CN102978184B - 一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用。本发明提供了一种新的高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的β-葡聚糖酶R-BgluA具有高比活性，作用pH范围广(pH1.5-6.5)，并且具有良好的pH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产β-葡聚糖酶。

Description

一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA及其基因和应用。

背景技术

β-葡聚糖是一类非淀粉性多糖(NSP)，是谷物类植物细胞壁的主要成分，在大麦、燕麦、小麦、水稻胚乳细胞壁中含量尤为丰富(Buliga et al.Carbohydr Res 1986，157：139-156)。谷物胚乳细胞壁β-葡聚糖是由1200个以上吡喃型D-葡萄糖残基以β-1，4和1，3-糖苷键连接形成线型分子。β-葡聚糖独特的分子结构使其能以高分子量的形式溶于水，且溶液粘度很高，给工业生产带来诸多不便。如：高分子量的大麦β-葡聚糖可引起麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难、得率降低，啤酒非生物性浑浊，影响啤酒的稳定性和质量。β-葡聚糖在消化道中吸水膨胀黏连，使其成为限制麦类饲料营养成分有效利用的主要抗营养因子。

β-葡聚糖酶可以水解谷物中β-葡聚糖成为较小的聚合物，消除谷物类β-葡聚糖造成的负面影响，是饲料工业和啤酒行业中广泛使用的一种酶。根据酶作用底物糖苷键的类型和机制，可将β-葡聚糖酶分为β-1，3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、β-1，4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC 3.2.1.4)、β-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3.2.1.39)、β-1，3-1，4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3.2.1.73)等(McCarthy et al.Int J Biol Macromol.2003，33：141-148；Boyce and Walsh.Appl Microbiol Biotechnol.2007，76：835-8412007)。

β-葡聚糖酶广泛的存在于植物和微生物中。微生物是葡聚糖酶的重要来源，具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点。现在人们主要从细菌如枯草芽孢杆菌或真菌如黑曲霉、木霉等微生物中提取β-葡聚糖酶。而天然菌株葡聚糖酶产量较低是限制其工业化生产的一个重要因素。1983年爱尔兰学者Cantwell和McConnell首先从枯草芽孢杆菌中克隆到β-葡聚糖酶基因并建立了检测手段(Cantwell andMcConnell.gene.1983 23(2)：211-219)。随后，人们从许多其他的微生物中克隆得到了β-葡聚糖酶基因，并进行序列分析和异源表达，葡聚糖酶的表达量得到很大提高。但目前，挖掘分离高比活、性质优良的葡聚糖酶和葡聚糖酶基因，实现葡聚糖酶的高效表达，仍然是提高β-葡聚糖酶产量、降低生产成本的关键。本发明的β-葡聚糖酶作用pH范围广，在pH1.5-5.5范围内具有80％以上的酶活，并且具有良好的pH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。其具有高比活性，其比活高于目前报道的β-葡聚糖酶的比活，并在毕赤酵母中实现了高效表达，表达量高于30,000U/ml，应用于工业生产葡聚糖酶可大大降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA。

本发明的另一目的是提供编码上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶的应用。

本发明分离筛选出一种生产上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的米根霉Y-1(Rhizopus oryzae)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5132。

本发明提供了一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MLKSVITSLL VANLLFTSSA QGWVLKKNYQ GSSFFDGFSF FTDADPTHGF

VQYVDKSTAQ              60

SAGLISTQGG KVIMRADNTT VSANGRRSVR ITSNDAYSNS ALVLLDLEHM

PVGCGTWPAF             120

WMVGPNWPNS GEIDIIENVN KATLNQVTLH TKQGCSFAGV SRTQTGKTLT

DNCDVNAAGQ             180

PSNAGCGVQA TDANTYGDGL NNIKGGVYAT RMTASQGIQV WFFPRNNIPS

DISSGNPNPS            240

AWPTPLASFP FQSGHCTIDY FNNLQIVFDL TFCGDWAGSV YGSSGCPSNC

NDYVKNNPGA             300

FSNAYWSVNY VKVYQ       315

其中，该酶全长315个氨基酸和一个终止密码子，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“MLKSVITSLLVANLLFTSSA”。

因此，成熟的高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的理论分子量为31.9kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

QGWVLKKNYQ GSSFFDGFSF FTDADPTHGF VQYVDKSTAQ SAGLISTQGG

KVIMRADNTT                  60

VSANGRRSVR ITSNDAYSNS ALVLLDLEHM PVGCGTWPAF

WMVGPNWPNS GEIDIIENVN       120

KATLNQVTLH TKQGCSFAGV SRTQTGKTLT DNCDVNAAGQ

PSNAGCGVQA TDANTYGDGL       180

NNIKGGVYAT RMTASQGIQV WFFPRNNIPS DISSGNPNPS AWPTPLASFP

FQSGHCTIDY                  240

FNNLQIVFDL TFCGDWAGSV YGSSGCPSNC NDYVKNNPGA FSNAYWSVNY

VKVYQ                       295

本发明提供了编码上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶的基因R-bgluA。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaact tactgttcac ttctagcgca     60

caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatgg attcagtttc    120

tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtc aactgcacaa    180

tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccga taataccaca    240

gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgctta ttccaactct    300

gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttg gcccgctttt    360

tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atgtaagtat ttcgtgcaaa    420

ttgcctggga attaagaatt agtctaacat aattatagat tatcgaaaat gtaaacaagg    480

ctactctcaa ccaagttact ttacatacca aacaaggatg tagctttgct ggtgtttccc    540

gcacacagac tggaaagact ttgactgata actgtgacgt caatgctgct ggccaaccaa    600

gcaatgctgg ttgtggcgtt caggctacgg acgcaaacac ctatggtgat ggtttgaaca    660

acattaaggg tggcgtttat gctactagaa tgaccgcaag tcaaggtatc caagtttggt    720

tcttccctag aaacaacatc ccatctgata tctccagtgg taatcctaat ccatccgcat    780

ggccaactcc tcttgcttcc ttcccattcc aatctggcca ttgtaccatt gactacttta    840

acaaccttca aattgtattt gatttgacct tctgtggtga ttgggctggc tccgtttatg    900

gttcttctgg ttgcccttcc aactgtaatg actatgttaa gaacaaccca ggtgcattca    960

gtaacgctta ttggtctgtc aattacgtta aagtctacca gtaa                    1004

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因R-bgluA，DNA全序列分析结果表明，β-葡聚糖酶R-BgluA的结构基因全长1,004bp，含有1个内含子，403-459bp为其内含子序列，cDNA长948bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：

atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaact tactgttcac ttctagcgca     60

caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatgg attcagtttc    120

tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtc aactgcacaa    180

tctgctggct tgatctctac tcaaggagga aaggtcatca tgagagccga taataccaca    240

gttagtgcta acggcagacg ctctgtcaga attacttcca atgacgctta ttccaactct    300

gcacttgtct tgcttgacct tgaacacatg ccggtcggat gcggtacttg gcccgctttt    360

tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atattatcga aaatgtaaac    420

aaggctactc tcaaccaagt tactttacat accaaacaag gatgtagctt tgctggtgtt    480

tcccgcacac agactggaaa gactttgact gataactgtg acgtcaatgc tgctggccaa    540

ccaagcaatg ctggttgtgg cgttcaggct acggacgcaa acacctatgg tgatggtttg    600

aacaacatta agggtggcgt ttatgctact agaatgaccg caagtcaagg tatccaagtt    660

tggttcttcc ctagaaacaa catcccatct gatatctcca gtggtaatcc taatccatcc    720

gcatggccaa ctcctcttgc ttccttccca ttccaatctg gccattgtac cattgactac    780

tttaacaacc ttcaaattgt atttgatttg accttctgtg gtgattgggc tggctccgtt    840

tatggttctt ctggttgccc ttccaactgt aatgactatg ttaagaacaa cccaggtgca    900

ttcagtaacg cttattggtc tgtcaattac gttaaagtct accagtaa                 948

其中，信号肽的碱基序列为：“atgttgaaat ctgtcattac atctctgttg gtcgcaaact tactgttcacttctagcgca”。所以编码成熟的高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的核苷酸序列全长888bp，如SEQ ID NO.5所示：

caaggatggg tgttgaagaa aaattaccaa ggctctagtt tctttgatgg attcagtttc     60

tttactgatg ctgaccctac tcatggcttt gttcaatatg tagacaagtc aactgcacaa    120

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tggatggtcg gccctaactg gcccaacagc ggtgaaattg atattatcga aaatgtaaac    360

aaggctactc tcaaccaagt tactttacat accaaacaag gatgtagctt tgctggtgtt    420

tcccgcacac agactggaaa gactttgact gataactgtg acgtcaatgc tgctggccaa    480

ccaagcaatg ctggttgtgg cgttcaggct acggacgcaa acacctatgg tgatggtttg    540

aacaacatta agggtggcgt ttatgctact agaatgaccg caagtcaagg tatccaagtt    600

tggttcttcc ctagaaacaa catcccatct gatatctcca gtggtaatcc taatccatcc    660

gcatggccaa ctcctcttgc ttccttccca ttccaatctg gccattgtac cattgactac    720

tttaacaacc ttcaaattgt atttgatttg accttctgtg gtgattgggc tggctccgtt    780

tatggttctt ctggttgccc ttccaactgt aatgactatg ttaagaacaa cccaggtgca    840

ttcagtaacg cttattggtc tgtcaattac gttaaagtct accagtaa                 888

本发明还提供了包含上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的重组载体，优选为pPIC9-R-bgluA，pPIC9k-R-bgluA。将本发明的β-葡聚糖酶基因R-bgluA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-葡聚糖酶基因插入到质粒pPIC9或pPIC9k上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。

本发明还提供了包含上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因R-bgluA的重组菌株，优选为毕赤酵母重组菌株。

本发明还提供了一种制备高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组β-葡聚糖酶R-BgluA的表达；以及

3)回收并纯化所表达的β-葡聚糖酶R-BgluA。

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或丝状真菌细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)，得到重组菌株。

本发明还提供了上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的应用，优选该酶在水解β-葡聚糖以及其在饲料、食品工业领域的应用。本发明提供了一个新的β-葡聚糖酶基因R-bgluA，其编码的β-葡聚糖酶R-BgluA具有高比活性，作用pH范围广(pH 1.5-6.5)，并且具有良好的pH稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产β-葡聚糖酶。

附图说明

图1重组β-葡聚糖酶R-BgluA的SDS-PAGE分析，1：低分子量蛋白质Marker；2：毕赤酵母表达的β-葡聚糖酶R-BgluA发酵上清3：纯化的β-葡聚糖酶R-BgluA。

图2β-葡聚糖酶R-BgluA的最适pH。

图3β-葡聚糖酶R-BgluA的pH稳定性。

图4β-葡聚糖酶R-BgluA作用的最适温度。

图5β-葡聚糖酶R-BgluA的热稳定性。

本发明分离筛选出一种生产上述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的米根霉Y-1(Rhizopus oryzae)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5132。

具体实施方式

实验材料及一般实验方法：

1、菌株及载体：大肠杆菌菌株(Escherichia coli)JM109、载体pEASY-T₃购自全式金公司；毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115，pPIC9及pPIC9k质粒购自invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶购自TakaRa公司，DNA提取、纯化、凝胶回收试剂盒购自天根生化公司，RNA提取试剂盒购自Promega公司，逆转录试剂盒购自东洋纺公司(ReverTra Ace，TOYOBO)。大麦葡聚糖、羧甲基纤维素钠、燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

Rhizopus oryzae WN1产β-葡聚糖酶诱导选择培养基：0.2％MgSO₄·7H₂O，0.1％KH₂PO₄，0.1％CuSO₄·5H₂O，0.1％CaCl₂，0.5％蛋白胨，1％玉米芯粉，1％麸皮，pH5.0。

标准的分子操作技术如DNA提取、RNA提取、反转录、凝胶电泳、大肠杆菌转化、酵母转化均使用标准技术(Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第3版2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；invitrogen酵母操作手册)进行。

实施例1米根霉Rhizopus oryzae Y-1菌株的基因组DNA的分离

米曲霉Rhizopus oryzae Y-1分离于云南森林土，生长pH 5.0，最适生长温度为30℃。根据形态及ITS序列鉴定为Rhizopus属，命名为Y-1(Rhizopus oryzae)。该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5132，保藏日期：2011年8月11日。

将米曲霉Y1经马铃薯汁培养基培养后，接种于诱导培养基中(0.2％MgSO₄·7H₂O，0.1％KH₂PO₄，0.1％CuSO₄·5H₂O，0.1％CaCl₂，0.5％蛋白胨，1％玉米芯粉，1％麸皮，pH 5.0)，30℃培养3～4d，测定其产纤维素半纤维素酶的活性。经测定该菌为高产葡聚糖酶菌株。

将马铃薯汁培养基培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，采用CTAB方法提取基因组DNA(Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版2001))。

实施例2米根霉Rhizopus oryzae Y-1的β-葡聚糖酶编码基因的克隆

根据糖苷水解酶第16家族β-葡聚糖酶的保守序列(CGTWPA和FCGDWAG)设计合成了简并引物GH16F：TGCGGTAYNTGGCCNGC和GH16R：CCGGCCCANTBNCCRCARAA，其中：Y＝C/T，R＝A/G，B＝G/C/T，N＝A/T/G/C。

以Rhizopus oryzae Y-1基因组DNA为模板，GH16F和GH16R为引物进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃、5min；94℃、30sec，49℃、30sec，72℃、1min，30个循环后；72℃、10min，4℃保温。琼脂糖电泳检测。得到的长约550bp的片段，经回收后与pEASY-T₃载体相连并测序，得到保守区核苷酸序列551bp。

为了得到编码基因全长序列，根据测序得到的保守区核苷酸序列，利用TAIL-PCR扩增保守区两侧的序列。TAIL-PCR特异引物序列见表1。

表1.β-葡聚糖酶基因R-bgluA TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后与pEASY-T₃载体相连并送三博生物技术有限公司测序。将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到R-bgluA全长基因。经序列分析表明，该基因DNA全长1004bp，序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例3从Rhizopus oryzae Y-1的分离总RNA并合成cDNA

在诱导β-葡聚糖酶的条件下培养Rhizopus oryzae Y-1，基于对培养基上清中β-葡聚糖酶活力的测定，在几个时间点上通过过滤收获菌丝体并立即用液氮冷冻，用研钵研磨。并按照购自Promega公司RNA提取试剂盒操作说明提取Rhizopus oryzae Y-1的总RNA。

使用购自东洋纺公司逆转录试剂盒并按操作说明进行cDNA第一链的合成。然后通过设计的引物R-bgluA F：5′-ATGTTGAAATCTGTCATTACATCTCTGTTGGTC-3′，和R-bgluA R：5′-TTACTGGTAGACTTTAACGTAATTGACAGACC-3′获得编码β-葡聚糖酶R-BgluA的cDNA序列。扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

编码β-葡聚糖酶R-BgluA的基因组序列和cDNA序列分析结果表明，R-bgluA的结构基因全长1,004bp，含有1个内含子，403-459bp为其内含子序列，cDNA长948bp，其序列如SEQ ID NO.4所示。N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列。β-葡聚糖酶基因R-bgluA编码的成熟蛋白序列(如SEQ ID NO.5所示)与GeneBank上的葡聚糖酶序列进行同源比较发现，R-BgluA同Rhizopus oryzae来源的β-葡聚糖酶的序列一致性最高为80％，与Ajellomyces capsulatus H88来源的β-葡聚糖酶的一致性为49％。

实施例4重组表达载体的构建与重组菌株的获得

β-葡聚糖酶R-BgluA的成熟蛋白cDNA编码序列(去除信号肽序列)通过引物bgluA F-s和bgluA R-s(R-bgluA F-s：5′-ACTGAATTCCAAGGATGGGTGTTGAAGAAAAATTACCAAGG-3′，R-bgluA R-s：5′-ACTGCGGCCGCTTACTGGTAGACTTTAACGTAATTGACAGA CC-3′，划线部分分别为EcoR I和Not I酶切位点)扩增获得。并通过酶切位点与表达载体pPIC9(pPIC9k)连接，获得含有编码β-葡聚糖酶基因R-bgluA的重组质粒pPIC9-R-bgluA(pPIC9k-R-bgluA)。同样，将包含有信号肽序列的β-葡聚糖酶R-BgluA的cDNA通过酶切、连接方法插入已去除α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含信号肽序列的编码β-葡聚糖酶基因R-bgluA的重组质粒pPIC9-R-bgluA-1。

分别将重组质粒pPIC9(pPIC9k)-R-bgluA和pPIC9-R-bgluA-1转化毕赤酵母P.pastoris GS115，转化和筛选主要操作流程参照Invitrogen公司的毕赤表达操作手册。重组质粒pPIC9-R-bgluA(pPIC9k-R-bgluA)和pPIC9-R-bgluA-1用BglII进行线性化，通过电击转化毕赤酵母P.pastoris GS115。转化细胞涂布到固体MD平板上，30℃培养至转化子长出。将在MD上生长的转化子用牙签挑取按先后顺序分别点到MM和MD平板上，30℃培养2d。

重组酵母在3mL BMGY培养基中于30℃摇床培养48h，离心收集菌体，加入1mLBMMY甲醇诱导培养基悬浮菌体，继续30℃诱导培养，48h后取样检测各菌株上清液的β-葡聚糖酶活性，从中分别筛选出经重组质粒pPIC9-R-bgluA(pPIC9k-R-bgluA)和pPIC9-R-bgluA-1转化的表达β-葡聚糖酶的转化子。

测定上述两类转化子所产β-葡聚糖酶的活力，经pPIC9-R-bgluA(pPIC9k-R-bgluA)转化的转化子所产重组β-葡聚糖酶摇床水平的表达量为800U/mL，相比之下，经pPIC9-R-bgluA-1转化的转化子所产重组β-葡聚糖酶摇床水平的表达量较低。SDS-PAGE结果见图1，结果表明，重组β-葡聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。

实施例5重组β-葡聚糖酶R-BgluA的活性分析

酶活性测定方法采用DNS法。在pH 4.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物大麦葡聚糖，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例6重组β-葡聚糖酶R-BgluA的制备

分别从pPIC9-R-bgluA(pPIC9k-R-bgluA)和pPIC9-R-bgluA-1转化阳性的重组菌株中，挑取β-葡聚糖酶活性高重组子进行发酵表达，每24小时取样测定β-葡聚糖酶活性，并在诱导表达120小时后收集发酵上清液用于重组β-葡聚糖酶的纯化，进行SDS-PAGE分析(图1)。发酵120小时后，β-葡聚糖酶的酶活达到30,000U/ml发酵液。在40kDa左右有一条清晰的特异表达的蛋白条带。

毕赤酵母表达的β-葡聚糖酶纯化方法如下：收集菌液的首先通过中空纤维和膜包进行脱盐和浓缩，再经阴离子交换柱层析纯化。以达到电泳纯的收集液作为表达β-葡聚糖酶酶学性质研究的样品。利用Bradford法测定纯化后酶液的蛋白质含量，计算出酶的比活为8560U/mg。

实施例7重组β-葡聚糖酶R-BgluA的性质测定

1、重组β-葡聚糖酶的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

经纯化的β-葡聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.5的0.1mol/L的KCl-HCl缓冲液，pH 2.0～8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液和pH 9.0～12.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。纯化的β-葡聚糖酶在不同pH的缓冲体系，60℃下测定的pH适性结果(图2)表明：β-葡聚糖酶的作用pH范围广，低于pH7.0时表现出水解活性，最适pH为2.0至5.0。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，β-葡聚糖酶在pH范围为1.5-10.0间都很稳定。

2、重组β-葡聚糖酶的最适温度和热稳定性的测定

最适温度的测定在pH 4.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液体系及不同的温度(30-70℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果表明，β-葡聚糖酶的最适作用温度60-65℃(图4)。

测定β-葡聚糖酶60℃和70℃下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在60℃下处理1hβ-葡聚糖酶活力没有损失，在70℃下处理2min，剩余酶活为63％(图5)。

Claims (10)

1.一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因R-bgluA，其特征在于，编码权利要求1所述的高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA。

3.根据权利要求2所述的高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因R-bgluA，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示。

4.包含权利要求2或3所述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因R-bgluA的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-R-bgluA或pPIC9k-R-bgluA，其中，将所述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因R-bgluA插入到质粒pPIC9或pPIC9k上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组载体为pPIC9-R-bgluA或pPIC9k-R-bgluA。

6.包含权利要求2或3所述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶基因R-bgluA的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组β-葡聚糖酶R-BgluA的表达；以及

3）回收并纯化所表达的β-葡聚糖酶R-BgluA。

9.权利要求1所述高比活、宽pH范围的β-葡聚糖酶R-BgluA的应用。

10.米根霉Rhizopus oryzae Y-1，其特征在于，其保藏号为：CGMCC No.5132。

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