CN101423825A - 从菌糠中制备纤维素酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，具体包括菌糠的预处理、菌糠纤维素酶的初步提取以及菌糠纤维素酶的纯化等步骤，经酶活测定，所制得的纤维素酶酶活1.5－3.5U。相对于其他所有有关纤维素酶生产方法的现有技术，该方法省去了菌体生长发酵和产酶的过程，节约了能源和材料，从而既做到了废物利用、改善环境，又能有效降低纤维素酶制取的成本。

Description

从菌糠中制备纤维素酶的方法

技术领域

本发明涉及纤维素酶的制备方法，尤其涉及一种以菌糠为原料制备纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(CB)。首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面，然后，EG在葡聚糖链的随机位点水解底物，产生寡聚糖；CBH从葡聚糖链的非还原端进行水解，主要产物为纤维二糖；而CB可水解纤维素二糖为葡萄糖。纤维素的降解过程需要这3种酶的协同作用。不同来源的纤维素酶其分子特征和催化活性不尽相同。

纤维素酶从被发现起就受到产业界的广泛关注。纤维素酶的应用已扩展到纺织(印染，2000，1，29—32)、日用化工、造纸(广西轻工业，1997，3，12—15)、食品发酵(广州化学，1996，4，8—14)、烟草、石油开采、废水处理及饲料(中国兽医学报，1999，1，84—88)等各个领域，其应用前景十分广阔。当今世界，能源和资源供应日趋紧张，人们都十分期望能借助纤维素酶将地球上最丰富(占全球总生物量80％)、最廉价的可再生资源纤维素转化为能直接利用的能源和资源。专家预测，针对扮演绿色化学品的纤维素酶的研究开发是新世纪的可再生性资源的关键技术之一。对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。

自然界中广泛地存在着能降解纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌、真菌和放线菌等，生产上以木霉(Trichoderma)及其近缘的菌株应用最为广泛。现有的纤维素酶生产方法主要是采用产纤维素酶的微生物进行发酵制备。

伍红等将诱变过的黑曲霉转于以麸皮、甘蔗渣等为主要原料的固体培养基上，采用固态发酵的方式制备纤维素酶(菌物学报，2006，3，475—480)。广泛用于纤维素酶制备的绿色木霉在固态条件下的产酶能力也较高(河南工业大学学报(自然科学版)，2007，1，46—48)。纤维素酶的固态发酵法虽然具备设备简单、投资少等特点，但其发酵水平不稳定、产酶效率低、且易污染杂菌，目前只能适于小规模制备。

哈茨木霉在麸皮为唯一碳源时，在相对较优条件下滤纸酶活为0.96U/mL(山东大学学报(理学版)，2005，3，110—115)。里氏木霉在50L全自动发酵罐中以较优的条件进行纤维素酶液体发酵，120hr后发酵液中纤维素酶的滤纸酶活达到48.9U/mL(1U定义为酶解反应中每分钟生成1.0μmol葡萄糖所需的酶量)(河南工业大学学报(自然科学版)，2006，5，47—50)。灵芝在PDY培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母膏5g，加水至1,000mL)中进行液体发酵，得纯化倍数提高了3.16倍的纤维素酶的羧甲基纤维素酶活为6.89U(1U定义为每1hr产生1.0mg还原糖所需的酶量)(南京理工大学学报，2006，3，356—360)。纤维素酶液体深层发酵培养具有条件容易控制、生产效率高和适于大规模生产等特点，但其需要使用系统设备进行发酵，工艺过程中控制参数较多，对技术人员的操作水平要求高，对于所要配制的设备也有相当高的要求，造成设备投入过大，不利于降低生产成本。

到目前为止，尚未见任何从废弃菌糠料中提取纤维素酶的相关现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，利用含有纤维素酶的菌糠为原料，使得农业生产中的废物得到有效再利用、改善环境，降低纤维素酶制取的成本。

菌糠是指以棉籽壳、木屑、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多种农作物秸秆、工业废料为主要原料栽培食用菌后的废弃培养基。食用菌菌丝在培养基中生长时，需要产生大量的纤维素酶来分解基质中的纤维素以获得营养，因此，废弃菌糠中含有丰富的纤维素酶。菌糠是用以培养食用菌，为食用菌生长提供必要的营养，菌糠的具体组成不能作为对本发明所述纤维素酶制备方法的限定。

工业废料主要选自于酒糟、醋糟、造纸厂废液及制药厂黄浆废液。

食用菌为人工培养或野生环境下可为生物食用的菌类，其生长过程中能分泌纤维素酶来分解基质中的纤维素以获得营养。所述食用菌主要选自于蘑菇(Agaricus campestris)、木耳(Auricularia auricula)、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、灵芝(Ganoderma lucidum)、金耳(Tremellaaurantialba)、鲍鱼菇(Pleurotus abalonus)、平菇(Pleurotus flabellatus)、金针菇(Flammulina velutipes)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)、鸡腿菇(Coprinus comatus)、白灵菇(Pleurotus nebrodensis)、香菇(Lentinus edodes)、茶树菇(Agrocybe aegerita)等。

本发明提供的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，包括菌糠的预处理、菌糠纤维素酶的初步提取和纤维素酶纯化几个步骤。

1、菌糠的预处理

先除去菌糠上层覆土或菌皮后加入增效剂，然后在20—30℃堆积发酵。

所用增效剂能调节体系pH值和碳/氮(C/N)比，促进菌糠中食用菌菌丝的二次生长，增加体系中纤维素酶产量。其选自于有机胺，具体选自于人或畜的尿液或尿素。

一种具体实施方式，当增效剂为人或畜的尿液时，其在每100kg菌糠中的通常加入量为1—5L，可进一步选择1.5—4L，当具体选择1.5、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8或4.0L时能够高效促进菌糠中食用菌菌丝的二次生长，增加体系中纤维素酶产量。

另一种具体实施方式，当增效剂为尿素时，其在每100kg菌糠中的加入量通常加入量为0.1—0.5kg，可进一步选择0.15—0.35kg，当具体选择0.15、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28、0.30、0.31、0.33或0.35kg时能够高效促进菌糠中食用菌菌丝的二次生长，增加体系中纤维素酶产量。

堆积发酵的时间通常为3—10天，可进一步选择4—8天，当具体选择5、6或7天时可以得到发酵完全的菌糠，且时间占用也较少。

一种具体实施方式，堆积发酵的时间为3—10天，或进一步选择4—8天时，以人或畜的尿液增效剂，每100kg菌糠中的加入量为1—5L，或进一步选择1.5—4L，或具体选择1.5、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8或4.0L时能得到后续工艺所需的含纤维素酶量较高的发酵菌糠。当堆积发酵的时间为5、6或7天时，能得到发酵完全且含纤维素酶量高的菌糠，更有利于后续工艺。

另一种具体实施方式，堆积发酵的时间为3—10天，或进一步选择4—8天时，以尿素为增效剂时，每100kg菌糠中的加入量加入量为0.1—0.5kg，或进一步选择0.15—0.35kg，或具体选择0.15、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28、0.30、0.31、0.33或0.35kg时能得到后续工艺所需的含纤维素酶量较高发酵菌糠。当堆积发酵的时间为5、6或7天时，能得到发酵完全且含纤维素酶量高的菌糠，更有利于后续工艺。

2、菌糠纤维素酶的初步提取

将步骤1所制得的发酵菌糠，用水浸泡，0—30℃浸泡5—48小时，进行固液分离，收集滤液即为菌糠纤维素酶的粗酶液。

发酵菌糠与浸泡用水的质量体积比通常为1∶1—20，可以进一步选择1∶1—10，当具体选择质量体积比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6或1∶8时能使发酵菌糠得到较好的浸泡效果。当质量体积比过低时，会使得浸泡出来的纤维素酶总量较少；而当质量体积比过大时，后续处理所用沉淀剂就会较多，增加处理成本。

最适浸泡时间为24—30小时；最佳浸泡温度为25—28℃。

一种具体实施方式，发酵菌糠与浸泡用水的质量体积比为1∶1—20，或进一步选择1∶1—10，配合以24—30小时浸泡时间和25—28℃浸泡温度，能得到纯化纤维素酶所需的粗酶液，提高生产效率，节省成本。

另一种具体实施方式，发酵菌糠与浸泡用水的质量体积比选择质量体积比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6或1∶8，并配合以24—30小时浸泡时间和25—28℃浸泡温度，能得到纯化纤维素酶所需纤维素酶含量高的粗酶液，进一步提高生产效率，更有效节省成本。

固液分离的方法主要为压滤、抽滤和离心，也可以选择离子交换色谱、疏水作用色谱和亲和色谱等分离方法。

3、菌糠纤维素酶的纯化

将步骤2所得粗酶液中加入(NH₄)₂SO₄或丙酮或乙醇进行沉淀，然后离心并收集沉淀物，然后将沉淀物溶于水中，得菌糠纤维素酶溶液，纤维素酶酶活为1.5—3.5U。所述酶活力定义为：在50℃，反应30min条件下，单位体积的粗酶液每小时释放出1μmol还原糖所需酶量为1个活力单位，用U表示。

当沉淀剂为(NH₄)₂SO₄时，其目的是将溶液中的纤维素酶沉淀出来。分离纯化相关教科书中关于硫酸铵盐沉淀法的一般技术即可实现此目的。

其具体的实施方式可以为，先将饱和度为30％(w/v)的(NH₄)₂SO₄加入粗酶液中，离心去除沉淀物。然后在上清液中再加入(NH₄)₂SO₄至饱和度达到80％(w/v)，离心收集沉淀物即为纤维素酶，酶活为1.5—3.5U。

沉淀剂为乙醇时，其目的是将溶液中的纤维素酶沉淀出来。分离纯化相关教科书中关于有机溶剂沉淀法的一般技术即可实现此目的。

其具体的实施方式可以为，先将乙醇加入粗酶液中，当其占总体积的百分比为30％(v/v)时，离心去除沉淀物。然后在上清液中再加入乙醇至其在总体积中的百分比为70％(v/v)，离心收集沉淀物即为纤维素酶，酶活1.5—3.5U。

沉淀剂为丙酮时，其目的是将溶液中的纤维素酶沉淀出来。分离纯化相关教科书中关于有机溶剂沉淀法的一般技术即可实现此目的。

其具体的实施方式可以为，先将丙酮加入粗酶液中，当占在总体积的百分比为35％(v/v)时，离心去除沉淀物。然后在上清液中再加入丙酮至其在总体积中的百分比为60％(v/v)，离心收集沉淀物即为纤维素酶，酶活为1.5—3.0U。

在以上三种沉淀方法中，以乙醇沉淀的效果较好；以硫酸铵处理时收率虽然较高，但纤维素酶溶液中含盐量亦高，而丙酮较乙醇更容易挥发，操作难度相对较大。

将所得纤维素酶沉淀溶于水中制成纤维素酶溶液，其质量体积比为1∶10—20，最适用量为1∶15。

本发明技术方案实现的有益效果：

从菌糠中制备纤维素酶，是菌糠资源化利用的一种新途径，是一种全新的纤维素酶制备方法，相对于其他所有已经报道过的有关纤维素酶生产方法，省去了菌体生长发酵和产酶的过程，节约了能源和材料，是所有已经报道过的有关纤维素酶生产方法中成本最低的。因此，利用废弃菌糠制备纤维素酶，既可以做到废物利用、改善环境，又可以降低纤维素酶制取的成本。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1  纤维素酶活测定方法

纤维素酶在适当条件下，水解羧甲基纤维素钠(CMC)产生还原糖，还原糖与3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应，发生颜色变化，显色基团在540nm处的吸光度值与产生的还原糖量成正比，即与各种酶活力成正比，用标准曲线法计算纤维素酶活力。

酶活力定义为：在50℃，反应30min条件下，单位体积的粗酶液每小时释放出1μmol还原糖所需酶量为1个活力单位，用U表示。

纤维素酶活的测定：取3支25mL的刻度试管，1支管作空白对照，2支管作平行样品管。取待测酶液1mL(空白对照中加的是经沸水浴煮沸10min已灭活的待测酶液)和1mL CMC溶液(w/v＝1％)加到刻度试管中，混均，50℃下保温30min。加入1.5mL DNS显色液，沸水浴10min。冷却后，用蒸馏水定容至25mL，然后在540nm下测吸光值，用标准曲线计算出该吸光值所对应的还原糖含量，即可根据酶活定义，得出样品中纤维素酶的活力单位。

实施例2  乙醇沉淀法制取菌糠纤维素酶

取100kg废弃菌糠，加入猪尿3L，堆积发酵4d，保持堆温于30℃。称取500g发酵菌糠，破碎后置于1500mL水中室温浸泡48hr减压抽滤去除固型物，收集滤液，此时所得滤液即为粗酶液，得粗酶液1300mL。在粗酶液中缓慢加入500mL浓度为95％(w/v)的乙醇，并均速搅拌，然后静置30min后离心去除沉淀，收集上清液；在上清液中再缓慢加入1500mL浓度为95％(w/v)的乙醇，并均速搅拌，静置30min后离心收集沉淀，将沉淀物用100mL蒸馏水溶解后即得菌糠纤维素酶溶液。用实施例1中方法测得其纤维素酶活力为2.36U。

实施例3  丙酮沉淀法制取菌糠纤维素酶

取100kg废弃菌糠，加入尿素0.3kg，堆积发酵5d，保持堆温于30℃。称取500g发酵菌糠，破碎后置于2000mL水中室温浸泡36hr减压抽滤去除固型物，收集滤液，此时所得滤液即为粗酶液，得粗酶液1800mL。在粗酶液中缓慢加入800mL丙酮(已经冷冻处理24hr)，并均速搅拌，然后静置30min后低温离心去除沉淀，收集上清液；在上清液中再缓慢加入2000mL丙酮(已经冷冻处理24hr)，并均速搅拌，静置30min后低温离心收集沉淀，将沉淀物用100mL蒸馏水溶解后即得菌糠纤维素酶溶液。用实施例1中方法测得其纤维素酶活力为2.86U。

实施例4  硫酸铵沉淀法制取菌糠纤维素酶

取100kg废弃菌糠，加入尿素0.3kg，堆积发酵5d，保持堆温于30℃。称取500g菌糠，破碎后置于500mL水中4℃浸泡48hr压滤去除固型物，收集滤液，此时所得滤液即为粗酶液，得粗酶液470mL。在粗酶液中缓慢加入82.7g硫酸铵，并均速搅拌，然后静置30min后离心去除沉淀，收集上清液；在上清液中再缓慢加入89.1g硫酸铵，并均速搅拌，静置30min后低温离心收集沉淀，将沉淀物用1000mL蒸馏水溶解后即得菌糠纤维素酶溶液。将上述所得酶液经过超滤处理去除小分子后，用实施例1中方法测得其纤维素酶活力为3.23U。

Claims (14)

1、一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于包括菌糠的预处理、菌糠纤维素酶的初步提取以及菌糠纤维素酶的纯化。

2、根据权利要求1所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述方法具体为：

1)菌糠的预处理，先除去菌糠上层覆土后加入增效剂，然后在20—30℃堆积发酵；

2)菌糠纤维素酶的初步提取，将步骤1所制得的发酵菌糠，用水浸泡，0—30℃浸泡5—48小时，进行固液分离，收集滤液即为菌糠纤维素酶的粗酶液。

3)菌糠纤维素酶的纯化，将步骤2所得粗酶液中加入(NH₄)₂SO₄或丙酮或乙醇进行沉淀，然后离心并收集沉淀物，然后将沉淀物溶于水中，得菌糠纤维素酶溶液。

3、根据权利要求2所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的增效剂为人或畜的尿液或尿素。

4、根据权利要求3所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的增效剂为人或畜的尿液时，每100kg菌糠中增效剂的加入量为1—5L。

5、根据权利要求3所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的增效剂为人或畜的尿液时，每100kg菌糠中增效剂的加入量为1.5、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8或4.0L。

6、根据权利要求3所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的增效剂为尿素时，每100kg菌糠中增效剂的加入量为0.1—0.5kg。

7、根据权利要求3所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的增效剂为尿素时，每100kg菌糠中增效剂的加入量为0.15、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28、0.30、0.31、0.33或0.35kg。

8、根据权利要求2所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的发酵时间为3—10天。

9、根据权利要求2所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的发酵时间为5、6或7天。

10、根据权利要求2所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的发酵菌糠与浸泡用水的质量体积比为1∶1—20。

11、根据权利要求2所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的发酵菌糠与浸泡用水的质量体积比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6或1∶8。

12、根据权利要求2所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的浸泡时间为24—30小时。

13、根据权利要求2所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所述的浸泡温度为25—28℃。

14、根据权利要求1—13之一所述的一种从菌糠中制备纤维素酶的方法，其特征在于所制得的纤维素酶酶活为1.5—3.5U。