CN103275942B

CN103275942B - 一种葡萄糖氧化酶godj4a及其基因和应用

Info

Publication number: CN103275942B
Application number: CN201310115195.XA
Authority: CN
Inventors: 杨禄良; 李学军; 王海燕; 张广民
Original assignee: BEIJING CHALLENGE BIO-TECHNOLOGY Ltd Co
Current assignee: BEIJING CHALLENGE BIO-TECHNOLOGY Ltd Co
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2033-04-03
Also published as: CN103275942A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种葡萄糖酶GOD及其基因和应用。本发明提供了一种新的葡萄糖氧化酶GODJ4A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述葡萄糖氧化酶GODJ4A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的葡萄糖氧化酶GODJ4A作用pH范围广（pH3.0-6.5），最适pH5.5，最适温度45℃，在酸性条件下具有良好的稳定性和耐热性,可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产葡萄糖氧化酶。

Description

一种葡萄糖氧化酶GODJ4A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种葡萄糖氧化酶GODJ4A及其基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD,EC1.1.3.4)是一种需氧脱氢酶,在有氧条件下能专一催化β-D-葡萄糖生葡萄糖酸和过氧化氢(Bankar et al.,BiotechnologyAdvances.2009,27:489–501)，早在1950年，葡萄糖氧化酶便开始被广泛用作氧化剂（Fiedurek&Gromada，Enzyme Microb Technol1997,20:344–347），可应用于医药行业生产葡糖酸、尿糖试纸和生物感器；应用于食品工业以改善面包及面粉的品质、去除啤酒中残余的糖和氧以及低醇饮料的生产；在纺织工业中应用可用于棉浆的漂白；在饲料中应用能够改善动物肠道环境，预防牲畜胃肠道感染、腹泻，调节饲粮消化，促进动物生长等。

葡萄糖氧化酶广泛地分布在动物、植物和微生物中。规模生产葡萄糖氧化酶的主要来源于丝状真菌的黑曲霉和青霉（Bankar et al.,Biotechnology Advances.2009,27:489–501）。而天然菌株产葡萄糖氧化酶的酶活低（多在2～7U/mL）是限制其工业化生产的一个重要因素。1989年，Kriechbaum等从黑曲霉NRRL-3中克隆到葡萄糖氧化酶基因（FEBS Lett1989;255:63–66）并在酿酒酵母中进行了表达。Crognale等(Enzyme Microb Technol2006，39(6):1230–1235)利用毕赤酵母表达来源于青霉P.variabile P16.的葡萄糖氧化酶基因，在3L发酵罐中的表达量为50U/mL发酵液。

目前葡萄糖氧化酶虽然已有商品出售,但我国生产的葡萄糖氧化酶制剂纯度及活性普遍较低，稳定性较差。因此挖掘分离新的葡萄糖氧化酶、提高葡萄糖氧化酶的表达量及活力是降低其生产成本，促进葡萄糖氧化酶的关键，也是我们研究的方向。

本发明从曲霉J4中得到了一个新的葡萄糖氧化酶基因，编码的葡萄糖氧化酶在在酸性及偏中性的pH范围有高活性及稳定性、比活高、容易发酵生产等特点。所有这些优点都意味着本发明的新的葡萄糖氧化酶在饲料及食品等行业将会更有应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高活性的葡萄糖氧化酶GODJ4A。

本发明的另一目的是提供编码上述高活性的葡萄糖氧化酶的编码基因。

本发明的另一目的是提供包含上述高活性的葡萄糖氧化酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供生产上述高活性的葡萄糖氧化酶的重组菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述高活性的葡萄糖氧化酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述高活性的葡萄糖氧化酶的应用。

本发明提供了一种高活性葡萄糖氧化酶GODJ4A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

1 MKLIHHFIVP LATLAQAYTA AEQVDAQSSL LSNPNDVADK TFDYIIAGGG

51 LTGLTVAAKL TENPNIDVLV IEKGFYESNA GPIIEDPNNY GQVFGSSGDQ

101 NYLSVQQINN RTAAIVSGKG LGGSTLVNGN SWTRPDKAQI DSWEKIFGMQ

151 GWTWDSILPY MNKAERSRAP NTAEIAAGHS FDSSCHGFNG TVHAGPRDNG

201 KPWSPVMKAL MNTTSALGIP TQVDFHCGHP RGVSMIPNNL LEDQTRADTA

251 REWLLPSYTR PNLKILTGQV VGKVLFDEKN SASDPSSTSN QPRAVGVNFG

301 THRAVNFNTY AKREVLLAAG SAISPLILEY SGIGPRAVLD NANVTQIVDL

351 PVGLNMQEQT TTSVRARSAP EGFGQGQAAY FANFTEVFGE DSVRAVELLN

401 TKLDQWAEET VAQGGLHNVT ALKVQYEEYR SWLLDEDVAY AELFLDTEGN

451 IKFDIWDLIP FTRGSTHILS SDPYMWHYAN DPKLYRNELD VLGQAAATRL

501 ARKLQSSGDM AKYFAGEVTP GDQVPSDATL GQWAEYVTDV FRPNYHAIGT

551 CSMMARELGG VVDATAKVYG TQGLRVIDGS IPPTQLSSHV MTVFYGMALK

601 IAEAVLADYE KA*

该酶全长612个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为信号肽序列“MKLIHHFIVP LATLAQAYT”。

因此，成熟的葡萄糖氧化酶GODJ4A的理论分子量为64.4kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

1 AAEQVDAQSS LLSNPNDVAD KTFDYIIAGG GLTGLTVAAK LTENPNIDVL

51 VIEKGFYESN AGPIIEDPNN YGQVFGSSGD QNYLSVQQIN NRTAAIVSGK

101 GLGGSTLVNG NSWTRPDKAQ IDSWEKIFGM QGWTWDSILP YMNKAERSRA

151 PNTAEIAAGH SFDSSCHGFN GTVHAGPRDN GKPWSPVMKA LMNTTSALGI

201 PTQVDFHCGH PRGVSMIPNN LLEDQTRADT AREWLLPSYT RPNLKILTGQ

251 VVGKVLFDEK NSASDPSSTS NQPRAVGVNF GTHRAVNFNT YAKREVLLAA

301 GSAISPLILE YSGIGPRAVL DNANVTQIVD LPVGLNMQEQ TTTSVRARSA

351 PEGFGQGQAA YFANFTEVFG EDSVRAVELL NTKLDQWAEE TVAQGGLHNV

401 TALKVQYEEY RSWLLDEDVA YAELFLDTEG NIKFDIWDLI PFTRGSTHIL

451 SSDPYMWHYA NDPKLYRNEL DVLGQAAATR LARKLQSSGD MAKYFAGEVT

501 PGDQVPSDAT LGQWAEYVTD VFRPNYHAIG TCSMMARELG GVVDATAKVY

551 GTQGLRVIDG SIPPTQLSSH VMTVFYGMAL KIAEAVLADY EKA*

该葡萄糖氧化酶作用pH范围广，在pH3.0－6.5都表现出高活性，最适pH为5.5。该酶最适作用温度45℃。

本发明提供了编码上述葡萄糖氧化酶的基因godJ4A。该酶的全基因序列如SEQID NO.3所示：

1 ATGAAGCTCA TCCACCATTT TATTGTGCCA CTGGCGACCC TTGCCCAGGC TTATACCGCA

61 GCCGAGCAGG TGGACGCCCA GTCGAGTCTC CTCAGCAACC CCAACGACGT GGCCGACAAG

121 ACCTTTGACT ACATCATCGC AGGTGGTGGC TTGACAGGCC TCACCGTCGC CGCCAAACTG

181 ACGGAGAACC CTAATATCGA CGTCCTCGTC ATCGAAAAGG GATTCTACGA GTCGAACGCC

241 GGTCCCATCA TCGAGGACCC AAACAACTAC GGCCAGGTCT TTGGCAGCAG CGGTGACCAG

301 AACTACCTGA GCGTCCAGCA GATCAACAAC CGCACCGCAG CCATCGTATC CGGCAAGGGT

361 CTAGGTGGTT CGACCCTCGT CAATGGCAAC TCCTGGACTC GTCCCGACAA AGCCCAGATC

421 GATTCGTGGG AGAAGATCTT TGGAATGCAA GGCTGGACCT GGGACAGCAT CCTCCCATAC

481 ATGAACAAGG CCGAGAGATC TCGAGCACCG AATACCGCCG AGATTGCAGC CGGTCACTCC

541 TTCGACTCGT CCTGCCACGG CTTCAACGGC ACTGTCCACG CCGGACCCCG CGATAACGGC

601 AAACCCTGGT CTCCTGTCAT GAAGGCGCTC ATGAACACCA CTTCGGCACT CGGCATCCCG

661 ACCCAGGTGG ACTTTCACTG CGGACACCCG CGTGGGGTGT CCATGATCCC GAATAACCTG

721 CTGGAAGATC AGACCCGCGC GGACACGGCC CGTGAATGGC TCTTACCAAG CTATACGCGG

781 CCTAACCTGA AGATCCTCAC CGGGCAGGTC GTGGGGAAGG TTCTCTTTGA CGAAAAAAAT

841 TCAGCTTCAG ATCCATCGTC AACCTCTAAC CAGCCCAGAG CCGTGGGTGT TAATTTCGGT

901 ACCCACCGGG CCGTCAATTT TAACACGTAT GCGAAACGCG AAGTCCTGCT TGCCGCGGGG

961 TCCGCCATCT CGCCCTTGAT CCTGGAGTAC TCCGGTATCG GCCCCAGAGC CGTCCTCGAC

1021 AATGCCAATG TCACGCAGAT CGTTGATCTC CCTGTTGGTC TCAATATGCA GGAACAGACC

1081 ACGACTAGTG TGCGTGCGCG CAGTGCTCCC GAGGGCTTTG GCCAGGGCCA GGCTGCGTAC

1141 TTTGCCAACT TTACTGAAGT CTTCGGCGAG GATTCCGTGC GTGCGGTGGA GTTGCTAAAC

1201 ACGAAGCTTG ACCAGTGGGC AGAGGAGACT GTTGCCCAGG GTGGACTCCA TAATGTGACT

1261 GCGTTGAAGG TGCAGTATGA GGAGTATCGC AGTTGGTTAC TTGACGAGGA CGTCGCGTAT

1321 GCGGAATTGT TCTTGGATAC GGAGGGGAAT ATCAAATTTG ATATCTGGGA CTTGATCCCA

1381 TTTACCCGTG GCTCGACGCA TATCCTCAGC AGCGATCCAT ACATGTGGCA CTACGCGAAC

1441 GATCCAAAGC TGTACCGCAA TGAACTTGAT GTTCTCGGCC AGGCTGCTGC GACGAGACTC

1501 GCGCGGAAGT TGCAAAGCAG TGGCGATATG GCGAAATACT TCGCTGGCGA GGTTACCCCA

1561 GGTGATCAAG TACCGTCTGA TGCAACTCTG GGTCAATGGG CGGAGTATGT GACTGACGTT

1621 TTCCGTCCGA ACTATCATGC TATTGGGACG TGCTCTATGA TGGCTCGGGA GCTTGGTGGC

1681 GTTGTTGATG CGACGGCGAA GGTGTATGGA ACGCAGGGTC TACGCGTTAT TGATGGATCT

1741 ATTCCTCCTA CGCAGCTCTC ATCTCATGTT ATGACTGTCT TTTATGGGAT GGCCTTGAAG

1801 ATTGCGGAGG CTGTCCTTGC TGATTACGAG AAGGCATGA

DNA全序列分析结果表明葡萄糖氧化酶的基因godJ4A的结构基因全长1,839bp。提取曲霉Aspergillus sp.J4的总RNA，经反转录获得其CDNA，利用特异性引物克隆得到godJ4A的cDNA，结果表明该基因不含内含子序列。

其中，信号肽的碱基序列为：“ATGAAGCTCA TCCACCATTT TATTGTGCCA CTGGCGACCCTTGCCCAGGC TTATACC”，所以编码成熟葡萄糖氧化酶GODJ4A蛋白的的核苷酸序列全长1782bp，如SEQ ID NO.4所示：

1 GCAGCCGAGC AGGTGGACGC CCAGTCGAGT CTCCTCAGCA ACCCCAACGA CGTGGCCGAC

61 AAGACCTTTG ACTACATCAT CGCAGGTGGT GGCTTGACAG GCCTCACCGT CGCCGCCAAA

121 CTGACGGAGA ACCCTAATAT CGACGTCCTC GTCATCGAAA AGGGATTCTA CGAGTCGAAC

181 GCCGGTCCCA TCATCGAGGA CCCAAACAAC TACGGCCAGG TCTTTGGCAG CAGCGGTGAC

241 CAGAACTACC TGAGCGTCCA GCAGATCAAC AACCGCACCG CAGCCATCGT ATCCGGCAAG

301 GGTCTAGGTG GTTCGACCCT CGTCAATGGC AACTCCTGGA CTCGTCCCGA CAAAGCCCAG

361 ATCGATTCGT GGGAGAAGAT CTTTGGAATG CAAGGCTGGA CCTGGGACAG CATCCTCCCA

421 TACATGAACA AGGCCGAGAG ATCTCGAGCA CCGAATACCG CCGAGATTGC AGCCGGTCAC

481 TCCTTCGACT CGTCCTGCCA CGGCTTCAAC GGCACTGTCC ACGCCGGACC CCGCGATAAC

541 GGCAAACCCT GGTCTCCTGT CATGAAGGCG CTCATGAACA CCACTTCGGC ACTCGGCATC

601 CCGACCCAGG TGGACTTTCA CTGCGGACAC CCGCGTGGGG TGTCCATGAT CCCGAATAAC

661 CTGCTGGAAG ATCAGACCCG CGCGGACACG GCCCGTGAAT GGCTCTTACC AAGCTATACG

721 CGGCCTAACC TGAAGATCCT CACCGGGCAG GTCGTGGGGA AGGTTCTCTT TGACGAAAAA

781 AATTCAGCTT CAGATCCATC GTCAACCTCT AACCAGCCCA GAGCCGTGGG TGTTAATTTC

841 GGTACCCACC GGGCCGTCAA TTTTAACACG TATGCGAAAC GCGAAGTCCT GCTTGCCGCG

901 GGGTCCGCCA TCTCGCCCTT GATCCTGGAG TACTCCGGTA TCGGCCCCAG AGCCGTCCTC

961 GACAATGCCA ATGTCACGCA GATCGTTGAT CTCCCTGTTG GTCTCAATAT GCAGGAACAG

1021 ACCACGACTA GTGTGCGTGC GCGCAGTGCT CCCGAGGGCT TTGGCCAGGG CCAGGCTGCG

1081 TACTTTGCCA ACTTTACTGA AGTCTTCGGC GAGGATTCCG TGCGTGCGGT GGAGTTGCTA

1141 AACACGAAGC TTGACCAGTG GGCAGAGGAG ACTGTTGCCC AGGGTGGACT CCATAATGTG

1201 ACTGCGTTGA AGGTGCAGTA TGAGGAGTAT CGCAGTTGGT TACTTGACGA GGACGTCGCG

1261 TATGCGGAAT TGTTCTTGGA TACGGAGGGG AATATCAAAT TTGATATCTG GGACTTGATC

1321 CCATTTACCC GTGGCTCGAC GCATATCCTC AGCAGCGATC CATACATGTG GCACTACGCG

1381 AACGATCCAA AGCTGTACCG CAATGAACTT GATGTTCTCG GCCAGGCTGC TGCGACGAGA

1441 CTCGCGCGGA AGTTGCAAAG CAGTGGCGAT ATGGCGAAAT ACTTCGCTGG CGAGGTTACC

1501 CCAGGTGATC AAGTACCGTC TGATGCAACT CTGGGTCAAT GGGCGGAGTA TGTGACTGAC

1561 GTTTTCCGTC CGAACTATCA TGCTATTGGG ACGTGCTCTA TGATGGCTCG GGAGCTTGGT

1621 GGCGTTGTTG ATGCGACGGC GAAGGTGTAT GGAACGCAGG GTCTACGCGT TATTGATGGA

1681 TCTATTCCTC CTACGCAGCT CTCATCTCAT GTTATGACTG TCTTTTATGG GATGGCCTTG

1741 AAGATTGCGG AGGCTGTCCT TGCTGATTAC GAGAAGGCAT GA

本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶的基因godJ4A的重组载体，优选为pPIC9-godJ4A。将本发明的葡萄糖氧化酶的基因godJ4A插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖氧化酶的基因godJ4A插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。

本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶的基因godJ4A的重组菌株，优选为毕赤酵母重组菌株。

本发明还提供了一种制备葡萄糖氧化酶GODJ4A的方法，包括以下步骤：

1）用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶GODJ4A的表达；以及

3）回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶GODJ4A。

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或丝状真菌细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞（Pichic pastoris），得到重组菌株。

本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶GODJ4A的应用。本发明提供了一个新的葡萄糖氧化酶的基因godJ4A，其编码的葡萄糖氧化酶GODJ4A具有高比活性，作用pH范围广（pH3.0-7.0），作用温度45°C，可氧化葡萄糖，并应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产葡萄糖氧化酶。

附图说明

图1重组葡萄糖氧化酶GODJ4A的SDS-PAGE分析，M：蛋白质Marker；1：纯化的葡萄糖氧化酶。

图2葡萄糖氧化酶GODJ4A的最适pH。

图3葡萄糖氧化酶GODJ4A的pH稳定性。

图4葡萄糖氧化酶GODJ4A作用的最适温度。

图5葡萄糖氧化酶GODJ4A的热稳定性。

具体实施方式

实验材料及一般实验方法：

1、菌株及载体：大肠杆菌菌株(Escherichia coli)JM109、载体pEASY-T₃购自全式金公司；毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115及pPIC9质粒购自invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶、RNA提取试剂盒购自Promega公司；DNA提取、纯化、凝胶回收试剂盒购自天根生化公司；逆转录试剂盒购自东洋纺公司（ReverTra Ace，TOYOBO）。邻联茴香胺购自Sigma公司，辣根过氧物酶购自Amresco公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

Aspergillus sp.J4种子培养基（g/L）：葡萄糖50，KCl 0.2,KH₂PO₄ 0.15,MgSO₄·7H₂O 0.12,(NH₄)H₂PO₄ 0.6,酵母浸粉3,大豆蛋白胨2。

Aspergillus sp.J4产葡萄糖氧化酶诱导选择培养基（g/L）：葡萄糖172,玉米浆11,碳酸钙52.3,牛肉蛋白胨3.5,(NH₄)H₂PO₄ 0.5,KCl0.15,MgSO₄·7H₂O 0.125,FeSO₄·7H₂O 0.125，pH5.0。

标准的分子操作技术如DNA提取、RNA提取、反转录、凝胶电泳、大肠杆菌转化、酵母转化均使用标准技术（Sambrook等人,Molecular Cloning,A LaboratoryManual(第3版2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；invitrogen酵母操作手册)进行。

实施例1Aspergillus sp.J4菌株的基因组DNA的分离

将Aspergillus sp.J4经种子培养基培养5天后，用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，采用CTAB方法提取基因组DNA（Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版2001)），沉淀用200μl75%乙醇洗涤2次后，真空干燥，溶于TE中备用。

实施例2Aspergillus sp.J4葡萄糖氧化酶编码基因的克隆

根据真菌来源的葡萄糖氧化酶的序列保守区（GN/ME/QGWN/TWD和QYEN/EYRNW）设计合成了简并引物GODF1:GGHAABCARGGYTGGAMYTGG和GODR1：CAGTATGAGGAGTATCGCAGTTGG，其中：Y=C/T,R=A/G,M=A/C,H=A/C/T,B=G/C/T,N=A/T/G/C)。以Aspergillus sp.J4基因组DNA为模板，GODF1和GODR1为引物进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃、5min；94℃、30sec，50℃、30sec，72℃、1min，30个循环后；72℃、10min，4℃保温。琼脂糖电泳检测。得到的长约800bp的片段，经回收后与pEASY-T₃载体相连并测序。得到保守区核苷酸序列855bp。

为了得到编码基因全长序列，根据测序得到的保守区核苷酸序列，利用TAIL-PCR扩增保守区两侧的序列。TAIL-PCR特异引物序列见表1。

表1.葡萄糖氧化酶的基因godJ4A TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后与pEASY-T₃载体相连并送三博生物技术有限公司测序。将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到葡萄糖氧化酶的基因godJ4A全长。经序列分析表明，该基因DNA全长1,839bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例3从Aspergillus sp.J4分离总RNA并合成cDNA

在诱导葡萄糖氧化酶培养基中培养Aspergillus sp.J4，基于对培养基上清中葡萄糖氧化酶活力的测定，在几个时间点上通过过滤收获菌丝体并立即用液氮冷冻，用研钵研磨。并按照Promega公司RNA提取试剂盒购操作说明提取葡萄糖氧化酶的总RNA。

使用购自东洋纺公司逆转录试剂盒并按操作说明进行cDNA第一链的合成。然后设计的引物GOD F：5'-ATGAAGCTCATCCACCATTTTATTGTGCCAC-3',和GODR：5'-GTGGCACAATAAAATGGTGGATGAGCTTCAT-3'获得葡萄糖氧化酶GODJ4A的cDNA序列。扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.4所示。

编码葡萄糖氧化酶GODJ4A的基因组序列和cDNA序列分析结果表明，godJ4A的结构基因全长1,839bp，不含有内含子序列。N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列。葡萄糖氧化酶的基因godJ4A编码的成熟蛋白序列与GeneBank上的葡萄糖氧化酶序列进行比对发现，GODJ4A同Aspergillus terreus NIH2624来源假定蛋白的序列一致性最高为75.8%，与已进行功能验证的来源于Penicillium variabile P16的葡萄糖氧化酶的序列一致性为71.2%。

实施例4重组表达载体的构建与重组菌株的获得

葡萄糖氧化酶GODJ4A的cDNA编码序列（去除信号肽）通过引物GOD F-s和GODR-s（GOD F-s:5'-GTCGAATTCGCAGCCGAGCAGGTGGACGCCCAGTC-3',GODR-s:5'-ACTGCGGCCGCGTGGCACAATAAAATGGTGGATGAGC-3'，划线部分分别为EcoR I和NotⅠ酶切位点扩增获得。并通过酶切位点与表达载体pPIC9连接，获得含有编码葡萄糖氧化酶的重组质粒pPIC9-godJ4A。同样，将包含有信号肽序列的葡萄糖氧化酶GODJ4A的cDNA通过酶切、连接方法插入表达载体pPIC9中，获得含信号肽序列的编码葡萄糖氧化酶的基因的重组质粒pPIC9-godJ4A-1。

重组质粒pPIC9-godJ4A与pPIC9-godJ4A-1分别转化毕赤酵母P.pastoris GS115，转化和筛选主要操作流程参照Invitrogen公司的毕赤表达操作手册。重组质粒pPIC9-godJ4A与pPIC9-godJ4A-1分别用DraI进行线性化通过电击转化毕赤酵母P.pastorisGS115。转化细胞涂布到固体MD平板上，30℃培养至转化子长出。将在MD上生长的转化子用牙签挑取按先后顺序分别点到MM和MD平板上,30℃培养2d。

重组酵母在3mL BMGY培养基中于30℃摇床培养48h，离心收集菌体,加入1mLBMMY甲醇诱导培养基悬浮菌体，继续30℃诱导培养，48h后取样检测各菌株上清液的葡萄糖氧化酶活性，从中分别筛选出经重组质粒pPIC9-godJ4A与pPIC9-godJ4A-1转化的表达葡萄糖氧化酶的转化子。

测定上述两类转化子所产葡萄糖氧化酶的活力。经pPIC9-godJ4A转化的转化子所产重组葡萄糖氧化酶摇床水平的表达量为19U/mL，pPIC9-godJ4A-1转化的转化子所产重组葡萄糖氧化酶摇床水平的表达量与之相当。

实施例5重组葡萄糖氧化酶的活性分析

酶活性测定方法：在pH5.5，37℃条件下，加入邻联茴香胺甲醇缓冲液（0.083mg/ml）2.5mL，18%葡萄糖溶液0.3mL，辣根过氧物酶溶液(0.333mg/ml)0.1mL，置37℃恒温水浴中，恒温后向其中一管加入0.1mL蒸馏水，以空白管调零，随后向样品管中加入0.1mL适当的稀释酶液摇匀，立即在460nm波长处用1cm杯比色。读取初始吸光度值为A0并计时，反应1min时读取吸光度值为A1，得出△A=A1－A0。酶活力公式：X(U/mL)=△A₄₆₀×n/(11.3×t×0.1/3.0),其中，n为稀释倍数，t为反应时间，11.3为消光系数。在pH5.5、温度37℃的条件下，每分钟能把1.0μmol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H₂O₂所需的酶量为一个单位。

实施例6重组葡萄糖氧化酶的制备

分别从pPIC9-godJ4A与pPIC9-godJ4A-1转化阳性的重组菌株中，挑取葡萄糖氧化酶活性高重组子进行发酵表达，每24小时取样测定葡萄糖氧化酶活性，并在诱导表达120小时后收集发酵上清液用于重组葡萄糖氧化酶的纯化，进行SDS-PAGE分析（图1）。发酵120小时后，葡萄糖氧化酶的酶活达到800U/ml发酵液。在90kDa左右有一条清晰的特异表达的蛋白条带。将SDS-PAGE中的目的蛋白条带回收，送至中科院动物所经LC-ESI-MS/MS分析，得到的多肽片段与GODJ4A中的氨基酸序列完全吻合，证明纯化的蛋白确实为GODJ4A。分析GODJ4A的氨基酸序列发现有6个潜在的N糖基化位点（N-X-T/S），所以分子量偏大可能是糖基化造成的。

毕赤酵母表达的GODJ4A纯化方法如下：收集菌液的首先通过中空纤维和膜包进行脱盐和浓缩，再经阴离子交换柱层析纯化。以达到电泳纯的收集液作为表达GODJ4A酶学性质研究的样品。利用Bradford法测定纯化后酶液的蛋白质含量，计算出酶的比活为340U/mg酶蛋白。

实施例7重组葡萄糖氧化酶的性质测定

1、重组葡萄糖氧化酶的最适pH和pH稳定性的测定方法如下

经纯化的葡萄糖氧化酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0～8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液。纯化的葡萄糖氧化酶在不同pH的缓冲体系，37℃下测定的pH适性结果（图2）表明：葡萄糖氧化酶的作用pH范围广，低于pH3.0-6.5时表现出高活性，最适pH为5.5。在pH4.0到6.5之间，酶活能达到最高酶活的60%以上。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明（图3），葡萄糖氧化酶在pH范围为3.0-8.0间都很稳定。

2、重组葡萄糖氧化酶的最适温度和热稳定性的测定

最适温度的测定在pH5.5的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液体系及不同的温度（25～70℃）下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果表明，葡萄糖氧化酶的最适作用温度45℃（图4）。

测定葡萄糖氧化酶55℃和60℃下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在55℃下处理1h葡萄糖氧化酶活力没有损失，在60℃下处理30min，剩余酶活在50%（图5）。

Claims

1.一种葡萄糖氧化酶GODJ4A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种葡萄糖氧化酶基因godJ4A，其特征在于，编码权利要求1所述的葡萄糖氧化酶GODJ4A。

3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因godJ4A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示。

4.包含权利要求2或3所述葡萄糖氧化酶基因godJ4A的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-godJ4A，其中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的葡萄糖氧化酶基因godJ4A通过酶切位点与表达载体pPIC9连接，获得重组载体pPIC9-godJ4A。

6.包含权利要求2或3所述葡萄糖氧化酶基因godJ4A的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母。

8.一种制备葡萄糖氧化酶GODJ4A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶GODJ4A的表达；以及

3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶GODJ4A。

9.权利要求1所述葡萄糖氧化酶GODJ4A在饲料、酿酒、烘焙工业中的应用。