、これをそのまま若しくはインキュベートした後、血清
成分と三糖類、好適には、蔗糖を添加した乳酸桿菌属細
菌用寒天培地に塗布して、培養することから成るもので
ある。

続いて、本発明の構成について、さらに、詳細に説明す
れば以下の通りである。

本発明の構成要素の一つである乳酸桿菌属の細菌には、
全ての種のものが含まれるが、代表的な種を例示すると
、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ目ｕｓ
　ｃａｓｅｉ、以下ラクトバチルスは、Ｌ、と略記する
）、Ｌ、アシドフィルス（旦ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　
）、Ｌプルガリクｘ　（Ｌ、　ｂｕｔ　ａｒｉｃｕｓ）
、Ｌ、　５り？　イｙ、　（Ｌ、　Ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ
、　ヘ／ｌ／パティカｘ　（Ｌ、　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕ
ｓ）　、Ｌ、サリバリウス（ｈｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）
　、Ｌ、プランタルム（Ｌ、　ｐｌａｎｔａｒｕ＋ｎ）
、Ｌ、　７７−１７９　ム（Ｌ、　ｆｅｒ＋ｎｅｎｔｕ
ｍ）、Ｌ、セロビオ−サス（Ｌ、ｃｅ目ｏｂｉｏｓｕｓ
）、Ｌ、デルプレツキ　（Ｌ、　ｄｅ［ｂｒｕｅｃｋｉ
ｉ）、Ｌ、ブヒネリ（、Ｌ、　ｂｕｃｈ　−一凹υ）、
Ｌ、ブレビｘ　（Ｌ、　ｂｒｅｖｉｓ）などがある。

これらの乳酸桿菌属の細菌のプロトプラスト化は、例え
ば、乳酸桿菌属の細菌に対して、ストレプトマイセス・
グロビスポラス（主江蛙Ｖビシ宏１−■糖Ｄμ工駐）が
生産するエンド−Ｎ−アセチルムラミダーゼを、乳糖、
蔗糖などの三糖類の存在下にて作用させることによって
、達成されることが知られている。

次いで、調製した二種類の細菌のプロトプラストに対し
て、融合促進剤及び浸透圧調節物質としての三糖類、好
適には、蔗糖の存在下にて融合処理を施すが、その際、
融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール
を使用することができる。後述の実験例１の結果は、ポ
リエチレングリコール４０００（平均分子量４０００）
及びポリエチレングリコール６００Ｇ　（平均分子量６
０００）が最適であることを示している。そして、この
ポリエチレングリコールの濃度は２０〜６０％が好適で
あり、とりわけ、３０〜５０％が至適である。

さらに、この際、三糖類が蔗糖である場合には、その濃
度に関しては、使用する菌種あるいは菌株に応じて、０
．５〜１．０Ｍ程度とするのが望ましい。

融合処理時間に関しては、後述の実験例２の結果は、１
０分以内が好適であり、とりわけ、２〜６分程度が至適
であることを示している。そして、この融合処理は、室
温（１０〜３０℃）あるいは３７”Ｃ前後にて実施され
る。

次に、作製した融合細胞を再生させるべく、これを、血
清成分と蔗糖等の三糖類を含有する乳酸桿菌属細胞用液
体培地にて希釈し、その希釈された培地をそのまま、又
は３７℃前後にてインキュベートした後、さらに、培養
処理を施して、コロニーを形成させる。その際、使用さ
れる血清成分に関しては、後述の実験例３の結果は、子
牛血清や子牛胎児血清も利用できるが、特に、馬血清が
最も望ましいことを示している。

そして、馬血清の添加濃度は、１０９６以下が好ましり
、１５９６を越えると、効力の低下が認められる。二軸
類が蔗糖である場合には、その濃度は、融合処理におけ
る濃度と同じでよい。乳酸桿菌属細菌用培地としては、
通常的な培地の使用が可能であるが、例えば、ロゴサの
培地（Ｊ、　Ｉｎｆ。

Ｄｉｓ、　１１０．２５８−２６７　（１９６２））や
改変ドフリース培地（培地１１！中、ニュトリエントブ
ロス（Ｄ；　ｆｃｏ）　１２ｇ、酵母エキス　５ｇ、ツ
イーン８０　Ｌ　Ｏ＋ｎ／、に２ＨＰＵ４　３　ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４１，５ｇ、グルコース　０．４ｇ、　ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２００，１ｇ　、　Ｍｎ５Ｕ４　・４　Ｈ２
ＯＯ，０２５ｇを含み、最終ｐＨ６，８）が好適である
。

また、インキュベート時間は、１〜８時間、好ましくは
、２〜３時間程度である。

かかるインキュベートにより、融合細胞の一部は再生さ
れるが、さらに、再生を完全なものとするためには、引
き続き、前述の血清成分と蔗糖等の三糖類を加えた、乳
酸桿菌属細菌用寒天培地を使用して常法に従って培養す
る。

以上の構成を採用することにより、融合細胞を完全に再
生することが可能になるばかりか、融合細胞をコロニー
として得ることも可能になるものである。

なお、上述のインキュベートは必須の処理ではなく、こ
れを省いて直接的に培養を行ってもよい。

続いて、実験例及び実施例を示して本発明をさらに具体
的に説明すれば以下の通りである。

なお実験例における供試菌株は、Ｌ、ファーメ７９　ム
（Ｌ、　ｆａｒｍｅｎｔｕｍ）　ＬＦ６０１及びり、フ
ァー　ｌ　７　タム（ＴＪ、　ｆａｒ＋ｎｅｎｔｕ＋ｎ
）　ＬＦ　６１０であり、ＬＦ　６０１　はエリスロマ
イシン耐性とテトラサイクリン耐性を有し、　ＬＦ６１
０はストレプトマイシン耐性とりファンピシン耐性を有
している。

これを、それぞれ下記のように表示する。

ＬＦ　６０１　（Ｅ＋ｎｒ、　’Ｉ’ｃｒ）ＬＦ　６１
０　（Ｓｍｒ、　ｆ（ｉｆｒ）く実験例１〉 前記供試菌を改変ドフリース培地（ｄｅｖｒ　ｉｅ　ｓ
’＋ｎｅｄｉｕ＋ｎ、組成は前述した通り。）にて、３
１℃で一夜培養し、４０００Ｘｇ　５分間の遠心分離に
より集菌し、２０＋ｎＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）で２回洗浄後、１．０Ｍ蔗糖を含む２Ｇ＋ｎＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に３．０ｍｇ湿重ｉ
／＋ｎｌとなるように懸濁した。次いで、０．２μｇ／
＋ｎ／のストレプトマイシン・プロビスポラスが生産す
るＮ−アセチルムラミダーゼＳＧ（大日本製薬社製、生
化学工業社販売）と３０μｇ／ｍ／の卵白リゾチームを
添加し、３７℃にて３０分間微弱振蕩しつつ処理して各
供試菌のプロにｌＸ１０９個／ｍｌとなるように再び懸
濁し、各々の０．２＋ｎ／を混合し、その混合液に対し
て１．０Ｍ蔗糖中に各種ポリエチレングリコールを種々
の濃度に含有する液２＋ｎＩ！を加え、３７℃にて６分
間放置した。６分経過後、１０９６（Ｖ／ｖ　）馬血清
と１Ｍ蔗糖を含有するロゴサの培地（）Ｌｏｇｏ−ｓａ
’　ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　）　７＋ｎ／をさらに加え、次
いで、その２＋ｎＩ！に同じ培地を５＋ｎ／加え、３７
℃にて２時間インキュベートした。この液の０．２＋ｎ
ｒを、ストレプトマイシン（５００＋ｎｇ／ｌり、テト
ラサイクリ：ｙ　（２０＋ｎｇ１０及び１０９６馬血清
、１Ｍ蔗糖を含有するロゴサの寒天培地上に塗布して、
培養した後、該寒天培地車に形成されたコロニー数を計
測した。その計測結果を第１表に示す。

かかる計測結果によれば、ポリエチレングリコール４０
００及びポリエチレングリコール６０００が融合促進剤
として最も適しており、その温度としては、２０〜６０
９６、とりわけ、３０〜５０％が至適であることが判明
した。

なお、上述のロゴサの培地の組成は、下記の通りである
。

ロゴサ培地１１！中に、 トリプティカーゼ（Ｔｒｙｐｔ　１ｃａｓｅ　）　−・
−・−１０ｇ酵母エキス　・・・・・・・・・・・・・
・・　５ｇトリプトース　（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ）　・・
・・・・・−・・・・　３ｇＫ２ＨＰＯ４・・・・・・
・・・・・・・・・　３ｇＫ　１−１２　Ｐ　０４　・
・・・・・・・・・・・・・・　３ｇクエン酸アンモニ
ウム　・・・・・・・φ・・・・・・・　２ｇツイーン
（Ｔｗｅｅｎ）　８０　・・・・・・・・・・・−・・
　１ｇ酢酸ナトリウム・３Ｈ，０・・・・・・・・・・
・・・・・１．７ｇグルコース　・・・・・・・・・・
・・・・・２０ｇシスティン−ＨＣ／　・・・・・・・
・・・・・・・・０．２ｇを含有し、ｐＨｓ、　６〜６
．８に調節されている。

第１表　融合に及ぼすポリエチレングリコールの種類、
濃度による影響（数値はプ ロトプラスト１０６個当りのコロニー数を示す） く実験例２〉 実験例１と同様の処理により、調整した各プロトプラス
トの懸濁液釜０．２＋ｎ／を混合し、その混合液に対し
て１．．０Ｍ蔗糖溶液中にポリエチレングリコール６０
００を４０％　（Ｗ／）含有する液２ｒｎＩ！を加え、
３１℃にて、０〜１０分間処理した。以下、実験例１と
同様の処理によって、形成されたコロニー数を計測した
。その判定結果を第２表に示す。かかる計測結果によれ
ば、処理時間は、１０分以内、とりわけ、２〜６分が至
適であることが判明した。

第２表　融合に及ぼす融合処理時間の影響く実験例３〉 実験例１と同様の処理により、調整した各プロトプラス
ト懸濁液各０．２１ｒｌ／を混合し、その混合液に対し
て、１．０Ｍ蔗糖中にポリエチレングリコールｓｏｏθ
を５０９６（ｗ／）含有する液２＋ｎｌを■ 加え、３７℃にて６分間処理し、第３表に示した各種の
血清成分と１Ｍ濃度の蔗糖を含有するロゴサの培地ＴＩ
ｎｔをさらに加え、次いで、その２ｍ／に同一組成の培
地６＋ｎｌ！を加えて、３１℃にて３時間インキュベー
トした。この液の０．２＋ｎｌを、ＳＯＯ＋ｎｇ／ｌの
ストレプトマイシン、２Ｑ＋ｎｇ／ｌのテトラサイクリ
ン、１Ｍの蔗糖及び各種血清成分を含むロゴサの寒天培
地上に塗布し、形成されたコロニー数を計測した。その
計測結果を第３表に示す。

かかる計測結果によれば、子牛血清や子牛胎児血清の使
用も効果的ではあるが、馬血清の使用が最も効果的であ
ることが判明した。

そして、馬血清の添加濃度は、１０％以下が好ましく、
１５９６を越えると、再生頻度の低下が認められた。

第３表　融合細胞の再生頻度に及ぼす各種血清成分の影
響 続いて、本発明の詳細な説明すれば以下の通りである。

（実施例１） 実験例と同一の供試菌を用いて、実験例１と同様の処理
により、調整した各プロトプラストの懸濁液を１．Ｑｒ
ｎｌづつ混合し、その混合液に対して１．０Ｍ蔗糖溶液
中にポリエチレングリコール６０００を５Ｌ％　（ｗ／
）含有する液２．０１ｎ／を加え、■ 室温（２４℃）にて６分間処理した。６分経過後、１０
％（ｖ／ｖ）馬面清と１．　（１Ｍ蔗糖を含有するロゴ
サの培地７＋ｎ／を、さらに加え、次いで、その２＋ｎ
Ｉ！に同一培地を６奮ｎ／加え、３７’ｅにて２時間イ
ンキュベートした。この液の０．２１ｎ／をストレプト
マイシン（５００＋ｎｇ／　ｌ　）　、リファンピシン
（２０＋ｎｇ／ｌり　、１（１％（ｖ／ｖ）馬血清及び
１．０Ｍ蔗糖を含むロゴサの寒天培地上に塗布し、３７
℃にて、培養して形成されたコロニーの各薬剤耐性を調
べた。その結果、全コロニーの平均５２．８％は４剤耐
性を示し、平均２９．４％がテトラサイクリン、ストレ
プトマイシン、リファンピシン、の３剤耐性を示した。

また、平均６．９％はエリスロマイシン、ストレプトマ
イシン、リファンピシンの３剤耐性を示し、ＬＦ６１０
ノ親株（Ｓ＋ｎｒ、Ｉｔ　ｉ　ｆ　ｒ）の残存は平均１
１．０％であった。

このことから、親株が融合されていることが判明した。

（実施例２） 供試菌株として、ストレプトマイシン耐性株であるＩＪ
、７フーメンタム（Ｌ、　ｆａｒ＋ｎｅｎｔｕ＋ｎ　）
ＬＦ　６０９　（５ｉｎｒ）と、フィラメンタス変異株
（ｆｉｌａ＋ｎ６ｎｔｕｓ　＋ｎｕｔａｎｔ　）であり
、かつ、リファンピシン耐性株であルＬＦ６１２　（Ｐ
ｉｔ、１Ｌｉｆ’）とを用いて、実施例１と同様の融合
処理及び再生処理を施した。

ただし、寒天培地には、抗性物質の添加を行わなかった
。

そして、このとき、形成されたコロニーを、薬剤耐性及
びコロニー形態の観察に基づいて、親株２種を含む７種
類に分類した。

その分類結果を第４表に示す。

第４表 （実施例３） 供試菌株として、Ｌ、プランタルム（Ｌ、　ｐｌａｎ　
−ｔａｒｕ＋ｎ）　ＹＩＴＯＩＱｌと、Ｌ、カゼイ　パ
リアントラムノーサｘ　（Ｌ、　ｃａｓｅｉ　ｖａｒｉ
ａｎｔ　ｒｈａ＋ｎｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ７４６９（Ｓ
＋ｎｒ）を用いて、実施例１と同様の融合処理及び再生
処理を施した。

ただし、再生培地としては、馬血清、蔗糖、ストレプト
マイシン（５００＋ｎｇ　／　ｚ　）及び唯一の炭素源
として１９６ラムノースを含む培地を使用した。

その結果は、第５表に示すように、親株以外に６種類の
融合株がコロニーを形成した。

第５表 なお、第５表中の符号は以下のように定義される。

（１１Ｓ＋ｎ感受性の欄における Ｓ・・・・・・・・・感受性 ｒ・・・・・・・・・耐性 （２）糖発酵性の欄における ＋・・・・・・・・・酸を生産する −・・・・・・・・・酸を生産しない （３）　１０％エタノール増殖性の欄における＋・・・
・・・・・・増殖する ー・・・・・・・・・増殖しない 東京都港区東新橋１丁目１番１９ 号株式会社ヤクルト本社内 ０発　明　者　務台方彦 東京都港区東新橋１丁目１番１９ 号株式会社ヤクルト本社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）二種類の乳酸桿菌属の細菌のプロトプラストを、
   融合促進剤及び三糖類の存在下において、融合処理後、
   血清成分と三糖類を含有する乳酸桿菌属細菌用液体培地
   にて希釈し、次いで、これをそのまま若しくはインキュ
   ベートした後、血清成分と三糖類を添加した乳酸桿菌属
   細菌用寒天培地で培養することを特徴とする乳酸桿菌必
   論菌のプロトプラストの融合、再生方法。
2. （２）融合促進剤が、ポリエチレングリコールである特
   許請求の範囲第（１）項記載の乳酸桿菌属の細菌のプロ
   トプラストの融合、再生方法。
3. （３）　ポリエチレングリコールの平均分子量が、４０
   ０Ｇ　−６０００である特許請求の範囲第（２）項記載
   の乳酸桿菌属の細菌のプロトプラストの融合、再生方法
   。
4. （４）血清成分が、馬血清である特許請求の範囲第（１
   ）項記載の乳酸桿菌属の細菌のプロトプラストの融合、
   再生方法。