CN101045918A - 栓菌ah28－2固态发酵生产漆酶的方法 - Google Patents

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一种栓菌AH28－2固态发酵生产漆酶的方法，是将栓菌AH28－2菌株种液接种在经灭菌的固体培养基上于20～28℃条件下发酵培养20～30天。固体培养基由3～5份油料作物秸秆、1～3份粮食麸皮、1～2份花生壳粉和2～6倍质量的水组成，自然pH。发酵结束后加水浸提，经沉淀除杂、超滤浓缩和冻干得到块状漆酶，酶活在8000U/g(ABTS法)以上。

Description

栓菌AH28-2固态发酵生产漆酶的方法
一、技术领域
本发明涉及一种工业用酶的制备方法，确切地说是用栓菌AH28-2固态发酵生产漆酶的方法，属于应用微生物的技术领域。
二、技术背景
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，能够催化氧化多种酚类和非酚类化合物的氧化，同时伴随着氧还原成水。漆酶广泛存在于植物、细菌、昆虫，特别是白腐真菌中。漆酶作用底物广泛、催化效率高，在生物制浆和漂白、纺织染料的降解和转化、纺织纤维的软化细化、新型药物开发、新型生物传感器的研制及新型能源开发等领域具有潜在重要应用价值，近年来成为国际酶工程学和环境科学交叉领域研究的热点之一[洪宇植，肖亚中等.Trametes sp.AH28-2漆酶A的诱导合成及其基因5′-端调控区的克隆与分析.生物工程学报，2005，21(4)：548-552；缪静，姜竹茂.漆酶的最新研究进展.烟台师范学院学报(自然科学版)，2001，17(2)：146-150；王华等.真菌漆酶及其在环境污染控制中的应用.环境科学技术，2003，26(4)：58-60]。
目前，真菌漆酶大多采用人工合成培养基液态深层发酵进行制备，制备过程中需要添加芳香类化合物和/或重金属离子作为诱导物，成本高，产量低；并且，毒性诱导物的引入使得发酵液后处理难度大，易造成环境污染，难以进行大规模工业化生产[肖亚中等.影响白腐真菌AH28-2菌株漆酶合成的因子和发酵条件.生物工程学报，2001，17(5)：579-583；王佳玲等.白腐菌漆酶的研究进展.微生物学通报，1998，25(4)：233-236；芦国营等.固态发酵生产木质素酶研究进展.饲料工业，2005，26(10)：29-33]。
固态发酵(Solid-state fermentation)技术是利用天然底物为碳源及能源，或利用惰性底物作固体支持物，在体系少水的条件下进行的发酵过程[徐福建等.固态发酵技术在资源环境中的应用.生物技术通报，2002，3：27-30]。与液体发酵工艺相比，固态发酵生产漆酶具有以下优点：(1)培养基简单且来源广泛，多为廉价的天然基质或工业生产的下脚料；(2)设备投资少，能耗低，发酵的产率较高；(3)酶合成无需毒性物质诱导，后加工处理方便，环境污染少。另外，固态发酵的过程一般不需要严格的无菌操作。因此，固态发酵技术是实施真菌漆酶绿色高效生产的重要途径之一[吴其飞等.固态发酵新技术与反应器的研究进展.饲料工业，2003，24(8)：43-47；徐福建等.固态发酵工程研究进展.生物工程进展，2002，22(1)：44-48]。近年来，国外学者开展了相关初步研究(表1)。
                          表1固态发酵生产木质素酶
  基质 所用微生物   木质素酶种类
  Bagasse(蔗渣) Pleurotus ostreatus(平菇)Phanerochaete chrysosporium(黄孢原毛平革菌)   漆酶，锰过氧化物酶木素过氧化物酶
  Banana waste(香蕉废弃物) P.ostreatus(平菇)Pleurotus sajor-caju(环柄侧耳)   漆酶，木素过氧化物酶
  Canola roots Cyathus olla(杏鲍菇)   漆酶，锰过氧化物酶
  Corn(玉米) Lentinus edodesstrain CS-495(香菇)Pleurotus pulmonarius(凤尾菇)   漆酶
Cotton(棉花) P.ostreatus(平菇)Pleurotus cystidiosus(鲍鱼菇)P.pulmonarius(凤尾菇)Pholiota nameko(滑菇)P.chrysosporium(黄孢原毛平革菌)，Funalia trogil 漆酶，锰过氧化物酶纤维素酶，SOD
Grape(葡萄) Daedaleopsis confragosa(粗糙拟迷孔菌)Marasmius allaceusP.chrysosporium(黄孢原毛平革菌) 漆酶，锰过氧化物酶
  Olive millwastewater(橄榄液废水) P.tigrinus 漆酶，锰过氧化物酶
  麸皮 Fomes sclerodermeus   漆酶
  Sawdust(锯末) Coriolus hirsutus(粗毛云芝)   漆酶，锰过氧化物酶
Wheat bran(小麦麸皮)Wheat straw(小麦秸秆) P.pulmonarius(凤尾菇)P.ostreatus(平菇)P.chrysosporium(黄孢原毛平革菌)P.radiataPleurotus sp.(侧耳)P.ostreatus(平菇) 漆酶，锰过氧化物酶木素过氧化物酶
(S.Rodriguez Couto，MA.Sanroman.Application of solid-state fermentation to Ligninolyticenzyme production[J].Biochemical Engineering Journal，2005，22(3)：211-219)
国内学者对真菌漆酶的研究主要集中于液体发酵条件，以及漆酶的酶学性质等方面，固态发酵生产真菌漆酶鲜见报道，且实验菌株以变色多孔菌(Polyporus versicolor)为主[王佳玲等.白腐菌漆酶的研究进展.微生物学通报，1998，25(4)：233-236]。上世纪末，中科院广州化学研究所纤维素开放实验室以稻草为基本培养基，研究了外加营养碳源、氮源以及微量元素等对贝壳状革耳菌(Panus conchatus)产漆酶的影响，最高酶活为60U/g(ABTS法)[王彩华等.贝壳状革耳菌和黄孢平革菌固体培养酶系比较.微生物学报，1999，39(2)：127-131；胡平平，付时雨等.固体培养条件下外加营养碳源及微量元素对贝壳状革耳菌酶系产生的影响.纤维素科学与技术，2001，9(4)：44-50；胡平平，付时雨等.固体培养条件下氮源对Panus conchatus酶系及漆酶同工酶的影响.纤维素科学与技术，2001，9(1)：1-7；付时雨，余惠生.贝壳状革耳菌在固体及液体培养过程漆酶同工酶的产生研究.纤维素科学与技术，1998，6(3)：32-37]。王宏勋等报道，侧耳属白腐菌Pleurotus sp.在玉米秆和稻草秆基质上生长良好，但漆酶酶活很低；在木屑基质上生长较差，但漆酶酶活最高，可达4500U/g(ABTS法)[王宏勋等.不同秸秆基质中白腐真菌漆酶分泌动力学研究.华中科技大学学报(自然科学版)2005，33(8)：90-93]。靖德兵等采用均匀设计和双温度培养法进行彩绒革盖菌固体发酵生产木质素酶，研究发现在玉米浆和麸皮固体培养基上，少量Tween80有利于木质素酶的产生；在自然补给氧气、湿度60％的条件下，经过20天的发酵，风干并粉碎发酵曲，所得粗酶粉的漆酶活力为1216U/g(邻联甲苯胺法)[靖德兵等.彩绒革盖菌固体发酵生产木质素酶工艺优化研究.微生物学通报，2004，31(5)：19-23]。
三、发明内容
本发明使用申请人自主选育的新型漆酶高产菌株栓菌AH28-2进行固态发酵生产高酶活的漆酶。本方法包括种液制备、固体培养基的配制、灭菌、接种和发酵以及发酵后的后处理，其特征是按下述步骤进行：
a.种液制备：将栓菌AH28-2菌丝体接种在经灭菌处理的综合马铃薯液体培养基中，25～30℃摇床培养三天，匀浆制成菌悬液。
b.发酵产酶：将上述菌悬液以5～15％接种量接入固体培养基中，于20～28℃条件下发酵20～30天，环境湿度保持在40～70％。
c.漆酶制剂制备：向发酵完毕的培养物中加入15～30倍质量的蒸馏水，2～6℃浸提3～8小时，过滤；滤液经丙酮沉淀去杂，超滤浓缩10～20倍后冻干。
所述的固体培养基有以下组分和质量份数：
油料作物秸杆        3～5份
粮食麸皮            1～3份
花生壳粉            1～2份
水                  2～6倍。
所述的油料作物秸杆选自油菜秸杆、芝麻秸杆中的一种或两种混合秸杆，将其破碎至长3cm以下即可使用，优选油菜秸杆。
所述的粮食麸皮选自小麦麸皮、大米米糠等，可单独使用，也可混合使用，优选小麦麸皮。
花生壳粉过60目筛。
水即自来水，自然pH，按固体基质总质量的2～6倍加入。
优选的固体培养基为：
油菜秸杆            3～5份
小麦麸皮            1～3份
花生壳粉            1～2份
水                  2～6倍。
所述的后处理是发酵培养结束后向培养物中加入蒸馏水，加水量为初始固体基质质量的15～30倍，2～6℃下浸提3～8小时，过滤分离，滤液先经丙酮沉淀，去除杂质后超滤浓缩10～20倍，最后将浓缩液冷冻干燥即得块状漆酶制剂。
本发明操作简单，所用固体基质均为廉价的农副产品，漆酶生产过程中无需添加水以外的其它物质，成本极为低廉；以秸杆等农副产品为生产原料，不仅能够变废为宝，为秸杆等废弃物提供一条工业化应用的有效途径，还可减少因焚烧造成的环境污染。本方法制备的漆酶酶活高，浸提液酶活达2100U/g干培养物，冻干后酶粉的漆酶活力在8000U/g(ABTS法)以上。
申请人自主选育的栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)已于2005年11月22日送中国典型培养物保藏中心保藏。保藏号为CCTCC NO：M 205134。
四、具体实施方案
1.栓菌AH28-2菌悬液(种液)的制备
将在综合马铃薯培养基(CPDA：20％马铃薯汁、3‰KH2PO4、1.5‰MgSO4·7H2O、2％葡萄糖、0.04％VB1、2％琼脂)斜面上4℃保存的栓菌AH28-2接种于已高温灭菌的CPDA液体培养基(不加琼脂)中，28℃、100～200rpm培养2～3天，3000rpm匀浆约10s制成菌悬液。
2.培养基的制备
将干燥的油料作物秸杆破碎至长2厘米，备用。将干燥的花生壳粉碎过60目筛备用。
(1)取油菜秸杆2份，芝麻秸杆1份，小麦麸皮1份，花生壳粉1份，按固体基质质量的2～6倍量加入自来水，搅拌均匀，121℃灭菌40～60min，冷却后即可接种。
(2)取油菜秸杆2份，芝麻秸杆2份，小麦麸皮2份，米糠1份，花生壳粉2份，以后操作同例(1)。
(3)取油菜秸杆3份，芝麻秸杆2份，小麦麸皮2份，花生壳粉1份，以后操作同例(1)。
(4)取油菜秸杆3份，小麦麸皮1份，花生壳粉1份，以后操作同例(1)。
(5)取油菜秸杆5份，小麦麸皮3份，花生壳粉2份，以后操作同例(1)。
(6)取油菜秸杆3份，小麦麸皮1份，花生壳粉2份，以后操作同例(1)。
(7)取油菜秸杆3份，小麦麸皮3份，花生壳粉1份，以后操作同例(1)。
(8)取油菜秸杆5份，小麦麸皮1份，花生壳粉2份，以后操作同例(1)。
(9)取油菜秸杆5份，小麦麸皮3份，花生壳粉1份，以后操作同例(1)。
(10)取油菜秸杆4份，小麦麸皮3份，花生壳粉1.5份，以后操作同例(1)。
3.接种与发酵培养
将制备的菌悬液按5～15％质量分数接种于已灭菌的(1)～(10)的任一固体培养基中，20～28℃培养20～30天，至产酶高峰。
4.后处理
在漆酶高峰期向培养物加入蒸馏水，加入量约为初始固体基质质量的15～30倍；2～6℃浸提3～8小时，八层纱布过滤，滤液经20％丙酮沉淀去杂后，超滤浓缩10～20倍，再经冷冻干燥即可得到块状漆酶制剂。
5.具体操作例
1000毫升三角瓶中装入20g油菜秸杆，6g小麦麸皮和4g花生壳粉，加入自来水100ml，搅拌均匀，121℃灭菌40min；冷却后接8ml种液，24℃培养26天；向培养物中加入500ml蒸馏水，4℃浸提5h，浸提液漆酶活力达2100U/g干培养物；超滤浓缩15倍，经冻干，酶粉漆酶活力达8310U/g(ABTS法)。

Claims (3)

1、一种栓菌AH28-2固态发酵生产漆酶的方法，包括种液制备、固体培养基的配制、灭菌、接种和发酵以及发酵后的后处理，其特征在于按下述步骤进行：
a、种液制备：将栓菌AH28-2菌丝体接种在经灭菌处理的综合马铃薯液体培养基中，25～30℃摇床培养三天，匀浆制成菌悬液；
b、发酵产酶：将上述菌悬液以5～15％接种量接入固体培养基中，于20～28℃条件下发酵20～30天，环境湿度保持在40～70％；
c、漆酶制剂制备：向发酵完毕的培养物中加入15～30倍质量的蒸馏水，2～6℃浸提3～8小时，过滤；滤液经丙酮沉淀去杂，超滤浓缩10～20倍后冻干。
2、根据权利要求1所述的生产漆酶的方法，其特征在于：固体培养基的组分和质量份数如下：
油料作物秸杆                3～5份
粮食麸皮                    1～3份
花生壳粉                    1～2份
水                          固体基质的2～6倍。
3、根据权利要求1或2所述的生产漆酶的方法，其特征在于：固体培养基有以下组分和质量份数：
油菜秸杆                    3～5份
小麦麸皮                    1～3份
花生壳粉                    1～2份
水                          固体基质的2～6倍。
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