CN106119229A - 从银耳栽培废料中分离纤维素酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶技术领域，具体涉及一种从银耳栽培废料中分离纤维素酶的方法。从银耳栽培废料中分离纤维素酶的方法，包括以下步骤：银耳栽培废料的预处理、超声波浸提、纤维素粗酶的制备和纯化四个步骤；采用超声处理银耳栽培废料，使料液充分作用，同时超声波破碎菌糠菌丝细胞壁作用增加，缩短提取时间，有助于纤维素酶溶出，最大限度保存纤维素酶的活力，为银耳栽培废料中的纤维素酶规模化生产及应用提供依据；本方法利用含有纤维素酶的银耳菌糠进行分离纯化，利用来源丰富、价格低廉的银耳栽培废料，不但具有变废为宝、保护环境的作用，而且降低了纤维素酶制取成本，提高农业生产带来的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于酶技术领域，具体涉及一种从银耳栽培废料中分离纤维素酶的方法。
背景技术
随着银耳产业的不断发展，也随之产生大量的银耳栽培废料。按照我国目前的生产规模，每年将有10万吨栽培废料产生，特别以老产区和规模生产区居多。如将其产后栽培废料在环境中自然堆弃，不进行及时妥善的处理，会滋生多种危害银耳生产的生物，将会给食用菌生产的发展带来极大的隐患，轻则造成环境污染，影响以后种菇的产量和质量，重则导致病虫害大量蔓延与危害，造成严重减产甚至绝收。在银耳菌生长过程中菌丝体会分泌大量纤维素酶来分解栽培料中的纤维素物质，以获得生长需要的碳源和能源。在菌菇培养时期纤维素酶活性一般不易失活，整个栽培期间栽培料中会积累较多的纤维素酶活力。因此，在银耳收货后的废弃栽培块中通常含有一定活力的纤维素酶。
纤维素酶是指能水解纤维素的β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素降解为纤维素二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是由多个水解酶组成的复杂酶系。纤维素酶主要由真菌、细菌和放线菌等微生物产生，除了蜗牛、蚂蚁等少数动物外，高等动物体内不产生纤维素酶。纤维素酶自从被发现起就受到世界各国生物界的重视，现在纤维素酶应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开发、废水处理及饲料等各个领域，应用前景非常广阔。目前商品纤维素酶的来源主要是通过发酵法来生产的，生产成本较为昂贵，限制了其广泛应用。
纤维素酶常采用缓冲液浸提法、水浸提法或改良的水浸提法。缓冲液浸提法由于成本高，不适于规模化生产。水浸提法效率低，由于浸提时间较长，可能会造成酶水解。改良的水浸提法用高速组织捣碎机，菌糠内含物释放较多，黏度高，增加了后续处理的难度，同样不利于规模化生产。
到目前为止，还没有从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶的方法公开报道，本发明中从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶的方法，不但具有变废为宝、保护环境的作用，而且降低了纤维素酶制取成本，提高农业生产带来的经济效益。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶的方法，采用超声处理银耳栽培废料，使料液充分作用，同时超声波破碎菌糠菌丝细胞壁作用增加，缩短提取时间，有助于纤维素酶溶出，最大限度保存纤维素酶的活力，为银耳栽培废料中的纤维素酶规模化生产及应用提供依据。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
从银耳栽培废料中分离纤维素酶的方法，包括以下步骤：
1)银耳栽培废料的预处理：将银耳栽培废料混合粉碎得预处理料；
2)提取：向步骤1)所述的预处理料中加入含有乙酸-乙酸钠缓冲液和Triton X-100的混合液，充分混合后采用超声波浸提，再经过滤、离心后得到浸提酶液；
3)粗酶的制备：取步骤2)所述的浸提酶液经中空纤维膜过滤器截留后浓缩，再进行盐析得纤维素酶的固体酶泥。
本发明通过单因素和正交试验分析了影响银耳栽培废料中纤维素酶得率的工艺条件，确定了合适的预处理料与混合液的重量比、超声浸提和制备的相关参数，得到了具有较高酶活力的纤维素酶。
作为一种优选，所述银耳栽培废料选已经收获3-6茬银耳栽培废料，摘掉菌渣表面的菇蕾，切除霉变及腐烂部分，间歇式混合碾压粉碎得预处理料。
进一步，步骤2)所述预处理料与所述混合液的重量比为1：4-1：8。
作为一种优选，所述预处理料与所述混合液的重量比为1：6。
进一步，步骤2)所述混合液中乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为0.2mol/L，pH4.5-5.5。
进一步，步骤2)所述混合液中Triton X-100的体积百分数为0.2％。
进一步，步骤2)所述混合液还包括pH为4.5-5.5的磷酸-柠檬酸缓冲液，所述磷酸-柠檬酸缓冲液浓度为0.2mol/L。
进一步，步骤2)所述超声波浸提的时间为10-60min，温度为15-35℃，超声波功率为150-250w。
作为一种优选，步骤2)所述超声波浸提的时间为30min，超声波功率为250KW。
进一步，步骤3)所述的中空纤维膜过滤器截留的为分子质量为10000D的物质。
最为一种优选，经中空纤维膜过滤器截留后浓缩至原体积的1/5。
进一步，步骤3)所述盐析所用的试剂为硫酸铵。
作为一种优选，所述盐析所用的试剂为固体硫酸铵粉末。
进一步，步骤3)所述盐析采用分段盐析，通过缓缓加入所述硫酸铵至不同的饱和度设置盐析段，每盐析段经10℃、10000r/min离心20min。
进一步，所述从银耳栽培废料中分离纤维素酶的方法还包括步骤：
4)纯化：对步骤3)所述的固体酶泥采用双水相体系萃取法，获得提纯后的纤维素酶。
作为一种优选，所述双水相体系为聚乙二醇6000-硫酸铵双水相体系。
通过双水相体系萃取得到的纤维素酶纯度高，相比粗酶液提纯后的提纯倍数可达到4.8倍。
经对比实验发现，经超声辅助处理的浸出液经离心，收集上清液，经膜浓缩和硫酸铵盐析获得酶泥，再经过双水相萃取，各步骤分离纯化结果见下表：
优化浸纯纤维素酶的结果
本发明的目的之二在于提供一种纯化纤维素酶的试剂，所述试剂包括提取液和双水相体系，所述提取液为含有乙酸-乙酸钠缓冲液和Triton X-100的混合液；所述双水相体系为22％聚乙二醇6000-硫酸铵双水相体系。用本发明的纯化纤维素酶的试剂来提纯纤维素酶，可得到高纯度的纤维素酶。
纤维素酶活力的测定方法：在3mL0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)中加入1m0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液作底物，恒温50℃后，加酶液1mL反应，保持反应10min，加2mL3,5－二硝基水杨酸显色剂100℃水浴显色10min后，在550nm波长出测定吸光度，并对照标准葡萄糖曲线查得葡萄糖含量，计算酶活力。
酶活力单位的定义：实验反应条件下，以1mL酶液在1min内水解生成1μg葡萄糖为1个酶活力单位(U)。
酶活力/(U/mL)＝Gn×1000/10
式中：G为测出显色液吸光度A550nm在葡萄糖曲线上查得的葡萄糖质量/mg；n为酶的稀释倍数；1000为mg与μg单位换算；10为反应时间/min。
蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝法。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶的方法，采用超声处理银耳栽培废料，使料液充分作用，同时超声波破碎菌糠菌丝细胞壁作用增加，缩短提取时间，有助于纤维素酶溶出，最大限度保存纤维素酶的活力，为银耳栽培废料中的纤维素酶规模化生产及应用提供依据；
2)本方法利用含有纤维素酶的银耳菌糠进行分离纯化，利用来源丰富、价格低廉的银耳栽培废料，不但具有变废为宝、保护环境的作用，而且降低了纤维素酶制取成本，提高农业生产带来的经济效益。
附图说明
图1为本发明从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶的方法的流程示意图。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例一 从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶
1)预处理：收集食用菌厂丢弃的已经收获3-6茬银耳栽培废料，摘掉菌渣表面的菇蕾，切除霉变及腐烂部分，间歇式混合碾压粉碎备用。
2)提取：取银耳栽培废料按料液比1：5加入提取液(含有乙酸-乙酸钠缓冲液和Triton X-100的混合液)，在分别在15℃、25℃、35℃，250w下超声浸提30min，用2层纱布过滤至常压下液体自然滤尽，滤液经5000r/min离心10min，得到浸提酶液。
经对比实验(表1)发现，按照料液比为1：5水浸提法对银耳栽培废料浸出，不同浸出温度对纤维素酶的浸出效果有一定的影响，结果表明：25℃时浸出效果较佳。
表1不同温度对纤维素酶活力的影响
实施例二 从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶
1)预处理：收集食用菌厂丢弃的已经收获3-6茬银耳栽培废料，摘掉菌渣表面的菇蕾，切除霉变及腐烂部分，间歇式混合碾压粉碎备用。
2)提取：取银耳栽培废料按料液比1：5加入提取液在25℃下超声浸提30min，用2层纱布过滤至常压下液体自然滤尽，滤液经5000r/min离心10min，得到浸提酶液。
所述提取液分别用蒸馏水、pH4.5-5.5乙酸-乙酸钠缓冲液+体积分数0.2TritonX-100、pH5磷酸-柠檬酸缓冲液
经对比实验(表2)发现，在25℃按照料液比为1：5对银耳栽培废料浸出30min，不同浸出液对纤维素酶的浸出效果有一定的差异，以pH5乙酸-乙酸钠缓冲液+体积分数0.2％Triton X-100为浸出液时，所得粗体液酶活力较高，浸出效果较佳。
表2不同浸出液对纤维素酶活力的影响
实施例三 从银耳栽培废料中分离纯化纤维素酶
1)预处理：收集食用菌厂丢弃的已经收获3-6茬银耳栽培废料，摘掉菌渣表面的菇蕾，切除霉变及腐烂部分，间歇式混合碾压粉碎备用。
2)提取：取银耳栽培废料按料液比1：5加入提取液(含有乙酸-乙酸钠缓冲液和Triton X-100的混合液)，在25℃，250w下超声浸提，用2层纱布过滤至常压下液体自然滤尽，滤液经5000r/min离心10min，得到浸提酶液。
所述超声时间分别为：10min、20min、30min、40min。
经对比实验(表3)发现，以pH5乙酸-乙酸钠缓冲液+体积分数0.2％Triton X-100为浸出液，按照料液比为1：5在250W下对银耳栽培废料超声浸出，银耳栽培废料经超声处理，纤维素酶活力提高，浸出时间缩短，因此选用超声辅助浸出纤维素酶。
表3不同超声处理时间对纤维素酶活力的影响
实施例四 提取方法中不同参数对纤维素酶活力的影响
经对比实验(表4)发现，在选用超声波辅助浸出银耳栽培废料中纤维素酶的前提下，超声功率250W、超声处理时间40min、料液比1:6、浸出液pH5四个工艺参数中，变动其中一个工艺参数都会对纤维素酶活力有较大影响。通过正交试验确定最佳的纤维素酶浸出条件：pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液+体积分数0.2％Triton X-100为浸出液，料液比为1：6，超声功率为250W，超声时间为30min，纤维素酶活力为165.66U/mg。
表4纤维素酶浸出条件优化正交试验设计及结果
通过表4可以看出，对纤维素酶比活力影响最大的是超声时间，其次是料液比和超声功率，影响最小的是浸出液和pH值。由表还可以得出纤维素酶最佳浸出条件为A2B2C3D3。根据这个做验证试验得出纤维素酶比活力为167.89U/mg，因此，纤维素酶的超声辅助浸出条件为：料液比1：6，浸出液pH5.0，超声时间为40min，超声功率为250w。
经对比实验发现，常规方法：在25度以pH5乙酸-乙酸钠缓冲液+体积分数0.2％Triton X-100为浸出液按照料液比为1：6对银耳栽培废料浸出2.5h，超声辅助方法：以pH5乙酸-乙酸钠缓冲液+体积分数0.2％Triton X-100为浸出液按照料液比1：6，在250w超声时间为40min，结果表明：常规方法所得纤维素酶活力为120.64U/mL，超声辅助所得纤维素酶活力为167.89U/mL，超声辅助有助于提高银耳栽培废料中纤维素酶的浸出。
实施例五 纤维素酶的活力测定
纤维素酶的活力测定方法，在3mL0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)中加入1m0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液作底物，恒温40℃后，加酶液1mL反应，保持反应10min，加2mL3,5－二硝基水杨酸显色剂100℃水浴显色10min后，在550nm波长出测定吸光度，并对照标准葡萄糖曲线查得葡萄糖含量，计算酶活力。
酶活力单位的定义：实验反应条件下，以1mL酶液在1min内水解生成1μg葡萄糖为1个酶活力单位(U)。
酶活力/(U/mL)＝Gn×1000/10
式中：G为测出显色液吸光度A550nm在葡萄糖曲线上查得的葡萄糖质量/mg；n为酶的稀释倍数；1000为mg与μg单位换算；10为反应时间/min。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.从银耳栽培废料中分离纤维素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)银耳栽培废料的预处理：将银耳栽培废料混合粉碎得预处理料；
2)提取：向步骤1)所述的预处理料中加入含有乙酸-乙酸钠缓冲液和TritonX-100的混合液，充分混合后采用超声波浸提，再经过滤、离心后得到浸提酶液；
3)粗酶的制备：取步骤2)所述的浸提酶液经中空纤维膜过滤器截留后浓缩，再进行盐析得纤维素酶的固体酶泥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述预处理料与所述混合液的重量比为：1：4-1：8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述混合液中乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为0.2mol/L，pH4.5-5.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述混合液中Triton X-100的体积百分数为0.2％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述超声波浸提的时间为10-60min，温度为15-35℃，超声波功率为150-250w。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的中空纤维膜过滤器截留的为分子质量为10000D的物质。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述盐析所用的试剂为硫酸铵。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述盐析采用分段盐析，通过缓缓加入所述硫酸铵至不同的饱和度设置盐析段，每盐析段经10℃、10000r/min离心20min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：4)纯化：对步骤3)所述的固体酶泥采用双水相体系萃取法，获得提纯后的纤维素酶。
10.一种纯化纤维素酶的试剂，其特征在于，所述试剂包括提取液和双水相体系，所述提取液为含有乙酸-乙酸钠缓冲液和Triton X-100的混合液；所述双水相体系为22％聚乙二醇6000-硫酸铵双水相体系。
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