CN104818257B - 一种可可丛枝病菌漆酶及其工程菌、重组漆酶和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种可可丛枝病菌漆酶及其工程菌、重组漆酶和应用。该可可丛枝病菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码上述漆酶的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。该DNA序列在构建巴斯德毕赤酵母表达系统中应用。重组毕赤酵母工程菌是将表达载体pPICZαA‑6AA‑LacMP线性化后转化毕赤酵母获得。重组漆酶是将重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。该重组漆酶具有漆酶活性并对中性或碱性环境和卤素有较高的耐受性；实现了该漆酶在生物酶法合成阿魏酸多聚物中的应用。

Description

一种可可丛枝病菌漆酶及其工程菌、重组漆酶和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和环境生物领域，特别涉及一种可可丛枝病菌(Moniliophthora perniciosa)漆酶基因和该基因工程菌和该基因编码的漆酶在阿魏酸多聚物合成中的应用。

背景技术

漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductases，EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶(MCOs)家族，广泛分布在植物、真菌、少数细菌和昆虫中。漆酶的活性中心一般包含4个铜离子，漆酶的催化氧化反应即通过铜离子间的协同传递电子，夺取反应底物的电子，将底物氧化为自由基形式，同时将从底物捕获的电子传递给O₂，将O₂还原为水。漆酶作用的底物相当宽泛，典型的底物是各种酚类化合物及其衍生物，包括简单的二酚、多酚、甲氧基取代酚(如愈创木酚)、氨基酚、氯酚等。在小分子的介体物质存在下，漆酶可氧化的底物范围还将进一步扩大。由于漆酶作用底物的广泛性及以水作为唯一副产物,使得漆酶在绿色生物技术应用中有较好的应用前景，主要体现在芳香族化合物合成、食品和果汁加工、土壤和水体的生物除污、纸浆漂白等方面。

目前，已有不少研究报导利用生物酶法修饰苯酚类化合物可提高其性能，如提高抗氧化活性、改变化合物颜色等。阿魏酸可以被漆酶或过氧化氢酶氧化成多聚体，而且阿魏酸氧化产物比阿魏酸单体显示更好的抗氧化活性和更低的细胞毒性。

真菌漆酶的研究较为深入，但其反应pH一般在酸性范围，在碱性环境下容易失去活性，且对氯离子比较敏感；这使真菌漆酶在工业领域的应用受到一定的限制。来源于植物病原真菌的漆酶研究比较少，挖掘植物病原真菌漆酶可能存在的新的性能对于促进漆酶的工业应用具有重要价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种来源于可可丛枝病菌(Moniliophthora perniciosa)的真菌漆酶基因。

本发明按照毕赤酵母密码子偏好性对漆酶基因进行优化，并通过全基因合成得到该漆酶基因核酸序列，该漆酶基因的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。该漆酶基因能够在毕赤酵母(Pichia pastoris)实现高效表达。

上述漆酶基因在构建巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的应用，将上述漆酶基因及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中，具体包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO:2所述DNA连入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-LacMP，将编码6个氨基酸(ETEAEF)的核苷酸序列连入到重组载体pPICZαA-LacMP，得到表达载体pPICZαA-6AA-LacMP；

(2)通过将表达载体pPICZαA-6AA-LacMP化学转化E.coli Top10得到克隆菌株E.coli Top10/pPICZαA-6AA-LacMP。

一种重组毕赤酵母工程菌，将所述表达载体pPICZαA-6AA-LacMP线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得。

上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法如下：

将表达载体pPICZαA-6AA-LacMP经PmeI单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris)X33感受态细胞，并在YPD平板(含有100μg/L zeocin)进行阳性转化子筛选；以YPD平板上的转化子为模板，以PMPF(SEQ ID NO:3)和PMPR(SEQ ID NO:4)为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子接种到MM平板(含有0.2mM ABTS和0.1mM CuSO₄)进行活性鉴定，菌落周围出现深绿色反应圈的转化子为重组毕赤酵母工程菌Pichiapastoris X33/pPICZαA-6AA-LacMP。

一种重组漆酶，将上述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。其获得方法如下：

挑取重组毕赤酵母工程菌Pichia pastoris X33/pPICZαA-6AA-LacMP接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD₆₀₀接近6.0，于6000×g，4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD₆₀₀接近1.0，于25℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵4天后在6000×g，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组漆酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.4mM CuSO₄。

上述重组漆酶可应用于阿魏酸多聚物合成反应。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明的漆酶具有漆酶活性。同时还对获得的重组漆酶进行最适作用pH、pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性进行分析。结果显示该重组漆酶的最适工作pH在中性或碱性，而且中性和碱性条件下的pH稳定性非常好。

(2)本发明还涉及卤素对获得的重组漆酶的影响，结果显示该重组漆酶对卤素有比较高的耐受性。

(3)本发明的重组漆酶来源于Moniliophthora perniciosa，在成功地将这个新发现的漆酶基因在毕赤酵母中异源表达的基础上，对这个酶蛋白进行纯化和酶学性质研究；结果显示，该重组漆酶对中性或碱性环境和卤素有较高的耐受性。此外，实现了该漆酶在生物酶法合成阿魏酸多聚物中的应用。

附图说明

图1是纯化漆酶的SDS-PAGE分析图谱；其中，M：标准蛋白质分子量；1：纯化重组漆酶。

图2是纯化重组漆酶的(a)最适pH曲线和(b)pH稳定性曲线。

图3是纯化重组漆酶的(a)最适温度曲线和(b)温度稳定性曲线。

图4是不同浓度的卤素对纯化重组漆酶的影响。

图5是阿魏酸被漆酶氧化作用前后的(a)全波长扫描分析和(b，c)液相色谱分析图谱。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

新型漆酶基因的合成

以美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的基因库登录号：AFD97050氨基酸序列为基础，对该序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到新型漆酶基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，通过上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成，合成的基因克隆在pUC57质粒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)上，得到质粒pUC57-lacMP。

实施例2

含新型漆酶基因的重组质粒pPICZαA-6AA-LacMP及携带该质粒的菌株E.coliTop10/pPICZαA-6AA-LacMP的构建

根据新型漆酶基因的核苷酸序列设计PCR引物：正向引物PMPF(SEQ ID NO:3)：5'-GGAATTCGCTATTGGACCAGTTGCT-3'(下划线为EcoRI酶切位点)和反向引物PMPR(SEQ ID NO:4)：5'-ATTTGCGGCCGCCAAATCAGA GGCTGGAGTAG-3'(下划线为NotI酶切位点)。根据pPICZαA的α信号肽的核苷酸序列设计PCR引物：正向引物α-factor-6AAF(SEQ ID NO:5)：5'-TAT TCGAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT-3'(下划线为BstBI酶切位点)和反向引物α-factor-6AAR(SEQ ID NO:6)：5'-GGAATTCAAACTCAGCCTCAGT CTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'(下划线为EcoRI酶切位点，同时含有编码6个氨基酸(ETEAEF)的核苷酸序列)。

以实施例1中的质粒pUC57-lacMP为模板，PMPF和PMPR为引物进行PCR扩增，扩增的体系及反应程序如下所示：

PCR扩增体系	总体积50μL
		KOD FX聚合酶	1μL
2×KOD FX缓冲液	25μL
		dNTPs(2.5mM each)	10μL
PMPF(20μM)	1μL
		PMPR(20μM)	1μL
质粒pUC57-lacMP(20ng/μL)	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	11.5μL

扩增的反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，52℃退火30sec，68℃延伸1.5min，30个循环；68℃延伸5min，最后16℃保存。

获得的PCR产物使用QIAquick gel extraction kit试剂盒(QIAGEN公司)进行切胶回收。胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，与同样经过EcoRI和NotI双酶切的质粒pPICZαA用T4DNA连接酶(TaKaRa)22℃连接过夜，连接产物化学转化Escherichia coli(E.coli)Top10(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)，经博莱霉素(zeocin)抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经EcoRI和NotI双酶切鉴定正确后，得到重组质粒pPICZαA-LacMP。以pPICZαA为模板，α-factor-6AAF和α-factor-6AAR为引物进行PCR扩增，扩增的体系及反应程序如下所示：

PCR扩增体系	总体积50μL
		KOD FX聚合酶	1μL
2×KOD FX缓冲液	25μL
		dNTPs(2.5mM each)	10μL
α-factor-6AAF(20μM)	1μL
		α-factor-6AAR(20μM)	1μL
质粒pPICZαA(20ng/μL)	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	11.5μL

扩增的反应程序：94℃预变性5min；98℃变性10sec，52℃退火30sec，68℃延伸20sec，30个循环；68℃延伸5min，最后16℃保存。

将胶回收纯化后的PCR产物用限制性内切酶BstBI和EcoRI进行双酶切，与同样经过BstBI和EcoRI双酶切的重组质粒pPICZαA-LacMP用T4DNA连接酶22℃连接过夜，连接产物化学转化Escherichia coli(E.coli)Top10(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)，经博莱霉素抗性平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经BstBI和EcoRI双酶切鉴定正确后，得到重组表达质粒pPICZαA-6AA-LacMP。含有正确重组质粒pPICZαA-6AA-LacMP的克隆菌株E.coli Top10/pPICZαA-6AA-LacMP加15％(v/v)甘油于-80℃保存。

实施例3

新型漆酶生产菌株Pichia pastoris X33/pPICZαA-6AA-LacMP的构建及重组漆酶表达

将重组质粒pPICZαA-6AA-LacMP经PmeI单酶切线性化并纯化后电转化Pichiapastoris X33(购自美国Invitrogen英杰生命技术有限公司)感受态细胞，并在YPD平板(1％酵母提取物；2％胰化蛋白胨；2％葡萄糖；1.5％琼脂粉；含有100μg/L zeocin)进行阳性转化子筛选。将YPD平板上的转化子为模板，以PMPF(SEQ ID NO:3)和PMPR(SEQ ID NO:4)为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子接种到MM平板(1.34％YNB；4×10^-5％生物素；0.5％甲醇；1.5％琼脂粉；含有0.2mM ABTS和0.1mM CuSO₄)进行活性鉴定，菌落周围出现深绿色反应圈的转化子为重组毕赤酵母工程菌Pichia pastoris X33/pPICZαA-6AA-LacMP。

挑取3个重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基(1％酵母提取物；2％胰化蛋白胨；1.34％YNB；1％甘油；100mM pH6.0的磷酸缓冲液)，30℃，250rpm培养至OD₆₀₀接近6.0，于6000×g，4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基(1％酵母提取物；2％胰化蛋白胨；1.34％YNB；1％甲醇；100mM pH6.0的磷酸缓冲液；含有0.4mM CuSO₄)至起始OD₆₀₀接近1.0，于25℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％(v/v)甲醇。发酵4天后在6000×g，4℃离心5min回收发酵上清液。用亲和层析方法对发酵上清液的重组漆酶进行纯化。纯化方法参照HisTrap^TM FF crude 1mL(GE Healthcare，Sweden)操作指南。经纯化的重组漆酶在4℃保存。对纯化漆酶LacMP进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示。

实施例4

纯化的重组漆酶LacMP的酶学性质

漆酶酶活的测定方法：

以ABTS(ε₄₂₀＝36,000M^-1cm^-1)为底物，1mL反应混合液中，含1mM ABTS(2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)，100μL漆酶酶液和50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)，45℃水浴保温反应3min后，420nm处测定吸光度。其他用于漆酶活力分析的底物还有2mM愈创木酚(Guaiacol)(ε₄₆₅＝12,000M^-1cm^-1)、100μM丁香醛连氮(SGZ)(ε₅₂₅＝65,000M^-1cm^-1)和2mM2,6-DMP(2,6-二甲基苯酚)(ε₄₆₈＝49,600M^-1cm^-1)。

漆酶酶活力定义：以1min内催化氧化1μmol底物的量为1个酶活单位(U)。

漆酶活力计算公式：酶活(U/L)＝n×V_t×A/(ε×5×V_e/10⁶)；n：酶液稀释倍数；A：吸光度的变化值；V_t：酶反应液的总体积；V_e：酶反应液中酶液体积；ε：摩尔吸光系数。

最适pH和pH稳定性：以ABTS、丁香醛连氮、愈创木酚和2,6-DMP为底物，在45℃下测定LacMP在pH3.5～9.0(Britton–Robinson缓冲液)之间酶活的变化。将LacMP置于pH4.5～8.0的Britton–Robinson缓冲液中，30℃下处理24h，在pH6.0，45℃条件下测定被处理后的LacMP的酶活力，同时以等量未经处理的酶液作为正对照，活力设为100％。以ABTS、丁香醛连氮、愈创木酚和2,6-DMP为底物，测定LacMP在pH3.5～9.0范围下的酶活力，结果显示LacMP作用于ABTS、丁香醛连氮、愈创木酚和2,6-DMP的最适pH分别是6.0、7.5、6.5和6.5(图2a)，而且，LacMP在pH6.0～8.0环境下比较稳定，在经过24h处理后酶活力仍然可以保持67％以上(图2b)，显示出LacMP对中性或碱性环境有较高的耐受性。

最适温度和温度稳定性：将LacMP在pH6.0条件下，以1mM ABTS为底物，测定其在30℃～70℃范围内的酶活力变化。将LacMP分别在30℃～50℃处理40min后取出冰浴，并在pH6.0，45℃条件下测定被处理后的剩余LacMP的酶活力，同时以等量未经处理的酶液作为正对照，活力设为100％。结果显示，分别以ABTS，丁香醛连氮，愈创木酚和2,6-DMP为底物时LacMP的最适温度分别为60℃，45℃，45℃和55℃(图3a)，但LacMP在40℃以上的温度比较容易失活(图3b)。

不同浓度的卤素对纯化漆酶的影响：在不同浓度的NaCl(0～200mM)和NaBr(0～200mM)和NaF(0～100mM)存在的条件下，以1mM ABTS为底物，测定LacMP在pH6.0，45℃条件下酶活力变化。结果显示，使LacMP活力损失50％时NaCl和NaF的浓度分别是100mM和20mM，而200mM NaBr存在下LacMP活力仍能保持65％。相对于其他已发现的真菌漆酶，LacMP显示出比较高的对卤素的耐受性。

实施例5

纯化的重组漆酶LacMP对阿魏酸的氧化作用

在10mL体系中，含有5mM阿魏酸，0.1U/L LacMP和50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)。该反应体系在30℃反应5h后取出，对反应前后成分进行全波长扫描及液相色谱分析(HPLC)，如图5(a)。结果表明，LacMP可以作用于阿魏酸，且反应体系的颜色从无色透明变成棕黄色。阿魏酸在290nm和322nm处有明显的特征吸收峰，但经过LacMP氧化作用后该波长下的吸收峰有明显降低，如图5(b，c)。结果显示，在该反应条件下，LacMP可以将阿魏酸(FA)氧化，效率非常高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种重组漆酶在阿魏酸多聚物合成反应中的应用，其特征在于：

所述的重组漆酶的制备方法包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO:2所示的DNA连入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-LacMP，将编码6个氨基酸ETEAEF的核苷酸序列连入到重组载体pPICZαA-LacMP，得到表达载体pPICZαA-6AA-LacMP；

(2)通过将表达载体pPICZαA-6AA-LacMP化学转化E.coli Top10得到克隆菌株E.coliTop10/pPICZαA-6AA-LacMP；

(3)将步骤(2)所述表达载体pPICZαA-6AA-LacMP线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得重组毕赤酵母工程菌；

(4)将所述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得重组漆酶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的重组毕赤酵母工程菌的构建方法如下：

将表达载体pPICZαA-6AA-LacMP经PmeI单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌X33感受态细胞，并在含有100μg/L zeocin的YPD平板进行阳性转化子筛选；将YPD平板上的转化子为模板，以PMPF和PMPR为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子接种到含有0.2mMABTS和0.1mM CuSO₄的MM平板进行活性鉴定，菌落周围出现深绿色反应圈的转化子为重组毕赤酵母工程菌Pichia pastoris X33/pPICZαA-6AA-LacMP；其中，PMPF和PMPR的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的重组漆酶的获得方法如下：

挑取重组毕赤酵母工程菌Pichia pastoris X33/pPICZαA-6AA-LacMP接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD₆₀₀为6.0，于6000×g，4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD₆₀₀为1.0，于25℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵4天后在6000×g，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组漆酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.4mM CuSO₄。