CN114410595B

CN114410595B - 一种真菌漆酶、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN114410595B
Application number: CN202111650802.3A
Authority: CN
Inventors: 宋娟; 李国高; 李琦
Original assignee: Hunan Lerkan Biological Co ltd
Current assignee: Hunan Lerkan Biological Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114410595A

Abstract

本发明涉及一种真菌漆酶，其制备方法及应用。真菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了编码该真菌漆酶的基因如SEQ ID NO.2所示。本发明还构建了该真菌漆酶的重组表达菌株CGMCC No.24040，其表达的真菌漆酶的酶活力比现有的野生型漆酶LAC1的酶活力提高了59％，获得的真菌漆酶对多种金属离子和EDTA的耐受性都有不同程度的提高。

Description

一种真菌漆酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种真菌漆酶、其制备方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

漆酶是一种含有铜离子的多酚氧化酶，由500-550个氨基酸组成，活性部分含有4个铜离子。漆酶可降解底物广泛，包括木质素、偶氮染料、氯酚类化合物和多环芳烃类等，因此，在多种方面具有重要应用前景。偶氮染料是染料生产中使用最多的一类，偶氮染料的处理主要有吸附法、混凝沉降法、电化学法等，这些传统的处理方法能耗高，降解效率低，且容易造成二次污染。近年来，用微生物/酶处理法逐渐受到重视。其中，漆酶可以有效降解偶氮染料，可以用于牛仔布浮石洗涤过程中，也可以用于后期的靛蓝降解过程中。在造纸工业中，传统纸浆漂白多用含氯的化学试剂，对环境破坏严重。目前有人用漆酶-介体体系在纸浆漂白上取得了很好的效果，具有很好的应用前景。漆酶已经广泛应用于食品工业。葡萄酒、啤酒和果汁等饮料在长期存贮过程中会使多酚类物质氧化，饮品验收会变深，甚至出现浑浊，口感也会发生改变。在饮品中加入漆酶，会减少这种现象的发生。

漆酶在自然界分布广泛，动物、植物、微生物等均有发现。真菌漆酶由于其高催化活性和稳定性，应用范围广，受到广泛重视。野生型漆酶生产菌种所产生的漆酶活力往往比较低、生产不稳定，因此需要用基因工程手段进行改造。

本发明通过基因工程技术，克隆了一种新型漆酶编码基因，实现了其在毕赤酵母中的高效分泌表达，并通过定点突变技术，提高了酶的发酵活力和金属离子的耐受性。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种真菌漆酶、其制备方法及应用。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种真菌漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码如上所述真菌漆酶的基因，所述基因对应编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列。进一步地，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的提供真菌漆酶，其催化温度适中，在45-50℃均有较高的催化能力，pH范围广，从pH2.0-8.0都具有催化活性，能够耐受多种金属离子；如以ABTS为底物时，酶活为可达1600U/mL；最适pH值为pH5.0.最适催化温度为50℃。

一种含如上所述真菌漆酶基因的重组载体或重组菌株。

将如上所述真菌漆酶基因的重组载体，优选地，采用毕赤酵母表达载体进行构建重组载体。

将如上所述真菌漆酶基因的重组菌株，优选地，重组菌株转入的表达载体为含有序列如SEQ ID NO.2的毕赤酵母表达载体，宿主细胞为毕赤酵母X-33。

如上所述重组载体的构建方法，其包括如下步骤：

S1、PCR扩增：对含SEQ ID NO.5所示的基因或质粒，用引物M1如SEQ ID NO.9所示序列和R-x如SEQ ID NO.8所示序列进行PCR扩增，获得950bp的D1片段；利用引物SEQ IDNO.10和F-e如SEQ ID NO.7所示序列进行PCR扩增，获得1100bp的D2片段；

S2、突变：将获得的D1片段和D2片段，用于物F-e如SEQ ID NO.7所示序列和R-x如SEQ ID NO.8所示序列进行扩展性扩增；扩增产物获得含有两个氨基酸突变的漆酶基因；

S3、对步骤S2获得的PCR产物用EcoRI/XbaI双酶切；

S4、毕赤酵母表达载体双酶切：将pPICZaA质粒用EcoRI酶和XbaI酶进行酶切；获得经过EcoRI/XbaI双酶切的pPICZaA质粒；

S5、重组载体的构建：将步骤S4经过EcoRI/XbaI双酶切的pPICZaA质粒和步骤S3的酶切产物，在T4 DNA连接酶的作用下获得重组载体，测序正确即获得重组表达载体。

如上所述真菌漆酶的重组载体的制备方法，获得的重组载体含有受甲醇严格调控的醇氧化酶启动子AOX1，能够以甲醇为唯一碳源生长，并高效率表达漆酶；此外，在漆酶基因上游含有酿酒酵母α-信号肽序列，可以使表达的漆酶分泌到细胞外。

如上所述重组载体的构建方法，将上述构建的重组表达载体转入大肠杆菌Top10感受态细胞中，培养，之后取单菌落划线培养，对pPIC-lac1进行序列测定，分析序列连接正确，说明成功构建重组载体。

一种真菌漆酶的表达重组菌株的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：

(1)将含有如上所述的重组载体用限制性内切酶SacI线性化；

(2)毕赤酵母X-33感受态细胞的制备；

(3)将步骤(1)线性化后的重组载体与步骤(2)获得的毕赤酵母X-33感受态细胞进行电击转化，之后涂布YPDS平板进行培养；

(4)重组菌株的PCR扩增、鉴定，含有SEQ ID NO.2所示序列说明重组菌株构建成功。

优选地，在步骤(4)中，所述PCR扩增时所用的引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

一种用于表达如权利要求1所述真菌漆酶的菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.24040。

如上所述的真菌漆酶或由CGMCC No.24040菌株表达获得的真菌漆酶在食品加工、纸浆漂白、染料脱色中的应用。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种真菌漆酶以及其重组表达菌株，重组表达菌株在摇瓶中发酵活力达到1600U/mL，比现有的野生型酶LAC1的酶活力提高了59％，获得的真菌漆酶对多种金属离子和EDTA的耐受性都有不同程度的提高；发酵活力高于现有报道。

本发明提供的重组表达菌株CGMCC No.24040，经过大量培养即可获得高酶活力和能够耐受多种金属离子的真菌漆酶，制备方法简单，产量高，能有效降低生产成本。

本发明制备获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的真菌漆酶可广泛用于食品加工、纸浆漂白、染料脱色中的应用。

附图说明

图1为发酵上清液的酶蛋白SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白分子量对照；1：LAC1表达产物；2：LACST表达产物；

图2为重组漆酶LAC1和LACST在不同pH条件下的相对催化活性；

图3为重组漆酶LAC1和LACST在不同温度条件下的相对催化活性。

具体实施方式

本发明克隆了一株真菌的漆酶基因，构建基于醇氧化酶AOX1启动子控制的诱导表达菌株，实现了漆酶基因的分泌表达。通过结构模拟，活性位点预测分析，选择了两个氨基酸位点进行突变，获得的突变体酶发酵活力明显提高，对多种金属离子耐受性增强。

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。本发明下面实施例中未特别说明的，所用的％均为重量百分比。

实施例1、粗毛革孔菌XJ-11总RNA的提取及漆酶基因的克隆

将实验室保存的粗毛革孔菌(编号：XJ-11，由湖南利尔康生物股份有限公司分离并保存)接种到灭菌的PDA培养基(购于北京爱普锐晟科技有限公司)中，30℃培养72h。12,000rpm离心10min收集菌体，用10mL灭菌水洗涤2～3次，菌体置于研钵中，加液氮冷冻，研磨破碎菌体。利用真菌总RNA提取试剂盒(Omega公司产品)提取其总RNA。

反转录：

总RNA 5μL(约3μg)，Oligo dT18 1.0μL(1.0μg)，混合后，70℃变性5min，立即插到冰上2min。加入10U的反转录酶AMV、50U的RNsin、3μL0.1 mol/L DTT、1μL 10mM dNTPs，42℃反应1.5h，获得cDNA。

基因扩增：

根据NCBI报道的粗毛革孔菌漆酶基因序列设计引物，F(SEQ ID NO.3)：5’-ATGGCCAGGTTCCAATCTCT-3’；R(SEQ ID NO.4)：5’-TTACTGGTCGTCAGGCGAG-3’。

PCR体系组分如下：反转录cDNA 5μL，Taq DNA聚合酶1μl，引物F、R各1μL，5mM dNTP1μL，10×反应缓冲液5μL，ddH₂O 36μL，总体积50μL。

PCR扩增条件如下：94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物DNA，并送公司测序。

获得基因lac1的测序结果如SEQ ID NO.5：

ATGGCCAGGTTCCAATCTCTCCTCACCTTCATCACCCTCTCGCTCGTTGCCTCCGTGTACGCTGCCATCGGGCCAGTCGCAGACCTCACTATCTCCAATGGCGCCGTCAGTCCCGATAGTTTCTCTCGGCAGGCGATCTTGGTCAATGACATCTTCCCTAGTCCCCTCATTCCGGGGAACAAGGGTGATCGTATCCAACTGAACGTCATCAACAACATGACGAACCACACCATGTTGAAGTCCACCAGTATCCACTGGCACGGCTTCTTCCAACACGGTACGAACTGGGCCGACGGCCCCACCTTCGTCAACCAGTGCCCCATCTCTACAGGGCATCCGTTCCTTTACGACTTTCAGGTCCCTGACCAAGCTGGTACTTTCTGGTACCATAGTCACTTGTCGACTCAGTACTGTGATGGCGGTCCAATTGTTGTCTATGACCCTCAAGACCCCCACAAGAGCCTCTATGATGTTGATGACGACTCTACCGTAATCACGCTCGCAGATTGGTACCACTTGGCTGCCAAAGTCTCGACGGTCCCGACTGCCGATGCGACTCTTATCTACGGCCTCGGTCGCAGCATCGACACGCTCAACGCCGATTTGGCTGTCATCACGGTTACAAAGGGCAAGCGTTACCGCTTCCGCTTAGTGTCACTTTCATGCGACCCGAATTACACGTTCAGCATCAACGGTCACTCTCTGACCATCCTCGAGGCGAACAGCGTGAACTTGAAACCCCACACTGTCAACTCCCTCCAGATCGTTGCCGCCCAGAGATACTCGTTTGTGCTCAACGCAGATCAGGATGTGGACAATTACTGGATCCGCCTTCCCAACTCCGGAACCATGAACTTCGCGGGCGGTGTCAACTCCGCCATCCTCCGCTACGACGGCGCTGCGCCTGTTGAGCCCACCACATCCCAGACGCCGTCAACGAATCCTGTGGAGTCCGCCCTCACCACGCTGGAAGGCACCGCTGCGCCCGGCAGCCCGACCCCTAGCGGTGTCGACCTCGCGCTCAACATGGCCTTCGGCTTCGCCGGCGGCAAATTCACCATCTACAGCGCGAGCTTCACCCCTCCCACGGTCCCCGTCCTCCTGCAGATCCTGAGCGGCGCGCAGCCCGCGCAGGACCTCTTCCCCGCCGGAAGTGTCTACTCGCTCCCTGCGAACGCGGACATTGAAATCTCCCTGCCCGCCACCGCCGCCGCCCCCGGGTTCCCGCACCCCTTCCACTTGCACGGGCACACCTTCGCCGTCGTGCGCAGCGCGGGCTCGTCGACGTACAACTACGAGAACTCGGTCTACCGCGACGTGGTCAGCACGGGCGCGCCCGGGGACAACGTCACGATCCGGCTCAGGACGGATAACCCCGGGCCGTGGTTCCTCCACTGCCACATCGACTTCCACCTCGAGGCTAGGTTCGCGGTCGTCATGGCCGAGGACATCCCGGACGTCGCCGCGACGAACCCGGTCCCGCAGGCCTGGTCGGACCTGTGCCCGCCTTATGACGCGCTCTCGCCTGACGACCAGTAA

其对应编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.6：

MARFQSLLTF ITLSLVASVY AAIGPVADLT ISNGAVSPDS FSRQAILVNDIFPSPLIPGNKGDRIQLNVI NNMTNHTMLKSTSIHWHGFFQHGTNWADGP TFVNQCPISTGHPFLYDFQVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGGPIVVYDPQDPHKSLYDVDDDSTVITLADWYHLAAKVSTVPTADATLIYGLGRSIDTLNADLAVITVTKGKRYRFRLVSLSCDPNYTFSINGHSLTILEANSVNLKPHTVNSLQIVAAQRYSFVLNADQDVDNYWIRLPNSGTMNFAGGVNSAILRYDGAAPVEPTTSQTPSTNPVESALTTLEGTAAPGSPTPSGVDLALNMAFGFAGGKFTIYSASFTPPTVPVLLQILSGAQPAQDLFPAGSVYSLPANADIEISLPATAAAPGFPHPFHLHGHTFAVVRSAGSSTYNYENSVYRDVVSTGAPGDNVTIRLRTDNPGPWFLHCHIDFHLEARFAVVMAEDIPDVAAT NPVPQAWSDLCPPYDALSPD DQ

实施例2、漆酶基因lac1表达工程菌株的构建

用DNAMAN软件对实施例1获得的基因lac1序列(SEQ ID NO.5)，进行限制性酶切位点分析，设计引物F-e(SEQ ID NO.7)：5’-CGGAATTCATGGCCAGGTTCCAATCTCT-3’(其中，下划线为ECORI位点)和R-x(SEQ ID NO.8)：5’-GCTCTAGATTACTGGTCGTCAGGCGAG-3’(其中，下划线为XbaI位点)。以实施例1中获得反转录PCR产物(c DNA)为模板，进行PCR扩增。

PCR体系组分如下：PCR产物1μL，Phusion DNA聚合酶1μL，引物F-e、R-x(浓度均为10μM)各1μL，10mM dNTP 1μL，5×反应缓冲液10μL，ddH₂O 35μL，总体积50μL。

PCR扩增条件如下：94℃预变性3min，然后94℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物DNA。PCR产物双酶切：上述PCR扩增产物20μL，10x缓冲液10μL，EcoRI 5μL，XbaI 5μL，灭菌水60μL，混匀，37℃水浴12h。用DNA纯化试剂盒(Omega公司产品)纯化酶切产物。

毕赤酵母表达载体双酶切：pPICZaA质粒(购自美国Invitrogen公司)10μL，10×缓冲液10μL，EcoRI 5μL，XbaI 5μL，灭菌水60μL，混匀，37℃水浴12h。用DNA纯化试剂盒(Omega公司产品)纯化酶切产物。

重组质粒构建：经过EcoRI/XbaI双酶切的pPICZαA质粒和PCR产物各4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，混匀，16℃水浴12h以上。

连接产物转化大肠杆菌：大肠杆菌Top10感受态细胞购自北京擎科生物技术公司。将连接产物10μL与100μL大肠杆菌Top10感受态细胞混匀，置于冰上25min，42℃热激90s，加入500μL低盐LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)，37℃恢复培养3hr。涂布含25μg/mL Zeocin抗生素的低盐LB平板上(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)，37℃培养12h以上。挑取单菌落划线培养，鉴定重组质粒，采用跑电泳看质粒的大小，有外源基因插入，质粒会比空载体大。将获得的重组质粒命名为pPIC-lac1。对pPIC-lac1进行序列测定，分析序列连接是否正确。其中，正确的序列连接在载体EcoRI和XbaI酶切位点，能编码漆酶基因，与GenBank公开的序列进行blastn分析来分析序列是否正确。

实施例3、漆酶突变基因lacST重组质粒的构建

通过漆酶蛋白高级结构模拟预测可能影响活性的关键氨基酸位点，然后进行定点突变。

根据测出来的序列设计突变引物序列，引入两个突变位点。设计突变引物：M1(SEQID NO.9)：5’-ACACGCTCAGCGCCGATTTG-3’和M2(SEQ ID NO.10)：5’-CCGGCGGTGAAGAGGTCC-3’。

利用引物M1/R-x扩增出950bp片段，用引物M2/F-e扩增出来1100bp片段，获得两端带有突变位点的片段，然后放在一起，做重叠PCR延伸，就可以获得全长的突变体基因，具体操作如下：

PCR扩增：分别用于引物M1与R-x和另一对引物M2和F-e进行PCR扩增，在两个片段上分别引入一个氨基酸突变位点。

具体地，将实施例2鉴定正确的质粒pPIC-lac1作为模板取1μL，5x缓冲液10μL，Phusion DNA聚合酶1μL，引物M1/R-x(或者M2/F-e)各1μL，10mM dNTP 1μL，灭菌水35μL。扩增条件：94℃预变性3min，然后94℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。分别扩增出950bp(D1)和1100bp(D2)两条DNA片段。经过切胶回收纯化。

突变：进行重叠PCR扩增，把两个突变位点整合在一个全长的基因上，从而获得含量两个氨基酸突变的漆酶基因。

具体地，D1和D2片段各1μL，5×缓冲液10μL，Phusion DNA聚合酶1μL，引物F-e/R-x(10μM)各1μL，10mM dNTP 1μL，灭菌水34μL。扩增条件：94℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增产物的大小大约为1500bp。用DNA纯化试剂盒(Omega公司产品)纯化酶切产物。

PCR产物双酶切：PCR产物20μL，10x缓冲液10μL，EcoRI 5μL，XbaI 5μL，灭菌水60μL，混匀，37℃水浴12h。用DNA纯化试剂盒(Omega公司产品)纯化酶切产物。

重组质粒构建：将上述经过EcoRI/XbaI双酶切的pPICZaA质粒和PCR产物各4μL，10×连接缓冲液1μL，T4 DNA连接酶1μL，混匀，16℃水浴12h以上，获得连接产物。

连接产物转化大肠杆菌：将10μL上述连接产物与100μL大肠杆菌Top10感受态细胞(购自北京擎科生物技术公司)混匀，置于冰上25min，42℃热激90s，加入500μL低盐LB液体培养基，37℃恢复培养3h。涂布含0.25μg/mL Zeocin抗生素的低盐LB平板，37℃培养12h以上。挑取单菌落划线培养，鉴定重组质粒。进行序列测定，分析序列连接是否正确。将突变位点正确的重组质粒命名为pPIC-lacST。

测序结果如SEQ ID NO.2所示，其对应的突变体真菌漆酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，结果说明酶切位点没有发生移码突变，可以用于表达蛋白。

SEQ ID NO.2：

ATGGCCAGGTTCCAATCTCTCCTCACCTTCATCACCCTCTCGCTCGTTGCCTCCGTGTACGCTGCCATCGGGCCAGTCGCAGACCTCACTATCTCCAATGGCGCCGTCAGTCCCGATAGTTTCTCTCGGCAGGCGATCTTGGTCAATGACATCTTCCCTAGTCCCCTCATTCCGGGGAACAAGGGTGATCGTATCCAACTGAACGTCATCAACAACATGACGAACCACACCATGTTGAAGTCCACCAGTATCCACTGGCACGGCTTCTTCCAACACGGTACGAACTGGGCCGACGGCCCCACCTTCGTCAACCAGTGCCCCATCTCTACAGGGCATCCGTTCCTTTACGACTTTCAGGTCCCTGACCAAGCTGGTACTTTCTGGTACCATAGTCACTTGTCGACTCAGTACTGTGATGGCGGTCCAATTGTTGTCTATGACCCTCAAGACCCCCACAAGAGCCTCTATGATGTTGATGACGACTCTACCGTAATCACGCTCGCAGATTGGTACCACTTGGCTGCCAAAGTCTCGACGGTCCCGACTGCCGATGCGACTCTTATCTACGGCCTCGGTCGCAGCATCGACACGCTCAGCGCCGATTTGGCTGTCATCACGGTTACAAAGGGCAAGCGTTACCGCTTCCGCTTAGTGTCACTTTCATGCGACCCGAATTACACGTTCAGCATCAACGGTCACTCTCTGACCATCCTCGAGGCGAACAGCGTGAACTTGAAACCCCACACTGTCAACTCCCTCCAGATCGTTGCCGCCCAGAGATACTCGTTTGTGCTCAACGCAGATCAGGATGTGGACAATTACTGGATCCGCCTTCCCAACTCCGGAACCATGAACTTCGCGGGCGGTGTCAACTCCGCCATCCTCCGCTACGACGGCGCTGCGCCTGTTGAGCCCACCACATCCCAGACGCCGTCAACGAATCCTGTGGAGTCCGCCCTCACCACGCTGGAAGGCACCGCTGCGCCCGGCAGCCCGACCCCTAGCGGTGTCGACCTCGCGCTCAACATGGCCTTCGGCTTCGCCGGCGGCAAATTCACCATCTACAGCGCGAGCTTCACCCCTCCCACGGTCCCCGTCCTCCTGCAGATCCTGAGCGGCGCGCAGCCCGCGCAGGACCTCTTCACCGCCGGAAGTGTCTACTCGCTCCCTGCGAACGCGGACATTGAAATCTCCCTGCCCGCCACCGCCGCCGCCCCCGGGTTCCCGCACCCCTTCCACTTGCACGGGCACACCTTCGCCGTCGTGCGCAGCGCGGGCTCGTCGACGTACAACTACGAGAACTCGGTCTACCGCGACGTGGTCAGCACGGGCGCGCCCGGGGACAACGTCACGATCCGGCTCAGGACGGATAACCCCGGGCCGTGGTTCCTCCACTGCCACATCGACTTCCACCTCGAGGCTAGGTTCGCGGTCGTCATGGCCGAGGACATCCCGGACGTCGCCGCGACGAACCCGGTCCCGCAGGCCTGGTCGGACCTGTGCCCGCCTTATGACGCGCTCTCGCCTGACGACCAGTAA

SEQ ID NO.1：

MARFQSLLTFITLSLVASVYAAIGPVADLTISNGAVSPDSFSRQAILVNDIFPSPLIPGNKGDRIQLNVINNMTNHTMLKSTSIHWHGFFQHGTNWADGPTFVNQCPISTGHPFLYDFQVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGGPIVVYDPQDPHKSLYDVDDDSTVITLADWYHLAAKVSTVPTADATLIYGLGRSIDTLSADLAVITVTKGKRYRFRLVSLSCDPNYTFSINGHSLTILEANSVNLKPHTVNSLQIVAAQRYSFVLNADQDVDNYWIRLPNSGTMNFAGGVNSAILRYDGAAPVEPTTSQTPSTNPVESALTTLEGTAAPGSPTPSGVDLALNMAFGFAGGKFTIYSASFTPPTVPVLLQILSGAQPAQDLFTAGSVYSLPANADIEISLPATAAAPGFPHPFHLHGHTFAVVRSAGSSTYNYENSVYRDVVSTGAPGDNVTIRLRTDNPGPWFLHCHIDFHLEARFAVVMAEDIPDVAATNPVPQAWSDLCPPYDALSPDDQ

实施例4、高效分泌表达漆酶毕赤酵母工程菌株的构建

质粒线性化：将按实施例2和实施例4获得的pPIC-lac1和pPIC-lacST分别用限制性内切酶SacI线性化。反应体系：质粒20μL，10×缓冲液10μL，SacI酶5μL，灭菌水65μL，混匀，37℃保温12hr以上。过柱纯化DNA，溶于10μL灭菌ddH₂O，分别获得线性化pPIC-lac1质粒和线性化pPIC-lacST质粒。

毕赤酵母X-33感受态细胞制备：挑取X-33(购自美国Invitrogen公司)单菌落接种于5mL YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)。30℃、220rpm振荡培养过夜，按照1％比例转接50mL YPD培养基，继续30℃、220rpm振荡培养，直至OD600约为1.0为止。菌液置于冰上10min，在4℃、5000rpm离心5min收集菌体，用冰冷的灭菌ddH₂O洗涤2～3次，再用1M山梨醇洗涤1次，最后溶于0.5mL 1M山梨醇中，即为毕赤酵母X-33感受态细胞。不可冰冻保存，现制现用。

电击转化：分别取两种10μL线性化质粒(约10μg)与80μL毕赤酵母X-33感受态细胞混匀置于冰冷的电击杯中，冰浴2～3min，2000V电击5ms，然后立即加入1mL冰冷的1M山梨醇，置于30℃温育3h。涂布YPDS平板(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1M山梨醇、1.0μg/ml Zeocin)，30℃培养3～4天。待菌落清晰后，挑单菌落在YPD平板上划线，30℃培养2～3天。

重组菌株的PCR鉴定：重组菌接种5mL YPD培养基，30℃220rpm振荡培养12h，室温离心收集菌体，用真菌基因组提取试剂盒(Omega公司产品)提取基因组DNA。PCR扩增：基因组DNA 1μL、Phusion DNA聚合酶1μL，引物F-e、R-x(10μM)各1μL，10mM dNTP 1μL，5×反应缓冲液10μL，ddH₂O 35μL总体积50μL。94℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物DNA。PCR产物经测序确认序列。分别获得含有外源基因lac1的重组毕赤酵母工程菌株LAC1，和含外源基因lacST的重组毕赤酵母工程菌株LZCST。

实施例5、重组毕赤酵母工程菌株的摇瓶发酵培养

挑取实施例4中制备的两种重组毕赤酵母菌株，接种于5mL YPD培养基，30℃、220rpm摇床培养过夜。按体积比1％的比例转接于含30mL BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％biotin，1％甘油，100mM pH6.0磷酸盐缓冲液)培养基的250mL摇瓶中，在30℃、220rpm摇床培养至OD600值为2～6，4℃离心收集菌体。然后用BMMY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.0，1.34％YNB，4×10^-5％biotin)重悬菌体，使OD600约为1.0，再加入终浓度为0.5％(V/V)的甲醇进行摇瓶诱导培养96h，每24h添加一次甲醇。离心收集摇瓶培养物的上清液。本发明在酶基因的上游有信号肽序列，可以把酶蛋白直接分泌到酵母细胞外面，不需要纯化。所以直接用上清液用12.5％SDS-PAGE电泳检测酶蛋白表达情况。结果见图1，图中的条带M：蛋白分子量对照；1：LAC1表达产物；2：LACST表达产物。注：可能由于糖基化不完全所以有相近两条蛋白条带。

按实施例4中方法用重组质粒pPIC-lacST构建漆酶毕赤酵母重组菌株，随机挑选20株重组菌株进行摇瓶发酵，测定上清液酶活，选取最高酶发酵活力的菌株进行详细研究，并于2021年12月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行了保藏，菌株分类命名为：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，其保藏号为CGMCC No.24040。

实施例6、重组漆酶的酶学性质

将实施例5中获得培养后的重组毕赤酵母工程菌株CGMCC No.24040，按实施例5中方法进行发酵培养后，取上清液测定漆酶的活性。将菌株CGMCC No.24040获得的突变体漆酶记为LACST，同时并将转入重组质粒的pPIC-lac1重组菌株获得漆酶记为LAC1，进行如下实验。

酶活测定底物为2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)，漆酶酶活测定原理：漆酶能够利用氧气将ABTS氧化生成ABTS⁺并且生成水，ABTS⁺在420nm处有较强的吸收峰，用来检测漆酶的活性，具体方法如下：

以1mmol/L的ABTS为底物，取50μL适当稀释的粗酶液与950μL pH 4.0的柠檬酸－磷酸盐缓冲液在5mL的离心管中混匀，置于30℃中预热3min；另取1mL ABTS溶液于另一支离心管中，置于30℃中预热3min。快速将预热后的1mL底物和酶液混合均匀，置于30℃水浴锅中反应10min，冰浴2min，在420nm下测定溶液的吸光度。以100℃处理5min灭活的粗酶液作为空白对照。

酶活定义：在pH 5.0和50℃的条件下，1min消耗1μmol ABTS为一个酶活力单位(U)。

漆酶活力(U/mL)计算公式：

漆酶活力(U/mL)＝(1000×ΔA420×V_总×d_f)/(ε×b×V_酶×Δt)

其中：V总＝2mL，为反应体系总体积；

ε＝36000mL/mmol/cm，为摩尔吸光系数；

b为光程长，具体测量为比色皿的宽度；

V酶＝0.05mL，V酶为稀释的发酵上清液；

df为稀释倍数。

再根据朗伯-比尔定律ΔA＝εbc(c为底物ABTS的浓度)，计算出漆酶活力。

最适pH值的测定：在50℃条件下，分别测定pH2.0～8.0范围内的酶活性，以最高酶活为100％，其他pH的酶活与之相比较，计算相对酶活。

摇瓶发酵活力LAC1达到940U/mL，LACST达到1600U/mL，说明本发明提供的真菌漆酶，突变了两个氨基酸位点后，提高了酶的发酵活力达59％，且高于现有报道水平。

配制不同pH值(2.0-8.0)的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，底物用相应pH值缓冲液配制，酶液也用相应缓冲液稀释，然后测定酶活。每个点做3个平行，取平均值。以最高活性为100％，其他各pH值的催化活性与之相比较，计算相对催化活性，作图，如图2所示。结果显示，漆酶LAC1和突变体漆酶LACST均在pH5.0具有最高催化活性，即pH5.0是其最佳催化pH值。

最适温度测定：在pH5.0条件下，分别测定20～70℃范围内漆酶的活性，以最高酶活为100％，其他温度的酶活与之相比较，计算相对酶活。

用pH值为5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠配制底物，酶液也用其做相应稀释，在20-70℃测酶活，每个点分别做3个平行，取平均值。结果表明，LAC1的最适催化温度为45℃，而LACST的最适催化温度为50℃，如图3所示。

金属离子和EDTA对酶活性的影响：分别在酶蛋白浓度0.1mg/mL，体积200μL中加入终浓度为10mM的金属离子或EDTA，置于冰上放置30min，然后测定酶的活性。以未处理的酶活为100％，其他酶活与之相比较计算相对活性。

表1金属离子对酶活性的影响

重组菌株在摇瓶中发酵活力，其中漆酶的野生型基因为lac1和突变体基因为lacST的酶活力分别达到940U/mL和1600U/mL，突变体LACST发酵活力比野生型酶LAC1提高了59％，多种金属离子和EDTA的耐受性都有不同程度的提高，说明本发明获得突变体漆酶LACST具有明显的优势。

通过研究发现，本发明获得真菌漆酶(即突变体漆酶)LACST对靛蓝的脱色作用，发现该漆酶能有效减少靛蓝的返沾，提高成衣的亮度，并能有效降低面料强力的损伤。漆酶在生物造纸中的应用利用：漆酶是一种含铜多酚氧化酶，参与木素的降解或聚合，具有氧化木素的能力，通过本发明获得突变体漆酶LACST预处理可以降低化学浆的残余木素量，减少制浆中的能源消耗，提高纸浆强度特性和光泽度。由此可见本发明获得漆酶在染料脱色、纸浆漂白等工业方面有巨大的应用潜能。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 湖南利尔康生物股份有限公司

<120> 一种真菌漆酶、其制备方法及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 512

<212> PRT

<213> 突变体真菌漆酶(lacST)

<400> 1

Met Ala Arg Phe Gln Ser Leu Leu Thr Phe Ile Thr Leu Ser Leu Val

1 5 10 15

Ala Ser Val Tyr Ala Ala Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu Thr Ile Ser

20 25 30

Asn Gly Ala Val Ser Pro Asp Ser Phe Ser Arg Gln Ala Ile Leu Val

35 40 45

Asn Asp Ile Phe Pro Ser Pro Leu Ile Pro Gly Asn Lys Gly Asp Arg

50 55 60

Ile Gln Leu Asn Val Ile Asn Asn Met Thr Asn His Thr Met Leu Lys

65 70 75 80

Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln His Gly Thr Asn Trp

85 90 95

Ala Asp Gly Pro Thr Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ser Thr Gly His

100 105 110

Pro Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp

115 120 125

Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Gly Pro Ile Val

130 135 140

Val Tyr Asp Pro Gln Asp Pro His Lys Ser Leu Tyr Asp Val Asp Asp

145 150 155 160

Asp Ser Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Leu Ala Ala Lys

165 170 175

Val Ser Thr Val Pro Thr Ala Asp Ala Thr Leu Ile Tyr Gly Leu Gly

180 185 190

Arg Ser Ile Asp Thr Leu Ser Ala Asp Leu Ala Val Ile Thr Val Thr

195 200 205

Lys Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Leu Ser Cys Asp Pro

210 215 220

Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asn Gly His Ser Leu Thr Ile Leu Glu Ala

225 230 235 240

Asn Ser Val Asn Leu Lys Pro His Thr Val Asn Ser Leu Gln Ile Val

245 250 255

Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Asn Ala Asp Gln Asp Val Asp

260 265 270

Asn Tyr Trp Ile Arg Leu Pro Asn Ser Gly Thr Met Asn Phe Ala Gly

275 280 285

Gly Val Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Gly Ala Ala Pro Val Glu

290 295 300

Pro Thr Thr Ser Gln Thr Pro Ser Thr Asn Pro Val Glu Ser Ala Leu

305 310 315 320

Thr Thr Leu Glu Gly Thr Ala Ala Pro Gly Ser Pro Thr Pro Ser Gly

325 330 335

Val Asp Leu Ala Leu Asn Met Ala Phe Gly Phe Ala Gly Gly Lys Phe

340 345 350

Thr Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu

355 360 365

Gln Ile Leu Ser Gly Ala Gln Pro Ala Gln Asp Leu Phe Thr Ala Gly

370 375 380

Ser Val Tyr Ser Leu Pro Ala Asn Ala Asp Ile Glu Ile Ser Leu Pro

385 390 395 400

Ala Thr Ala Ala Ala Pro Gly Phe Pro His Pro Phe His Leu His Gly

405 410 415

His Thr Phe Ala Val Val Arg Ser Ala Gly Ser Ser Thr Tyr Asn Tyr

420 425 430

Glu Asn Ser Val Tyr Arg Asp Val Val Ser Thr Gly Ala Pro Gly Asp

435 440 445

Asn Val Thr Ile Arg Leu Arg Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu

450 455 460

His Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Arg Phe Ala Val Val Met

465 470 475 480

Ala Glu Asp Ile Pro Asp Val Ala Ala Thr Asn Pro Val Pro Gln Ala

485 490 495

Trp Ser Asp Leu Cys Pro Pro Tyr Asp Ala Leu Ser Pro Asp Asp Gln

500 505 510

<210> 2

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccaggt tccaatctct cctcaccttc atcaccctct cgctcgttgc ctccgtgtac 60

gctgccatcg ggccagtcgc agacctcact atctccaatg gcgccgtcag tcccgatagt 120

ttctctcggc aggcgatctt ggtcaatgac atcttcccta gtcccctcat tccggggaac 180

aagggtgatc gtatccaact gaacgtcatc aacaacatga cgaaccacac catgttgaag 240

tccaccagta tccactggca cggcttcttc caacacggta cgaactgggc cgacggcccc 300

accttcgtca accagtgccc catctctaca gggcatccgt tcctttacga ctttcaggtc 360

cctgaccaag ctggtacttt ctggtaccat agtcacttgt cgactcagta ctgtgatggc 420

ggtccaattg ttgtctatga ccctcaagac ccccacaaga gcctctatga tgttgatgac 480

gactctaccg taatcacgct cgcagattgg taccacttgg ctgccaaagt ctcgacggtc 540

ccgactgccg atgcgactct tatctacggc ctcggtcgca gcatcgacac gctcagcgcc 600

gatttggctg tcatcacggt tacaaagggc aagcgttacc gcttccgctt agtgtcactt 660

tcatgcgacc cgaattacac gttcagcatc aacggtcact ctctgaccat cctcgaggcg 720

aacagcgtga acttgaaacc ccacactgtc aactccctcc agatcgttgc cgcccagaga 780

tactcgtttg tgctcaacgc agatcaggat gtggacaatt actggatccg ccttcccaac 840

tccggaacca tgaacttcgc gggcggtgtc aactccgcca tcctccgcta cgacggcgct 900

gcgcctgttg agcccaccac atcccagacg ccgtcaacga atcctgtgga gtccgccctc 960

accacgctgg aaggcaccgc tgcgcccggc agcccgaccc ctagcggtgt cgacctcgcg 1020

ctcaacatgg ccttcggctt cgccggcggc aaattcacca tctacagcgc gagcttcacc 1080

cctcccacgg tccccgtcct cctgcagatc ctgagcggcg cgcagcccgc gcaggacctc 1140

ttcaccgccg gaagtgtcta ctcgctccct gcgaacgcgg acattgaaat ctccctgccc 1200

gccaccgccg ccgcccccgg gttcccgcac cccttccact tgcacgggca caccttcgcc 1260

gtcgtgcgca gcgcgggctc gtcgacgtac aactacgaga actcggtcta ccgcgacgtg 1320

gtcagcacgg gcgcgcccgg ggacaacgtc acgatccggc tcaggacgga taaccccggg 1380

ccgtggttcc tccactgcca catcgacttc cacctcgagg ctaggttcgc ggtcgtcatg 1440

gccgaggaca tcccggacgt cgccgcgacg aacccggtcc cgcaggcctg gtcggacctg 1500

tgcccgcctt atgacgcgct ctcgcctgac gaccagtaa 1539

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccaggt tccaatctct 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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aagggtgatc gtatccaact gaacgtcatc aacaacatga cgaaccacac catgttgaag 240

tccaccagta tccactggca cggcttcttc caacacggta cgaactgggc cgacggcccc 300

accttcgtca accagtgccc catctctaca gggcatccgt tcctttacga ctttcaggtc 360

cctgaccaag ctggtacttt ctggtaccat agtcacttgt cgactcagta ctgtgatggc 420

ggtccaattg ttgtctatga ccctcaagac ccccacaaga gcctctatga tgttgatgac 480

gactctaccg taatcacgct cgcagattgg taccacttgg ctgccaaagt ctcgacggtc 540

ccgactgccg atgcgactct tatctacggc ctcggtcgca gcatcgacac gctcaacgcc 600

gatttggctg tcatcacggt tacaaagggc aagcgttacc gcttccgctt agtgtcactt 660

tcatgcgacc cgaattacac gttcagcatc aacggtcact ctctgaccat cctcgaggcg 720

aacagcgtga acttgaaacc ccacactgtc aactccctcc agatcgttgc cgcccagaga 780

tactcgtttg tgctcaacgc agatcaggat gtggacaatt actggatccg ccttcccaac 840

tccggaacca tgaacttcgc gggcggtgtc aactccgcca tcctccgcta cgacggcgct 900

gcgcctgttg agcccaccac atcccagacg ccgtcaacga atcctgtgga gtccgccctc 960

accacgctgg aaggcaccgc tgcgcccggc agcccgaccc ctagcggtgt cgacctcgcg 1020

ctcaacatgg ccttcggctt cgccggcggc aaattcacca tctacagcgc gagcttcacc 1080

cctcccacgg tccccgtcct cctgcagatc ctgagcggcg cgcagcccgc gcaggacctc 1140

ttccccgccg gaagtgtcta ctcgctccct gcgaacgcgg acattgaaat ctccctgccc 1200

gccaccgccg ccgcccccgg gttcccgcac cccttccact tgcacgggca caccttcgcc 1260

gtcgtgcgca gcgcgggctc gtcgacgtac aactacgaga actcggtcta ccgcgacgtg 1320

gtcagcacgg gcgcgcccgg ggacaacgtc acgatccggc tcaggacgga taaccccggg 1380

ccgtggttcc tccactgcca catcgacttc cacctcgagg ctaggttcgc ggtcgtcatg 1440

gccgaggaca tcccggacgt cgccgcgacg aacccggtcc cgcaggcctg gtcggacctg 1500

tgcccgcctt atgacgcgct ctcgcctgac gaccagtaa 1539

<210> 6

<211> 512

<212> PRT

<213> 漆酶(lac1)

<400> 6

Met Ala Arg Phe Gln Ser Leu Leu Thr Phe Ile Thr Leu Ser Leu Val

1 5 10 15

Ala Ser Val Tyr Ala Ala Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu Thr Ile Ser

20 25 30

Asn Gly Ala Val Ser Pro Asp Ser Phe Ser Arg Gln Ala Ile Leu Val

35 40 45

Asn Asp Ile Phe Pro Ser Pro Leu Ile Pro Gly Asn Lys Gly Asp Arg

50 55 60

Ile Gln Leu Asn Val Ile Asn Asn Met Thr Asn His Thr Met Leu Lys

65 70 75 80

Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln His Gly Thr Asn Trp

85 90 95

Ala Asp Gly Pro Thr Phe Val Asn Gln Cys Pro Ile Ser Thr Gly His

100 105 110

Pro Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp

115 120 125

Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Gly Pro Ile Val

130 135 140

Val Tyr Asp Pro Gln Asp Pro His Lys Ser Leu Tyr Asp Val Asp Asp

145 150 155 160

Asp Ser Thr Val Ile Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Leu Ala Ala Lys

165 170 175

Val Ser Thr Val Pro Thr Ala Asp Ala Thr Leu Ile Tyr Gly Leu Gly

180 185 190

Arg Ser Ile Asp Thr Leu Asn Ala Asp Leu Ala Val Ile Thr Val Thr

195 200 205

Lys Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Leu Ser Cys Asp Pro

210 215 220

Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asn Gly His Ser Leu Thr Ile Leu Glu Ala

225 230 235 240

Asn Ser Val Asn Leu Lys Pro His Thr Val Asn Ser Leu Gln Ile Val

245 250 255

Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Asn Ala Asp Gln Asp Val Asp

260 265 270

Asn Tyr Trp Ile Arg Leu Pro Asn Ser Gly Thr Met Asn Phe Ala Gly

275 280 285

Gly Val Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Gly Ala Ala Pro Val Glu

290 295 300

Pro Thr Thr Ser Gln Thr Pro Ser Thr Asn Pro Val Glu Ser Ala Leu

305 310 315 320

Thr Thr Leu Glu Gly Thr Ala Ala Pro Gly Ser Pro Thr Pro Ser Gly

325 330 335

Val Asp Leu Ala Leu Asn Met Ala Phe Gly Phe Ala Gly Gly Lys Phe

340 345 350

Thr Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Pro Pro Thr Val Pro Val Leu Leu

355 360 365

Gln Ile Leu Ser Gly Ala Gln Pro Ala Gln Asp Leu Phe Pro Ala Gly

370 375 380

Ser Val Tyr Ser Leu Pro Ala Asn Ala Asp Ile Glu Ile Ser Leu Pro

385 390 395 400

Ala Thr Ala Ala Ala Pro Gly Phe Pro His Pro Phe His Leu His Gly

405 410 415

His Thr Phe Ala Val Val Arg Ser Ala Gly Ser Ser Thr Tyr Asn Tyr

420 425 430

Glu Asn Ser Val Tyr Arg Asp Val Val Ser Thr Gly Ala Pro Gly Asp

435 440 445

Asn Val Thr Ile Arg Leu Arg Thr Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu

450 455 460

His Cys His Ile Asp Phe His Leu Glu Ala Arg Phe Ala Val Val Met

465 470 475 480

Ala Glu Asp Ile Pro Asp Val Ala Ala Thr Asn Pro Val Pro Gln Ala

485 490 495

Trp Ser Asp Leu Cys Pro Pro Tyr Asp Ala Leu Ser Pro Asp Asp Gln

500 505 510

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggaattcat ggccaggttc caatctct 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acacgctcag cgccgatttg 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccggcggtga agaggtcc 18

Claims

1.一种真菌漆酶，其特征在于，所述真菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述真菌漆酶的基因，其特征在于，所述基因对应编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述的真菌漆酶基因的重组载体或重组菌株。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的表达载体为毕赤酵母表达载体。

5.如权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，重组菌株中转入的表达载体为含有序列如SEQ ID NO.2的毕赤酵母表达载体，宿主细胞为毕赤酵母X-33。

6.一种真菌漆酶的重组载体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、PCR扩增：对含SEQ ID NO.5所示的基因或质粒，用引物M1如SEQ ID NO.9所示序列和R-x如SEQ ID NO.8所示序列进行PCR扩增，获得950 bp的D1片段；利用引物SEQ ID NO.10和F-e如SEQ ID NO.7所示序列进行PCR扩增，获得1100 bp的D2片段；

S2、突变：将获得的D1片段和D2片段，用引物F-e如SEQ ID NO.7所示序列和R-x如SEQID NO.8所示序列进行扩展性扩增；获得含有两个氨基酸突变的漆酶基因；

S3、对步骤S2获得的PCR产物用EcoRI /XbaI双酶切；

S4、毕赤酵母表达载体双酶切：将pPICZaA质粒用EcoRI酶和XbaI酶进行酶切；获得经过EcoRI /XbaI双酶切的pPICZaA质粒；

S5、重组载体的构建：将步骤S4经过EcoRI /XbaI双酶切的pPICZaA质粒和步骤S3的酶切产物，在T4 DNA连接酶的作用下获得重组载体，进行序列测定，分析序列连接是否正确；测序结果如SEQ ID NO.2所示，其对应的突变体真菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，即获得重组表达载体。

7.一种真菌漆酶的表达重组菌株的制备方法，菌株含有权利要求4所述的重组载体，其宿主细胞为毕赤酵母X-33，其特征在于，制备方法包括如下步骤：

（1）将含有权利要求4所述的重组载体用限制性内切酶SacI线性化；

（2）毕赤酵母X-33感受态细胞的制备；

（3）将步骤（1）线性化后的重组载体与步骤（2）获得的毕赤酵母X-33感受态细胞进行电击转化，之后涂布YPDS平板进行培养；

（4）重组菌株的PCR扩增，含有SEQ ID NO.2所示序列说明重组菌株构建成功。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述PCR扩增时所用的引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

9.一种用于表达如权利要求1所述真菌漆酶的菌株，其特征在于，所述菌株为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），其保藏编号为CGMCC No.24040。

10.如权利要求1所述的真菌漆酶、由权利要求9所述菌株表达获得的真菌漆酶在食品加工、纸浆漂白、染料脱色中的应用。